本發(fā)明涉及腦動(dòng)靜脈畸形的輔助診斷
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種輔助診斷腦動(dòng)靜脈畸形的檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用，尤其指一種能用于檢測(cè)與腦動(dòng)靜脈畸形相關(guān)的cdkn2a基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度的試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：腦動(dòng)靜脈畸形(brainarteriovenousmalformation,bavm)是指腦部動(dòng)、靜脈異常擴(kuò)張導(dǎo)致腦內(nèi)血流動(dòng)力學(xué)上的紊亂，形成混亂的血管團(tuán)；bavm是一種先天性疾病，主要是由于胚胎發(fā)育過(guò)程中腦血管形成發(fā)生變異所致，畸形血管團(tuán)可伴隨人體發(fā)育而不斷增長(zhǎng)，通過(guò)壓迫、刺激、分流血供或出血，損害周圍神經(jīng)組織，引起各種神經(jīng)功能異常甚至危及生命。bavm發(fā)病率約0.5%，多見于20-40歲青壯年；患者平均年齡31.2歲，其中55%為男性。bavm最常見且嚴(yán)重的臨床癥狀是因畸形血管破裂而導(dǎo)致的腦出血，出血率為1.3–3.9%?；窝芤坏┢屏殉鲅粌H會(huì)給患者造成生命威脅，而且有較大可能留下不同程度的殘疾和后遺癥。因患者多為青年人，bavm不僅使其喪失工作能力，也影響到生活自理能力，給家庭和社會(huì)造成沉重的負(fù)擔(dān)。因此，對(duì)于bavm的早期診斷、及時(shí)治療勢(shì)在必行，具有重要的臨床意義。bavm是腦血管畸形中最為常見的一種疾病，主要表現(xiàn)為顱內(nèi)血管形態(tài)畸變，并且在部分區(qū)域異常增多；然而，關(guān)于bavm發(fā)病機(jī)制還不十分清楚，有假設(shè)認(rèn)為bavm的發(fā)病機(jī)理與遺傳、營(yíng)養(yǎng)、生活習(xí)慣、環(huán)境等諸多因素相關(guān)。目前較為成熟的理論認(rèn)為bavm的發(fā)生、形成是一個(gè)多基因、多生物因子共同作用的結(jié)果，先天因素和后天因素可能共同參與這個(gè)過(guò)程，因而許多學(xué)者都逐漸傾向于bavm基因和生物因子方面的研究。細(xì)胞周期依賴性激酶抑因子2a(cyclin-dependentkinaseinhibitor2a，cdkn2a)，定位于染色體9p21.3(hg38:chr9:21,967,751-21,995,042)，是p15/cdkn2a-p16/cdkn2a-p14/arf基因簇組分之一。其參與了細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞衰老、細(xì)胞調(diào)亡等多種重要生理過(guò)程?，F(xiàn)有研究證明cdkn2a基因是最強(qiáng)的心腦血管疾病的遺傳易感基因，并且與多種癌癥，顱內(nèi)動(dòng)脈瘤，2型糖尿病等相關(guān)。cdkn2a在人類血管內(nèi)皮細(xì)胞，微血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、冠狀血管平滑肌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞,以及手術(shù)切除的頸動(dòng)脈內(nèi)膜和腹主動(dòng)脈瘤中血管上皮組織都有著不同的表達(dá)量，并且不同的表達(dá)量也預(yù)示著不同的功能。研究證明在心血管病患者中，cdkn2a的表達(dá)量與不同的基因型有關(guān)，并且其受到相關(guān)基因多態(tài)性的調(diào)節(jié)，同時(shí)也與動(dòng)脈血管病變的嚴(yán)重程度相關(guān)。目前關(guān)于cdkn2a基因單核苷酸多態(tài)性與腦血管病相關(guān)的研究已較成熟，且已成為公認(rèn)的腦血管病易感基因位點(diǎn)；目前已發(fā)現(xiàn)多種腫瘤組織中存在著cdkn2a基因表達(dá)降低和啟動(dòng)子高甲基化，但其啟動(dòng)子甲基化水平與腦動(dòng)靜脈畸形的關(guān)系目前還處在研究階段。目前，國(guó)內(nèi)外還沒有公開任何關(guān)于用于檢測(cè)與腦動(dòng)靜脈畸形相關(guān)的cdkn2a基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度的試劑盒相關(guān)研究報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的現(xiàn)狀，提供檢測(cè)效率高，針對(duì)性強(qiáng)的一種輔助診斷腦動(dòng)靜脈畸形的檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用，其中cdkn2a基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平與腦動(dòng)靜脈畸形的患病率呈正相關(guān)。