本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及編碼組織型纖溶酶原激活劑的dna分子，本發(fā)明還涉及包含該dna分子的載體以及其重組細(xì)胞株。

背景技術(shù)：

組織型纖溶酶原激活劑(tissue-typeplaminogenactivator，tpa)由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成并分泌的一種糖蛋白，是血液內(nèi)纖溶系統(tǒng)的生理性激活劑。在血栓形成時，能特異與血栓中的纖維蛋白結(jié)合，并與纖溶酶原形成三元復(fù)合物，在血栓處激活纖溶酶原，達(dá)到局部溶栓的效果?；谶@一特性，美國genentech公司開發(fā)了重組人tpa并于1987年上市，通用名為阿替普酶(actilyse)。作為一種高效特異的溶血栓藥，阿替普酶用于心肌梗死、腦血栓等血栓性疾病的搶救和治療。阿替普酶采用cho細(xì)胞重組表達(dá)，具有與天然tpa相同的生物學(xué)活性，對血栓中的纖維蛋白有很高的親和性，而對血液中的纖維蛋白原、凝血因子等沒有作用，這就避免了由于激活全身纖溶系統(tǒng)所帶來的潛在出血危險。重組表達(dá)的阿替普酶與天然tpa序列一致，臨床應(yīng)用不會產(chǎn)生免疫反應(yīng)等副作用。因此，療效好、安全性高、溶栓后再凝趨勢弱及便于搶救等是該藥的最大優(yōu)點。

但是，阿替普酶在血液中可以被i型纖溶酶原激活劑抑制物快速、特異地結(jié)合，從而失去溶栓活性，也可以與肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞上的特異性受體結(jié)合而被吞噬和從血液中清除。這一缺點使得其在血液中的半衰期非常短，僅3-6分鐘，這也導(dǎo)致阿替普酶臨床應(yīng)用劑量大(最大劑量達(dá)90mg)、費用昂貴。為了改變這一缺陷，主要從兩方面進行改善：一是延長半衰期，主要是通過構(gòu)建tpa的突變體，增強其活性或者降低與i型纖溶酶原激活劑抑制物及受體的親和力實現(xiàn)，如德國boehringermannheim公司開發(fā)的瑞替普酶、美國genentech公司的tnk酶、美國bristol-myerssquibb公司開發(fā)的mpa酶、日本eisai公司開發(fā)的孟替普酶等。二是優(yōu)化tpa的生產(chǎn)工藝，通過改變表達(dá)系統(tǒng)、簡化純化步驟等提高生產(chǎn)率。例如，中國發(fā)明專利cn1314490公開了在酵母菌中分泌表達(dá)人組織纖溶酶原激活劑(htpa)及其活性測定方法。在獲得htpacdna的基礎(chǔ)上，對該基因5’端加以修飾，使其正確插入ppic9載體的α因子信號肽序列下游，經(jīng)轉(zhuǎn)化構(gòu)建陽性工程菌，然而酵母菌表達(dá)系統(tǒng)的糖基化形式與哺乳動物細(xì)胞存在一定的差異，這些差異將直接影響重組蛋白的活性、穩(wěn)定性及免疫原性。

中國發(fā)明專利cn101085978公開了一種用于動物細(xì)胞灌流培養(yǎng)的過濾-沉降雙結(jié)合灌流系統(tǒng)，通過改造灌流培養(yǎng)系統(tǒng)的方式提高cho細(xì)胞密度和產(chǎn)量。中國發(fā)明專利cn101096655公開了一種采用cytopore多孔微載體培養(yǎng)法生產(chǎn)重組人組織型纖溶酶原激活劑tnk突變體的方法，將tnk-tpa基因工程cho細(xì)胞株加培養(yǎng)基重新懸浮后，使用cytopore多孔微載體培養(yǎng)tnk-tpa基因工程細(xì)胞生產(chǎn)tnk-tpa。中國發(fā)明專利cn1786161將含天然或改構(gòu)的人組織型纖溶酶原激活劑的樣品過親和層析柱，通過特異的仿生親和分離材料提高tpa的純化收率等。

