技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提高m⁶a抗體富集甲基化mrna產(chǎn)量的方法。

技術(shù)背景：

信使rna(mrna)是聯(lián)系dna與蛋白質(zhì)的核心分子，其參與的遺傳信息傳遞過程是生命的核心進程。雖然mrna的修飾在20世紀70年代就已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，但是由于mrna本身的特性和技術(shù)的限制，使得mrna的修飾研究進展較為緩慢。隨著m⁶a-seq、merip、miclip、m¹a-seq、m¹a-id-seq、aza-ip、hmerip-seq、ψ-seq、ceu-seq和ribometh-seq等一系列技術(shù)的產(chǎn)生，轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)mrna分子的m⁶a、m¹a、m⁵c、5hmc、假尿嘧啶修飾和2'-o-甲基化等修飾位點信息被揭示。近兩年來，mrna修飾研究出現(xiàn)了井噴式的發(fā)展，尤其是m⁶a(6-甲基腺嘌呤),成為了rna生物學(xué)研究的一個新興領(lǐng)域。

m⁶a修飾是廣泛存在于真核高等生物的rna上，特別是在mrna上，該修飾主要存在于mrna是cds區(qū)的3’-utr區(qū)，特別是終止密碼子附近區(qū)域，其廣泛參與了rna代謝的各種生物學(xué)過程，包括rna剪接、rna出核、rna與蛋白互相作用和rna降解。哺乳動物體內(nèi)m⁶a甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物中有一部分成分已被解析，主要有mettl3(me-thyltransferase-likeprotein3)、mettl14(methyltransferase-likeprotein14)和wtap(wilmstumor1-associatingprotein)。m⁶a去甲基酶肥胖蛋白fto(fatmassandobesityassociatedprotein)和alkbh5(alkbhomolog5)依賴α-酮戊二酸(α-ketoglutaricacid,α-kg)和fe(ⅱ)對m⁶a進行氧化去甲基化反應(yīng)。m⁶a在生物體內(nèi)由m⁶a結(jié)合蛋白識別，并介導(dǎo)其行使功能。目前發(fā)現(xiàn)的m⁶a結(jié)合蛋白有yth結(jié)構(gòu)域蛋白ythdf1(ythdomain-containingfamilyprotein1)、ythdf2(ythdomain-containingfamilyprotein2)、ythdc1(ythdomain-containingprotein1)和核內(nèi)hnrnpa2b1(heterogeneousnuclearribonucleoproteinsa2b1)。

m⁶a作為一個新穎的rna表觀遺傳修飾對于基因表達等基礎(chǔ)生命進程發(fā)揮著重要作用，包括調(diào)控生物節(jié)律、減數(shù)分裂和胚胎干細胞增殖等。dominissini等發(fā)現(xiàn)，沉默m6a甲基轉(zhuǎn)移酶可以顯著影響基因表達水平和選擇性剪接模式，從而影響p53信號通路和細胞凋亡。meyer等發(fā)現(xiàn)，m⁶a修飾呈現(xiàn)組織特異性調(diào)控，其在腦的發(fā)育過程中會顯著增加。此外，他們還發(fā)現(xiàn)有67％的3'-utr存在m⁶a修飾，而這些3'-utr同時會有至少一個targetscan預(yù)測的microrna結(jié)合位點，并且這些m⁶a修飾位點大都在microrna結(jié)合位點的上游。在腦組織的進一步實驗顯示，那些表達量較高的microrna的靶標也會有較高的m⁶a修飾水平，這暗示microrna水平可能調(diào)控著其靶標轉(zhuǎn)錄本的m⁶a水平。batista等的研究表明，m⁶a可以促使干細胞從自我更新狀態(tài)轉(zhuǎn)向細胞分化。2015年，geula等關(guān)于m⁶a修飾對胚胎干細胞多能性調(diào)控作用的研究表明，m⁶a能夠通過影響促多能性基因的mrna水平與穩(wěn)定性，對escs的多能性進行調(diào)控。