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為：一種輔助診斷腦動(dòng)靜脈畸形的檢測(cè)試劑盒，所述的檢測(cè)試劑盒內(nèi)包括一對(duì)cdkn2a基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化特異性擴(kuò)增引物及一個(gè)甲基化特異性測(cè)序引物：甲基化特異性上游引物的核苷酸序列：5’-gttggaaaatgaatgttttgagttt-3’；甲基化特異性下游引物的核苷酸序列：5’-biotin-acccctaaacctaactaaaaaactaaacc-3’；甲基化特異性測(cè)序引物的核苷酸序列：5’-ggttattgtttttggtgt-3’。一種輔助診斷腦動(dòng)靜脈畸形的檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用，所述的檢測(cè)試劑盒能用于腦動(dòng)靜脈畸形輔助診斷、檢測(cè)或篩查藥物。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明首次公開了用于檢測(cè)與腦動(dòng)靜脈畸形相關(guān)的cdkn2a基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度的試劑盒及其應(yīng)用，cdkn2a基因啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化水平導(dǎo)致cdkn2a基因的低表達(dá)，使細(xì)胞周期抑制作用減弱，從而血管平滑肌細(xì)胞增殖不受控制，從而引起腦部動(dòng)靜脈血管的紊亂引發(fā)疾病，因此，cdkn2a基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平與腦動(dòng)靜脈畸形的患病率呈正相關(guān)。以檢測(cè)cdkn2a基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平為基礎(chǔ)的檢測(cè)試劑盒可以方便快捷地在分子水平上實(shí)現(xiàn)對(duì)腦動(dòng)靜脈畸形的檢測(cè)，檢測(cè)效率高，針對(duì)性強(qiáng)，同時(shí)，以cdkn2a基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化為靶點(diǎn)的藥物有望成為腦動(dòng)靜脈畸形輔助診斷、檢測(cè)和篩選的一種新手段。附圖說(shuō)明圖1為被檢測(cè)序列所在區(qū)域(具體位置為hg38,chr9:21970915-21971191)，以及所檢測(cè)的8個(gè)cpg位點(diǎn)之間的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果(例如cpg1與cpg2的相關(guān)系數(shù)為0.957，cpg2與cpg3的相關(guān)系數(shù)為0.872，cpg3與cpg4的相關(guān)系數(shù)為0.946)；圖2為甲基化水平檢測(cè)結(jié)果示例(圖中所示百分?jǐn)?shù)為對(duì)應(yīng)cpg位點(diǎn)的甲基化程度，如圖示有cpg1到cpg8的甲基化程度分別為21%，30%，18%，22%，29%，18%，26%，17%。具體實(shí)施方式以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。一種輔助診斷腦動(dòng)靜脈畸形的檢測(cè)試劑盒，所述的檢測(cè)試劑盒內(nèi)包括一對(duì)cdkn2a基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化特異性擴(kuò)增引物及一個(gè)甲基化特異性測(cè)序引物：甲基化特異性上游引物的核苷酸序列：5’-gttggaaaatgaatgttttgagttt-3’；甲基化特異性下游引物的核苷酸序列：5’-biotin-acccctaaacctaactaaaaaactaaacc-3’；甲基化特異性測(cè)序引物的核苷酸序列：5’-ggttattgtttttggtgt-3’。一種輔助診斷腦動(dòng)靜脈畸形的檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用，所述的檢測(cè)試劑盒能用于腦動(dòng)靜脈畸形輔助診斷、檢測(cè)或篩查藥物。1、研究對(duì)象的收集募集愿意參加研究的志愿者，根據(jù)腦動(dòng)靜脈畸形的國(guó)際診斷標(biāo)準(zhǔn)，將志愿者分為病例組和對(duì)照組，并采用調(diào)查表的形式調(diào)查志愿者的一般情況，同時(shí)采取靜脈血，進(jìn)行一般血生化檢測(cè)，具體如下：從某醫(yī)院神經(jīng)外科住院部收集經(jīng)磁共振成像和血管造影術(shù)證實(shí)的腦動(dòng)靜脈畸形患者22例(11男；11女)，同時(shí)收集性別匹配、年齡相仿的經(jīng)ct證實(shí)沒有腦血管病和其他心血管病歷史的26名正常人作為對(duì)照組((13男；13女)。