以上的研究多側(cè)重于培養(yǎng)和純化工藝方面的改進，而上游工藝特別是表達(dá)細(xì)胞株的設(shè)計和優(yōu)化卻鮮有報道。然而，當(dāng)前生產(chǎn)重組tpa及其突變體的方法涉及的環(huán)節(jié)眾多，是一項復(fù)雜的系統(tǒng)工程，而對細(xì)胞株構(gòu)建的過程，如啟動子的選擇、目的基因的序列、篩選標(biāo)記的選擇等進行深入研究，將更有效地提高tpa的生產(chǎn)效率、并進一步地降低生產(chǎn)成本和使用成本。

基于此，當(dāng)前對大規(guī)模生產(chǎn)重組tpa的高效率、低成本的方法存在需求。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種編碼tpa的dna分子。本發(fā)明提供的編碼tpa的dna分子更有利于哺乳動物細(xì)胞表達(dá)，極大地提高了tpa的分泌表達(dá)效率。進一步地，本發(fā)明還提供了包含該dna分子的載體以及其重組細(xì)胞株。本發(fā)明提供的載體中引入了谷氨酰胺合成酶(glutaminesynthetase，gs)篩選加壓體系，本發(fā)明還提供了用于表達(dá)重組人tpa的cho細(xì)胞株。

一方面，本發(fā)明提供了一種編碼組織型纖溶酶原激活劑的dna分子，其核苷酸序列如seqidno:1所示。其中，本發(fā)明所述的編碼tpa的dna分子根據(jù)人tpa蛋白序列設(shè)計并優(yōu)化，所述人組織型纖溶酶原激活劑蛋白序列來源于uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(uniprotreferencesequence:p00750)，其氨基酸序列如seqidno:2所示。該氨基酸序列共編碼562個氨基酸，分子量為62.9kda，等電點為8.1。

另一方面，本發(fā)明提供了一種包含本發(fā)明的dna分子的表達(dá)載體；優(yōu)選地，本發(fā)明的表達(dá)載體為真核生物表達(dá)載體，更優(yōu)選地選自pdna、pcmv、pef系列載體，進一步優(yōu)選地為pires表達(dá)載體；

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的表達(dá)載體還包括谷氨酰胺合成酶基因。所述谷氨酰胺合成酶基因用作篩選和加壓標(biāo)記。

再一方面，本發(fā)明提供了一種用于表達(dá)組織型纖溶酶原激活劑的cho細(xì)胞株，所述細(xì)胞株包括上述dna分子或上述載體。

再一方面，本發(fā)明提供了一種優(yōu)化所述cho細(xì)胞株的方法，所述方法包括引入谷氨酰胺合成酶(glutaminesynthetase，gs)篩選加壓體系。

本發(fā)明還提供了本發(fā)明的編碼組織型纖溶酶原激活劑的優(yōu)化dna分子、包含本發(fā)明的優(yōu)化dna分子的表達(dá)載體、用于表達(dá)組織型纖溶酶原激活劑的cho細(xì)胞株在生產(chǎn)重組組織型纖溶酶原激活劑中的用途。

在本發(fā)明的一個實施例中，給出了制備本發(fā)明的用于表達(dá)組織型纖溶酶原激活劑的cho細(xì)胞株的方法，所述方法包括以下步驟：

1)按照哺乳動物細(xì)胞密碼子偏好性設(shè)計并合成編碼人組織型纖溶酶原激活劑的核苷酸序列，優(yōu)選地，所述核苷酸序列如seqidno:1所示；

2)將編碼人組織型纖溶酶原激活劑的核苷酸序列構(gòu)建進入pires表達(dá)載體，獲得pires-tpam重組質(zhì)粒。

3)將gs基因編碼序列構(gòu)建進入pires-tpam表達(dá)載體，獲得pires-tpa-gs重組質(zhì)粒。

4)將pires-tpam和pires-tpam-gs重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染cho-k1哺乳動物細(xì)胞株。