近幾年，m⁶amrna甲基化修飾研究工作取得很大的進展，但仍存在許多挑戰(zhàn)。技術(shù)的限制是mrna修飾研究的較大挑戰(zhàn)之一。目前，m⁶a-seq和merip是研究m⁶arna甲基化修飾的重要手段和技術(shù)之一。merip-seq技術(shù)將甲基化dna免疫共沉淀技術(shù)、rna結(jié)合蛋白免疫共沉淀(rnaimmunoprecipitation,rip)技術(shù)和rna測序(rnasequencing,rna-seq)技術(shù)組合起來，高精度地檢測全基因組(或全轉(zhuǎn)錄組)范圍內(nèi)的rna甲基化。merip-seq技術(shù)采用免疫共沉淀方法，即甲基化rna特異性抗體與被隨機打斷的rna片段進行孵育，抓取有甲基化修飾的片段進行測序；同時需要平行測序一個對照(control)樣本，對照樣本用于消除抓取帶有甲基化片段過程中的背景。然后將免疫共沉淀(ip)樣本和對照樣本中的序列片段對比(或定位)到參考基因組/轉(zhuǎn)錄組上，檢測rna甲基化位點。對照樣本測量對應(yīng)rna的表達量，本質(zhì)上是rna-seq數(shù)據(jù)。以m⁶amrna甲基化修飾為例，通過該方法，可檢測分析出樣品的m⁶a甲基化位點、峰、差異甲基化、剪接異構(gòu)體層次上的甲基化位點以及基于分子網(wǎng)絡(luò)的rna甲基化功能注釋。

在m⁶a-seq的方法步驟中，最為關(guān)鍵的步驟為免疫共沉淀的反應(yīng)以及免疫共沉淀復(fù)合物中mrna的洗脫。如果在這兩個步驟中不成功或者效果不理想，最后抓取獲得的甲基化mrna的含量非常低，甚至不能滿足深度測序所需要的含量，從而造成試驗的失敗。在該方法中，研究者常常采用n⁶-methyladenosine,5′-monophosphatesodiumsalt(sigma-aldrich,cat.no.m2780)作為洗脫劑，該試劑價格昂貴(4612元)，而且耗時長(3個小時以上)，反應(yīng)的次數(shù)有限(每管僅僅可做10個反應(yīng))，最大的問題是該方法洗脫獲得的甲基化mrna的含量非常低，這給后續(xù)的深度測序造成了極大的困難。因此，選擇一種廉價、快速、高效的洗脫劑對于研究m⁶amrna甲基化修飾具有重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
：

本發(fā)明的目的是針對m⁶a抗體與mrna免疫共沉淀產(chǎn)量低，價格昂貴的問題，提供一種用于洗脫m⁶a和甲基化mrna復(fù)合物的洗脫液及其應(yīng)用，該洗脫液中加入proteasek，采用該洗脫液洗脫m⁶a和甲基化mrna復(fù)合物獲得甲基化mrna，可以顯著降低試驗成本，縮短試驗時間，提高洗脫效率和mrna的得率。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種提高m⁶a抗體富集甲基化mrna產(chǎn)量的方法，該方法采用proteasek等作為洗脫液，并對洗脫液的體積、洗脫時間和溫度進行優(yōu)化，從而提高m⁶a抗體拉取mrna的產(chǎn)量，并大大降低試驗成本，為m⁶arna甲基化修飾的研究提供經(jīng)濟高效的方法。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種用于洗脫m⁶a和甲基化mrna復(fù)合物的洗脫液，其特征在于：該洗脫液包含以下組分：nacl：0～0.2m；tris：1～20mm，ph8.0；edta：0.5～5mm；sds：0.01～0.5；proteinasek：1～300μg/ml。

優(yōu)選的，該洗脫液包括以下組分：nacl：0.01～0.2m；tris：1～20mm，ph8.0；edta：0.5～5mm；sds：0.01～0.5；proteinasek：10～300μg/ml。

更進一步優(yōu)選的，該洗脫液包含以下組分：nacl：0.05～0.2m；tris：5～20mm，ph8.0；edta：0.5～5mm；sds：0.01～0.2；proteinasek：100～300μg/ml。

上述的洗脫液在提高m⁶a抗體富集甲基化mrna產(chǎn)量中的應(yīng)用。

一種提高m⁶a抗體富集甲基化mrna產(chǎn)量的方法，對制備的m⁶a和甲基化mrna的復(fù)合物采用洗脫液進行洗脫分離m⁶a和mrna，從而獲得甲基化mrna，所述的洗脫液包含以下組分：nacl：0～0.2m；tris：1～20mm，ph8.0；edta：0.5～5mm；sds：0.01～0.5；proteinasek：1～300μg/ml。最優(yōu)選的，所述的洗脫液包含以下組分：nacl：0.05～0.2m；tris:5～20mm,ph8.0；edta:0.5～5mm；sds:0.01～0.2；proteinasek:100～300μg/ml。

進一步優(yōu)選的，所述洗脫的時間為40～120min。所述洗脫的溫度為37～60℃。洗脫時，所述洗脫液的體積為50～300μl。更進一步優(yōu)選的，所述洗脫液的體積為100～300μl。