所有參與研究的對(duì)象均排除心源性休克、重度心力衰竭、嚴(yán)重室性心律失常、伴有其他嚴(yán)重疾病如惡性腫瘤、嚴(yán)重肝腎疾病等。記錄所有研究對(duì)象空腹抽血檢測(cè)血脂、血糖等一般生化指標(biāo)，同時(shí)抽取靜脈血3ml入edta抗凝管中，-80℃低溫儲(chǔ)存，以備用于標(biāo)本統(tǒng)一提取基因組dna。2、基因組dna的提取應(yīng)用lab-aid820全自動(dòng)核酸提取儀(中國(guó)廈門，致善生物科技)提取上述步驟得到的樣本的全血基因組dna，再通過(guò)核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)所得dna的濃度，以供cdkn2a基因啟動(dòng)子區(qū)dna甲基化水平的檢測(cè)。3、dna甲基化水平測(cè)定本研究采用焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)cdkn2a基因啟動(dòng)子區(qū)(hg38,chr9:21970915-21971191)的8個(gè)cpg位點(diǎn)(如圖1)進(jìn)行了dna甲基化水平分析。此技術(shù)的基本原理：用重亞硫酸鹽處理dna樣品后，再應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)擴(kuò)增，可使發(fā)生甲基化的胞嘧啶(c)堿基保持不變，而使未發(fā)生甲基化的c轉(zhuǎn)變成了尿嘧啶(u)，然后通過(guò)測(cè)序引物進(jìn)行pcr測(cè)序，從而得到哪個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了甲基化。本次研究采用pyromarkassaydesign軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，用于實(shí)驗(yàn)的pcr擴(kuò)增引物和測(cè)序引物如下：(1)甲基化特異性上游引物(forwardprimer)5’-gttggaaaatgaatgttttgagttt-3’(seqidno.1)；(2)甲基化特異性下游引物(reverseprimer)5’-biotin-acccctaaacctaactaaaaaactaaacc-3’，(seqidno.2)；(3)甲基化特異性測(cè)序引物(sequencingprimer)5’-ggttattgtttttggtgt-3’(seqidno.3)。具體實(shí)驗(yàn)步驟：步驟a.采用qiagenepitect?亞硫酸氫鹽處理試劑盒(epitechbisulfitekits;qiagen;#59104)對(duì)樣本dna進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化。步驟b．取步驟a中轉(zhuǎn)化過(guò)的dna樣本20ng加入到pyromarkpcr試劑盒(pyromarkpcrkit;qiagen;#978703)，并加入上述一對(duì)cdkn2a基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化特異性擴(kuò)增引物，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：首先95℃15min的變性；接著95℃15s，tm30s，72℃20s，共50個(gè)循環(huán)的退火反應(yīng)；然后延伸反應(yīng)72℃5min。(注：tm在實(shí)驗(yàn)中根據(jù)跑pcr梯度溫度確定)步驟c.焦磷酸測(cè)序的前期準(zhǔn)備：在psq96板中預(yù)先加入45μl含有0.3μm上述甲基化特異性測(cè)序引物的退火緩沖液(pyromarkannealingbuffer;qiagen;#979009)；將需要使用的混勻的瓊脂糖珠總量(每樣本3μl)轉(zhuǎn)移到一個(gè)eppendorf管中；在瓊脂糖珠中加入結(jié)合緩沖液(pyromarkbindingbuffer;qiagen;#979006)，使得平均每個(gè)樣品約有50μl的體積，將混合物混勻；將以上混合物加入pcr產(chǎn)物(50μl反應(yīng)體積)中，每樣本50μl；將pcr產(chǎn)物在常溫下混勻10分鐘，使得磁珠與生物素結(jié)合；在真空預(yù)備工作站中，四個(gè)樣品板中依次加入180ml的高純水、70％乙醇、洗滌緩沖液(pyromarkwashbuffer;qiagen;#979008)和120ml的變性緩沖液(pyromarkdenaturationsolution;qiagen;#979007)；打開真空預(yù)備工作站的泵，將真空準(zhǔn)備工具在高純水中清洗30秒；然后將真空準(zhǔn)備工具(pyromarkvacuumprepfilterprobes;qiagen;#979010)移到pcr板中，抓取瓊脂糖珠(在磁珠與pcr產(chǎn)物結(jié)合后三分鐘內(nèi)完成此操作)；拿起pcr板，檢查是否大部分磁珠都被吸附在了真空準(zhǔn)備工具上；將真空準(zhǔn)備工具放入70％乙醇中5秒；然后移到變性緩沖液中5秒；再移到洗滌緩沖液中清洗5－10秒；關(guān)掉泵；將真空準(zhǔn)備工具放入含有測(cè)序引物的板中，搖動(dòng)，釋放瓊脂糖珠(測(cè)序引物也可最后加入)；使用高純水清洗真空準(zhǔn)備工具；將放有樣品的psq96板放在加熱板上加熱到80℃2分鐘，再冷卻到室溫，即可進(jìn)行焦磷酸測(cè)序反應(yīng)。