5)使用g418(geneticin，遺傳霉素)進行篩選獲得穩(wěn)定細(xì)胞株，并用msx(蛋氨酸亞氨基代砜)加壓獲得高表達(dá)的cho/pires-tpam-gs重組細(xì)胞株。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的技術(shù)方案具有以下優(yōu)點：

1)本發(fā)明的dna分子經(jīng)過優(yōu)化，避免和降低了影響轉(zhuǎn)錄和翻譯效率的諸多因素，例如密碼子偏好性、mrna高級結(jié)構(gòu)、gc含量、提前終止序列等，優(yōu)化后的序列更有利于哺乳動物細(xì)胞表達(dá)。

2)本發(fā)明的技術(shù)方案中，將gs基因克隆進入表達(dá)載體，構(gòu)建了gs加壓篩選系統(tǒng)。經(jīng)過加壓后，組織型纖溶酶原激活劑的拷貝數(shù)隨gs基因在細(xì)胞內(nèi)得到擴增，因而，目的蛋白的表達(dá)量較非擴增表達(dá)系統(tǒng)顯著增加，為大規(guī)模生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

3)本發(fā)明提供的表達(dá)組織型纖溶酶原激活劑的cho細(xì)胞株極大地提高了表達(dá)效率，從而降低了生產(chǎn)和使用成本。

附圖說明

以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實施方案，其中：

圖1為本發(fā)明的tpa編碼dna序列與天然tpa編碼dna序列的序列比對。

圖2為本發(fā)明中pires-tpam質(zhì)粒和pires-tpam-gs質(zhì)粒的構(gòu)建流程圖。

圖3為本發(fā)明中對cho/pires-tpam-gs細(xì)胞株的篩選結(jié)果。

圖4為測定本發(fā)明的細(xì)胞株培養(yǎng)液上清的活性的顯色反應(yīng)；

其中，1為未加入細(xì)胞培養(yǎng)上清的測活顯色的本底反應(yīng)；

2為cho/pires-tpa穩(wěn)定細(xì)胞株培養(yǎng)上清的測活顯色反應(yīng)；

3為cho/pires-tpam穩(wěn)定細(xì)胞株培養(yǎng)上清的測活顯色反應(yīng)；

4為cho/pires-tpam-gs穩(wěn)定細(xì)胞株培養(yǎng)上清的測活顯色反應(yīng)；

5為cho/pires-tpam-gs穩(wěn)定細(xì)胞株經(jīng)msx加壓后培養(yǎng)上清的測活顯色反應(yīng)。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明進行進一步的詳細(xì)描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。

實施例1.編碼人組織型纖溶酶原激活劑的核苷酸序列的密碼子優(yōu)化

人組織型纖溶酶原激活劑蛋白序列來源于uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫

(uniprotreferencesequence:p00750)，具體序列如下：

seqidno:2

mdamkrglccvlllcgavfvspsqeiharfrrgarsyqvicrdektqmiyqqhqswlrpvlrsnrveycwcnsgraqchsvpvkscseprcfnggtcqqalyfsdfvcqcpegfagkcceidtratcyedqgisyrgtwstaesgaectnwnssalaqkpysgrrpdairlglgnhnycrnpdrdskpwcyvfkagkyssefcstpacsegnsdcyfgngsayrgthsltesgasclpwnsmiligkvytaqnpsaqalglgkhnycrnpdgdakpwchvlknrrltweycdvpscstcglrqysqpqfrikgglfadiashpwqaaifakhrrspgerflcggilisscwilsaahcfqerfpphhltvilgrtyrvvpgeeeqkfevekyivhkefdddtydndiallqlksdssrcaqessvvrtvclppadlqlpdwtecelsgygkhealspfyserlkeahvrlypssrctsqhllnrtvtdnmlcagdtrsggpqanlhdacqgdsggplvclndgrmtlvgiiswglgcgqkdvpgvytkvtnyldwirdnmrp