上述的方法中制備m⁶a和甲基化mrna的復(fù)合物的過程為：提取細胞總rna，然后從總rna中分離提取mrna，接著采用m⁶a抗體與mrna進行免疫共沉淀，將具有m⁶a甲基化修飾的mrna抓取，獲得m⁶a抗體和甲基化mrna的復(fù)合物。最后通過洗脫液分離m⁶a和mrna，從而獲得甲基化mrna。

本發(fā)明中提高m⁶a抗體富集甲基化mrna產(chǎn)量的方法的詳細過程為：首先采用trizol提取總的rna，采用promega公司的mrnaisolationsystem將mrna提取出來，在采用abcam的m⁶a抗體與提取純化的mrna進行免疫共沉淀，獲得m⁶a與甲基化mrna的復(fù)合物，最后采用含有proteasek的洗脫液將含有m⁶a甲基化修飾的mrna洗脫下來，從而獲得m⁶a甲基化修飾的mrna用于特定基因甲基化修飾的qrt-pcr或者rna-sequence的高通量測序。該發(fā)明的關(guān)鍵步驟在于洗脫液的配置以及洗脫條件的優(yōu)化，其中洗脫液的組分優(yōu)選包括nacl：0.05～0.2m；tris:5～20mm,ph8.0；edta:0.5～5mm；sds:0.01～0.2；proteinasek:100～300μg/ml；洗脫液的體積為100～300μl；洗脫時間為40～120min；洗脫溫度為37～60℃。

本發(fā)明所涉及的材料和試劑除特別說明外均可通過市場購買獲得，本發(fā)明所述的室溫為25±5℃。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明技術(shù)方案獲得了較高產(chǎn)量的m⁶a甲基化修飾的mrna，大大方便后續(xù)用于研究特定基因的甲基化修飾或者rna-sequence的高通量測序。由于該發(fā)明提高了用于后續(xù)研究的樣品量，從而大大提高實驗的精確性。此外，與采用n⁶-methyladenosine,5′-monophosphatesodiumsalt(sigma-aldrich,cat.no.m2780)作為洗脫劑相比，采用proteinasek作為洗脫液的關(guān)鍵成分大大降低實驗的成本，為大多數(shù)經(jīng)費不足的實驗室提供了試驗的可能性。另外，采用n⁶-methyladenosine,5′-monophosphatesodiumsalt作為洗脫劑需要兩次洗脫，而采用proteinasek作為洗脫液則只需要一次洗脫，大大節(jié)約了試驗的時間。

具體實施方式：

以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明：

實施例1

1.細胞培養(yǎng)

將hepg2細胞以1×10⁶種植于10cm的培養(yǎng)皿中，在co2濃度為5％，溫度為37℃，濕度為95％的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。

2.總rna的提取

細胞培養(yǎng)48h之后，將培養(yǎng)基去掉，用pbs洗一遍，加入3ml的trizol，用移液槍將細胞吹打脫落，將含有trizol的細胞懸液分裝于1.5ml的離心管中。每毫升的trizol懸液中加入200μl的氯仿，置于漩渦振蕩器震蕩5秒，然后靜置2-3min。待液體分層后，在4℃下，以12000轉(zhuǎn)/min，離心15min。離心之后液體分成3層，小心吸取最上層液體約500μl于新的1.5ml的離心管中。加入等體積的異丙醇，震蕩混勻，在室溫靜置10min。隨后，在4℃下，以12000轉(zhuǎn)/min，離心10min。離心之后，將上清液倒掉，加入1ml的75％的酒精洗滌一遍，接著再4℃下，以12000轉(zhuǎn)/min，離心5min,此時可看到rna沉淀。將酒精倒掉，在超凈臺中空氣干燥5～10min。隨后，加入100μl的超純水將rna沉淀溶解，保存在-80℃冰箱備后期試驗使用。