步驟d.焦磷酸測(cè)序：在pyromarkq24焦磷酸測(cè)序儀上，采用pyromarkgoldq24試劑盒(pyromarkgoldq24reagents;qiagen;#978802)對(duì)步驟c中的psq96板中的樣本進(jìn)行測(cè)序，然后應(yīng)用pyromarkcpg軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行甲基化分析(甲基化水平檢測(cè)結(jié)果見圖2)。4、數(shù)據(jù)分析本次研究采用spss16.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，我們發(fā)現(xiàn)：被檢測(cè)的8個(gè)cpg位點(diǎn)間存在顯著關(guān)聯(lián)(相關(guān)系數(shù)r>0.813，p<0.0001，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1)(注：p<0.05時(shí)表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，下同)，所以后期我們對(duì)8個(gè)cpg甲基化位點(diǎn)甲基化水平進(jìn)行比較。首先，我們發(fā)現(xiàn)腦動(dòng)靜脈畸形患者中cdkn2a基因啟動(dòng)子區(qū)cpg1-5，cpg7,和cpg8甲基化水平均高于正常人組(見表1，p<0.038)。此外，我們也發(fā)現(xiàn)在男性患者中cdkn2a基因啟動(dòng)子區(qū)cpg1和cpg5也是顯著增高(見表2，p<0.029)，而在女性患者中cdkn2a基因啟動(dòng)子區(qū)的8個(gè)cpg位點(diǎn)均沒有顯著差異。本發(fā)明輔助診斷腦動(dòng)靜脈畸形的檢測(cè)試劑盒具有準(zhǔn)確可靠、靈活快速和經(jīng)濟(jì)節(jié)約的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明采用上述試劑盒對(duì)cdkn2a基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平進(jìn)行檢測(cè)，能夠快速、可靠地為腦動(dòng)靜脈畸形的輔助診斷、檢測(cè)或篩查藥物提供借鑒。表1病例對(duì)照組間dna甲基化的分析(n=48)characteravm(n=22)control(n=26)p值age47.77±12.6549.12±12.520.676man(n)11131cpg118.05±4.2514.48±4.100.005cpg228.14±5.6524.58±5.790.038cpg318.14±3.6715.39±4.520.028cpg421.39±4.2618.30±4.890.025cpg527.88±5.2823.47±6.060.011cpg618.35±3.4417.07±4.030.251cpg725.25±4.4921.75±5.230.018cpg816.16±2.8713.80±3.600.017mean21.67±4.1318.61±4.570.020表2性別分層后對(duì)病例組和對(duì)照組甲基化程度的分析(n=48)注：表1和表2中，n為樣本數(shù)量；表格數(shù)據(jù)中，p值小于0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本發(fā)明的最佳實(shí)施例已被闡明，由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員做出的各種變化或改型都不會(huì)脫離本發(fā)明的范圍。sequencelisting<110>寧波市第一醫(yī)院<120>一種輔助診斷腦動(dòng)靜脈畸形的檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用<130><160>3<170>patentinversion3.3<210>1<211>25<212>dna<213>人工序列<400>1gttggaaaatgaatgttttgagttt25<210>2<211>29<212>dna<213>人工序列<400>2biotin-acccctaaacctaactaaaaaactaaacc29<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列<400>3ggttattgtttttggtgt18當(dāng)前第1頁(yè)12