按照哺乳動物細(xì)胞密碼子偏好性，同時減少序列中g(shù)c含量、避免mrna的二級結(jié)構(gòu)、去除剪切位點和終止信號等因素，獲得的優(yōu)化序列如seqidno:1所示,由南京金斯瑞公司合成并克隆至puc57載體。經(jīng)優(yōu)化的序列命名為tpam，含有該序列的puc57重組質(zhì)粒命名為puc57-tpam。

優(yōu)化后的tpa編碼dna序列與天然tpa編碼dna序列(genbank:ay221101.1)的比對如圖1所示，兩者的相似度為79％。

實施例2.重組質(zhì)粒pires-tpam的構(gòu)建

重組質(zhì)粒pires-tpam的構(gòu)建流程如圖1所示。

以puc57-tpam重組質(zhì)粒為模板，用引物f1和r1進行pcr擴增；

f1:seqidno:3atatctcgagatggacgccatgaagagggg和引物

r1:seqidno:4atatacgcgttcatggccgcatattgtccc。

反應(yīng)體系為h2o20μl，2×taqpcrmastermix(天根生化科技有限公司的kt201)25μl，10μm引物f11μl，10μm引物r11μl，puc57-tpam質(zhì)粒1μl。

擴增條件為：94℃2min；94℃30s，50℃30s，72℃30s，共35個循環(huán)；94℃5min。

擴增產(chǎn)物大小為1699bp，經(jīng)瓊脂糖凝膠回收后溶于30μl無菌水中。將擴增回收的產(chǎn)物進行酶切反應(yīng)，反應(yīng)體系為：h2o6μl，10×bufferh2μl，xhoi1μl(takara生物技術(shù)有限公司)，mlui1μl(takara生物技術(shù)有限公司)，擴增回收的產(chǎn)物10μl，反應(yīng)條件為：37℃3hr。用同樣的體系和條件酶切2μgpires表達(dá)載體。

反應(yīng)結(jié)束后回收經(jīng)酶切的基因片段和表達(dá)載體，分別溶于30μl無菌水。將表達(dá)載體和基因片段進行連接，反應(yīng)體系為：h2o4μl，10×ligationbuffer，ligase(newenglandbiolabs公司的m0202v)1μl，酶切回收的基因片段10μl，酶切回收的pires表達(dá)載體3μl。室溫放置16hrs。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞dh5a，涂布于含有氨芐青霉素25μg/ml的lb平板，37℃倒置培養(yǎng)過夜。挑取單菌落進行dna測序驗證，測序結(jié)果無誤的質(zhì)粒用于哺乳動物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。

實施例3.重組質(zhì)粒pires-tpam-gs的構(gòu)建

重組質(zhì)粒pires-tpam-gs的構(gòu)建流程如圖1所示。

以帶有g(shù)s基因編碼序列的puc57-gs重組質(zhì)粒為模板，用引物f2:seqidno:5atatggatccatggccacctcagcaagttcccact和引物r2:seqidno:6atatgtcgacttagtttttgtattggaagggctcg進行pcr擴增。反應(yīng)體系為h2o20μl，2×taqpcrmastermix(天根生化科技有限公司的kt201)25μl，10μm引物f21μl，10μm引物r21μl，puc57-gs質(zhì)粒1μl。擴增條件為：94℃2min；94℃30s，50℃30s，72℃30s，共35個循環(huán)；94℃5min。擴增產(chǎn)物大小為1142bp，經(jīng)瓊脂糖凝膠回收后溶于30μl無菌水中。將擴增回收的產(chǎn)物進行酶切反應(yīng)，反應(yīng)體系為：h2o6μl，10×bufferh2μl，bamhi1μl(takara生物技術(shù)有限公司)，sali1μl(takara生物技術(shù)有限公司)，擴增回收的產(chǎn)物10μl。反應(yīng)條件為：37℃3hr。用同樣的體系和條件酶切2μgpires-tpa表達(dá)載體。反應(yīng)結(jié)束后回收經(jīng)酶切的基因片段和表達(dá)載體，分別溶于30μl無菌水。將表達(dá)載體和基因片段進行連接，反應(yīng)體系為：h2o4μl，10×ligationbuffer，ligase(newenglandbiolabs公司的m0202v)1μl，酶切回收的基因片段10μl，酶切回收的pires-tpam表達(dá)載體3μl。室溫放置16hrs。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞dh5a，涂布于含有氨芐青霉素25μg/ml的lb平板，37℃倒置培養(yǎng)過夜。挑取單菌落進行dna測序驗證，測序結(jié)果無誤的質(zhì)粒用于哺乳動物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。