3.mrna的提取

3.1探針退火

1)將以上提取到的300～500mg總rna轉(zhuǎn)移到新的無rna酶的1.5ml的離心管中，用rnasw-free的水補齊500μl的體積；

2)將總rna在65℃水浴中加熱10min。

3)加入3μl的biotinylated-oligo(dt)探針和13μl的20×scc溶液，輕輕混勻，在室溫下孵育至完全冷卻。

3.2磁珠的洗滌

1)每個樣品對應(yīng)地取出一管磁珠，輕輕地彈管底部使得磁珠重懸，隨后將管子置于磁力架上使得磁珠緊貼管壁；

2)小心吸掉上清液；

3)用0.5×scc溶液洗滌磁珠3遍，每遍300μl體積；每次洗滌之后將磁珠置于磁力架，小心去掉上清液；

4)最后用100μl0.5×scc溶液重懸磁珠。

3.3mrna的捕獲及洗滌

1)將以上退火的探針全部加入到含有磁珠的離心管中；

2)室溫下孵育10min，每隔1～2min輕輕上下顛倒混勻；

3)將含有磁珠和總rna混合液的離心管置于磁力架，小心去掉上清液；

4)用0.1×scc溶液洗滌磁珠4次，每次體積為300μl，用手指輕輕彈管子底部使得磁珠重懸。最后一次洗滌之后，盡可能地吸干凈上清液；

3.4溶解mrna

1)用100μl的rnase-free水重懸磁珠，輕輕彈擊管子底部使得磁珠重懸均勻；

2)將磁珠置于磁力架上，吸取含有mrna的上清液于新的rnase-free的離心管中；

3)用150μl的rnase-free水再溶解一遍，將兩次的上清液混合(總體積250μl)

4.mrna的斷裂

采用200μl的薄壁pcr管將mrna的濃度調(diào)整到大約1μg/μl，震蕩混勻并低速離心，采用以下體系將mrna進行斷裂：

斷裂液的組成：100mmtris-hcl，100mmzncl

將含有mrna和斷裂液的pcr管在梯度pcr儀中94℃孵育5min，結(jié)束后立即加入2μl的0.5medta，漩渦震蕩并低速離心，然后置于冰上。重復(fù)以上步驟，直至將所有mrna斷裂。

最后將所有的同一樣品的mrna混合，加入1/10體積的3m醋酸鈉，100μg/ml的糖原和2.5倍體積的100％乙醇，混勻后于-80℃保存過夜，次日離心洗滌獲得斷裂的mrna備后續(xù)試驗應(yīng)用。

5.m⁶a與mrna的免疫共沉淀

1)取200mg的未經(jīng)斷裂處理的mrna作為input對照；

2)剩余的經(jīng)斷裂處理的mrna用rnase-free水調(diào)整體積到755μl，采用以下體系進行免疫共沉淀：

ipbuffer的組成如下：50mmtris-hcl,750mmnacl和0.5％(體積)igepalca-630。

3)按照以上體積和濃度配好反應(yīng)體系后，在4℃條件下在滾輪上孵育2h；

4)同時，用1×ipbuffer洗滌200μl的磁珠兩遍，最后用含有0.5mg/ml的bsa的1×ipbuffer重懸磁珠，并在4℃條件下在滾輪上孵育2h；之后用1ml的1×ipbuffer洗滌兩遍，最后用1.7ml的離心管分成兩等分；

5)將免疫沉淀反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到含有磁珠的離心管中，再在4℃條件下在滾輪上孵育2h；

6)將離心管置于磁力架上，去掉上清液，用1ml的1×ipbuffer洗滌3遍，最后一遍盡量去除液體；

6.洗脫免疫共沉淀復(fù)合物

以往的方法采用n⁶-methyladenosine,5′-monophosphatesodiumsalt(sigma-aldrich,cat.no.m2780)作為洗脫劑，該試劑價格昂貴(4612元)，而且耗時長(3個小時以上)，反應(yīng)的次數(shù)有限(每管僅僅可做10個反應(yīng))，因此給試驗造成了極大地不便。兩種方法的比較見表1。

本方法采用proteinasek制備的洗脫劑，價格便宜(700元左右)，反應(yīng)時間短(1～2h)，可以用很多次反應(yīng)，關(guān)鍵是極大地提高了洗脫效率，大大提高mrna的得率：優(yōu)選的反應(yīng)體系如下：nacl：0.05～0.2m；tris:5～20mm,ph8.0；edta:0.5～5mm；sds:0.01～0.2；proteinasek:100～300μg/ml；洗脫液的體積為100～300μl；洗脫時間為40～120min；洗脫溫度為37～60℃。具體實施例子見表2。

7.沉淀mrna的提取

在洗脫下來的mrna中加入1/10體積的3m醋酸鈉和2.5倍體積的100％乙醇，混勻后于-80℃保存過夜，隨后再用trizol提取一遍，即可獲得干凈的免疫沉淀mrna。

表1.采用n⁶-methyladenosine,5′-monophosphatesodiumsalt(a)和proteinasek(b)作為主要成分的洗脫液效果比較

注：a為含有n⁶-methyladenosine,5′-monophosphatesodiumsalt的洗脫液；b為含有proteinasek的洗脫液；反應(yīng)次數(shù)指的是一瓶n⁶-methyladenosine,5′-monophosphatesodiumsalt(10mg/瓶)或者proteinasek(25mg/瓶)足夠做的樣品數(shù)。用于高通量測序的mrna的最低含量為10ng。

表2.三個具體實例的各個參數(shù)