實施例4.重組質(zhì)粒pires-tpam和pires-tpam-gs的提取

將測序正確的pires-tpam和pires-tpam-gs分別接種于100ml含50μg/ml氨芐青霉素的lb液體培養(yǎng)基中，37℃、180rpm振蕩培養(yǎng)過夜。按照天根生化科技有限公司的高純度質(zhì)粒大提試劑盒(dp116-m)操作說明提取質(zhì)粒用于哺乳動物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。

實施例5.cho-k1細(xì)胞的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染

cho-k1細(xì)胞復(fù)蘇之后用cdm4mab培養(yǎng)基(hyclone公司，sh30800)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃，5％co2，120rpm/min。每3天換一次培養(yǎng)液，按1：3比例傳代。傳3代當(dāng)其存活率達(dá)到95％時，進行轉(zhuǎn)染。

利用默克密理博的novachoice轉(zhuǎn)染試劑盒(72622-3)，按照說明書進行轉(zhuǎn)染。具體地，取pires-tpam和pires-tpam-gs各20μl，分別與2ml的培養(yǎng)基、20μl的轉(zhuǎn)染試劑、10μl的轉(zhuǎn)染稀釋液混合，室溫孵育30分鐘。將混勻的轉(zhuǎn)染試劑分別加入20ml培養(yǎng)的細(xì)胞中，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48h后加入g418至終濃度800μg/ml，每3天換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)兩周后獲得穩(wěn)定cho/pires-tpam和cho/pires-tpam-gs細(xì)胞株，分別收集細(xì)胞培養(yǎng)上清進行活性檢測。

實施例6.cho/pires-tpam-gs細(xì)胞的加壓和篩選

取存活率達(dá)到95％的cho/pires-tpam-gs細(xì)胞，將培養(yǎng)基更換為無谷氨酰胺的cdm4mab培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃，5％co2，120rpm/min。每3天換一次培養(yǎng)液，傳2代后加入msx至終濃度25μm，每3天換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)兩周收集細(xì)胞培養(yǎng)上清進行活性檢測。

用有限稀釋法篩選cho/pires-tpam-gs細(xì)胞株。具體的，將濃度為1×10⁶個/ml的cho/pires-tpam-gs的細(xì)胞，用cdm4mab培養(yǎng)基稀釋至2-4個細(xì)胞/200μl，按照200μl/孔的量鋪于96孔深孔板，于37℃，5％co2，120rpm/min條件下進行培養(yǎng)，至細(xì)胞密度達(dá)到0.5×10⁵個/ml時轉(zhuǎn)移至24孔板進行培養(yǎng)，培養(yǎng)3天后取上清分別測定活性。

實施例7.對照cho/pires-tpa細(xì)胞株的構(gòu)建和培養(yǎng)

提取pires-tpa質(zhì)粒，其中，帶有天然tpa編碼dna序列(序列同genbank:ay221101.1)。轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞cho-k1獲得含有未優(yōu)化表達(dá)序列的cho/pires-tpa重組細(xì)胞株，收集培養(yǎng)上清進行活性檢測。質(zhì)粒提取方法同實施例4，細(xì)胞轉(zhuǎn)染和培養(yǎng)方法同實施例5。

實施例8.組織型纖溶酶原激活劑活性檢測

取細(xì)胞培養(yǎng)上清50μl、55u/ml纖溶酶原(abacm公司，gr299758)10μl、10mg/ml牛纖維蛋白原(索萊寶生物技術(shù)有限公司，622c061)50μl、1u/ml牛凝血酶(索萊寶生物技術(shù)有限公司，522a0214)50μl混合，于37℃溫育10min。加入5mg/mls-2403發(fā)色底物(上海冠東生物科技有限公司)40μl混勻，于37℃溫育60min。加入20μl的1.25m醋酸終止劑，測定405nm波長下的吸光度值。取不同濃度的(2-10u)組織型纖溶酶原激活劑標(biāo)準(zhǔn)品(abacm公司，ab92633)，按照上述操作反應(yīng)，繪制活性-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算細(xì)胞上清中組織型纖溶酶原激活劑的活性，結(jié)果如表1和圖3所示，含有優(yōu)化基因序列的cho/pires-tpam穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞庫的培養(yǎng)上清中tpa的活性是cho/pires-tpa穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞庫的4倍。經(jīng)有限稀釋法共篩選了cho/pires-tpam-gs細(xì)胞株149株，活性呈正態(tài)分布，其中最高一株克隆1c1的表達(dá)量達(dá)373iu/ml。

以上對本發(fā)明具體實施方式的描述并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明作出各種改變或變形，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的范圍。

序列表

<110>江蘇康禾生物制藥有限公司

<120>編碼組織型纖溶酶原激活劑的dna分子及其重組細(xì)胞株

<130>dic17110009

<160>6

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1689

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>編碼tpa的優(yōu)化dna分子

<400>1

atggacgccatgaagaggggcctgtgctgcgtgctgctgctgtgcggcgccgtgttcgtg60

agccccagccaggagatccacgccaggttcaggaggggcgccaggagctaccaggtcatc120

tgcagagacgagaagacccagatgatctatcagcagcaccagtcctggctgcgccctgtg180

ctgagaagcaaccgcgtggagtactgctggtgtaattctggcagggcccagtgtcattcc240

gtgcctgtgaagtcttgctccgagccacggtgtttcaacggcggcacatgccagcaggct300

ctgtatttctccgatttcgtgtgccagtgtcctgagggctttgccggcaagtgctgtgag360

atcgataccagggctacatgttacgaggaccagggcatcagctataggggcacctggtct420

acagctgagtccggagctgagtgcaccaactggaactcctccgccctggctcagaagcct480

tactctggcaggcggccagatgctatcaggctgggactgggcaaccacaattattgtaga540

aatcccgatcgcgactctaagccttggtgctacgtgttcaaggccggcaagtattcttcc600

gagttttgctccaccccagcttgtagcgagggcaactctgactgttactttggcaatggc660

agcgcctatagaggcacccattctctgacagagtccggcgctagctgcctgccatggaac720

tctatgatcctgatcggcaaggtgtacacagctcagaatccatccgcccaggctctggga780

ctgggcaagcacaactattgtcgcaatccagatggcgacgctaagccctggtgccatgtg840

ctgaagaacagacgcctgacctgggagtactgcgatgtgcccagctgctctacatgtggc900

ctgaggcagtattctcagcctcagttccggatcaagggcggcctgtttgccgacatcgct960

agccacccatggcaggccgctatcttcgccaagcataggcggtctcccggcgagaggttt1020

ctgtgcggcggcatcctgatcagctcttgttggattctgtccgccgctcactgcttccag1080

gagcggtttccccctcaccatctgaccgtgatcctgggcaggacataccgggtggtgcca1140

ggcgaggaggagcagaagttcgaggtggagaagtacatcgtgcataaggagtttgacgat1200

gacacctatgataacgacatcgccctgctgcagctgaagagcgactccagcagatgtgct1260

caggagtcttccgtggtgcgcaccgtgtgcctgccaccagccgatctgcagctgccagac1320

tggacagagtgtgagctgtccggatacggcaagcacgaggccctgtcccctttctatagc1380

gagaggctgaaggaggctcacgtgagactgtacccaagctctcgctgtaccagccagcat1440

ctgctgaacagaaccgtgacagataatatgctgtgcgctggcgacacacgctccggagga1500

ccacaggctaacctgcatgatgcttgtcagggcgacagcggaggacctctggtgtgcctg1560

aatgatggccggatgaccctggtgggcatcatctcttggggactgggatgcggacagaag1620

gacgtgcctggcgtgtacaccaaggtgacaaactatctggattggatcagggacaatatg1680

cggccatga1689

<210>2

<211>562

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>tpa的氨基酸序列

<400>2

metaspalametlysargglyleucyscysvalleuleuleucysgly

151015

alavalphevalserproserglngluilehisalaargpheargarg

202530

glyalaargsertyrglnvalilecysargaspglulysthrglnmet

354045

iletyrglnglnhisglnsertrpleuargprovalleuargserasn

505560

argvalglutyrcystrpcysasnserglyargalaglncyshisser

65707580

valprovallyssercyssergluproargcyspheasnglyglythr

859095

cysglnglnalaleutyrpheseraspphevalcysglncysproglu

100105110

glyphealaglylyscyscysgluileaspthrargalathrcystyr

115120125

gluaspglnglyilesertyrargglythrtrpserthralagluser

130135140

glyalaglucysthrasntrpasnserseralaleualaglnlyspro

145150155160

tyrserglyargargproaspalaileargleuglyleuglyasnhis

165170175

asntyrcysargasnproaspargaspserlysprotrpcystyrval

180185190

phelysalaglylystyrsersergluphecysserthrproalacys

195200205

sergluglyasnseraspcystyrpheglyasnglyseralatyrarg

210215220

glythrhisserleuthrgluserglyalasercysleuprotrpasn

225230235240

sermetileleuileglylysvaltyrthralaglnasnproserala

245250255

glnalaleuglyleuglylyshisasntyrcysargasnproaspgly

260265270

aspalalysprotrpcyshisvalleulysasnargargleuthrtrp

275280285

glutyrcysaspvalprosercysserthrcysglyleuargglntyr

290295300

serglnproglnpheargilelysglyglyleuphealaaspileala

305310315320

serhisprotrpglnalaalailephealalyshisargargserpro

325330335

glygluargpheleucysglyglyileleuilesersercystrpile

340345350

leuseralaalahiscyspheglngluargpheproprohishisleu

355360365

thrvalileleuglyargthrtyrargvalvalproglyglugluglu

370375380

glnlysphegluvalglulystyrilevalhislysglupheaspasp

385390395400

aspthrtyraspasnaspilealaleuleuglnleulysseraspser

405410415

serargcysalaglngluserservalvalargthrvalcysleupro

420425430

proalaaspleuglnleuproasptrpthrglucysgluleusergly

435440445

tyrglylyshisglualaleuserprophetyrsergluargleulys

450455460

glualahisvalargleutyrproserserargcysthrserglnhis

465470475480

leuleuasnargthrvalthraspasnmetleucysalaglyaspthr

485490495

argserglyglyproglnalaasnleuhisaspalacysglnglyasp

500505510

serglyglyproleuvalcysleuasnaspglyargmetthrleuval

515520525

glyileilesertrpglyleuglycysglyglnlysaspvalprogly

530535540

valtyrthrlysvalthrasntyrleuasptrpileargaspasnmet

545550555560

argpro

<210>3

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物f1

<400>3

atatctcgagatggacgccatgaagagggg30

<210>4

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物r1

<400>4

atatacgcgttcatggccgcatattgtccc30

<210>5

<211>35

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物f2

<400>5

atatggatccatggccacctcagcaagttcccact35

<210>6

<211>35

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物r2

<400>6

atatgtcgacttagtttttgtattggaagggctcg35