本發(fā)明屬于診斷領(lǐng)域，涉及強(qiáng)直性脊柱炎的診斷相關(guān)基因。

背景技術(shù)：

強(qiáng)直性脊柱炎又名別赫捷列夫氏(vonbechterev)病或馬-施二氏(maritstrumpell)病，是一種慢性、進(jìn)行性，中軸關(guān)節(jié)受累的慢性炎癥性疾病。主要影響骨盆的骶髂關(guān)節(jié)、脊柱關(guān)節(jié)和椎旁組織。主要癥狀為下腰痛、脊椎僵硬及運(yùn)動(dòng)范圍受限、x線顯示兩側(cè)骶髂關(guān)節(jié)炎(sacroilitis)為其特征。由于該病一般先侵犯骶髂關(guān)節(jié)，并重點(diǎn)累及脊柱，最終導(dǎo)致脊柱骨性強(qiáng)直，故目前國(guó)內(nèi)外多稱之為強(qiáng)直性脊柱炎(ankglosingspondytitis，as)。

強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosingspondylitis，as)是一種自身免疫性疾病，多發(fā)于16-40歲的青壯年，男女患病比例約為4-10：1。as在白種人群中的發(fā)病率約為1％-3％，我國(guó)as患病率約為0.2-0.6％，其中60％以上的患者伴有髖關(guān)節(jié)受累，致使20％以上as患者殘疾。as屬多基因疾病，具有明顯的遺傳傾向，雖然通常認(rèn)為遺傳與免疫因素在as發(fā)病中起主導(dǎo)作用，但確切的病因與發(fā)病機(jī)制仍不清楚。

但該病從發(fā)病到明確診斷往往需要5-7年的時(shí)間。雖然近幾年，國(guó)內(nèi)外在本病的診斷及治療方法上均有不少進(jìn)展，但由于本病是慢性進(jìn)展性疾病，致殘率較高，目前仍缺乏特異治療，到后期病情不可逆轉(zhuǎn)，嚴(yán)重影響患者生活自理能力和工作能力，給患者及家人帶來(lái)沉重的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此早期診斷和合理治療對(duì)延緩病理進(jìn)展、降低致殘、改善預(yù)后起到至關(guān)重要的作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)maged1基因在強(qiáng)直性脊柱炎患者的血液中的含量比正常人低很多，maged1基因的差異表達(dá)可作為診斷強(qiáng)直性脊柱炎的一種方法，據(jù)此可以開發(fā)診斷強(qiáng)直性脊柱炎的工具。

具體的，本發(fā)明提供了檢測(cè)maged1基因表達(dá)的產(chǎn)品在制備診斷強(qiáng)直性脊柱炎的工具中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，上面所提到的檢測(cè)產(chǎn)品包括：通過(guò)rt-pcr、實(shí)時(shí)定量pcr、免疫檢測(cè)、原位雜交、芯片或高通量測(cè)序平臺(tái)檢測(cè)maged1基因的表達(dá)水平以診斷強(qiáng)直性脊柱炎的產(chǎn)品。

進(jìn)一步，所述用rt-pcr診斷強(qiáng)直性脊柱炎的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增maged1基因的引物；所述用實(shí)時(shí)定量pcr診斷強(qiáng)直性脊柱炎的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增maged1基因的引物；所述用免疫檢測(cè)診斷強(qiáng)直性脊柱炎的產(chǎn)品包括：與maged1蛋白特異性結(jié)合的抗體；所述用原位雜交診斷強(qiáng)直性脊柱炎的產(chǎn)品包括：與maged1基因的核酸序列雜交的探針；所述用芯片診斷強(qiáng)直性脊柱炎的產(chǎn)品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括與maged1蛋白特異性結(jié)合的抗體，基因芯片包括與maged1基因的核酸序列雜交的探針。

在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述用實(shí)時(shí)定量pcr診斷強(qiáng)直性脊柱炎的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增maged1基因的引物的序列如seqidno.1和seqidno.2所示。

優(yōu)選地，所述診斷工具包括芯片、試劑盒、試紙或高通量測(cè)序平臺(tái)。其中，高通量測(cè)序平臺(tái)是一種特殊的診斷工具，檢測(cè)maged1基因表達(dá)的產(chǎn)品可以應(yīng)用于該平臺(tái)實(shí)現(xiàn)對(duì)maged1基因的表達(dá)情況的檢測(cè)。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，對(duì)一個(gè)人的基因表達(dá)譜的構(gòu)建將成為十分便捷的工作。通過(guò)對(duì)比疾病患者和正常人群的基因表達(dá)譜，容易分析出哪個(gè)基因的異常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測(cè)序中獲知maged1基因的異常與強(qiáng)直性脊柱炎相關(guān)也屬于maged1基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

本發(fā)明還提供了一種診斷強(qiáng)直性脊柱炎的工具，所述產(chǎn)品包括芯片、試劑盒、試紙、或高通量測(cè)序平臺(tái)。

其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片；所述基因芯片包括固相載體以及固定在固相載體的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括用于檢測(cè)maged1基因轉(zhuǎn)錄水平的針對(duì)maged1基因的寡核苷酸探針；所述蛋白質(zhì)芯片包括固相載體以及固定在固相載體的maged1蛋白的特異性抗體；所述基因芯片可用于檢測(cè)包括maged1基因在內(nèi)的多個(gè)基因(例如，與強(qiáng)直性脊柱炎相關(guān)的多個(gè)基因)的表達(dá)水平。所述蛋白質(zhì)芯片可用于檢測(cè)包括maged1蛋白在內(nèi)的多個(gè)蛋白質(zhì)(例如與強(qiáng)直性脊柱炎相關(guān)的多個(gè)蛋白質(zhì))的表達(dá)水平。通過(guò)將多個(gè)與強(qiáng)直性脊柱炎的標(biāo)志物同時(shí)檢測(cè)，可大大提高強(qiáng)直性脊柱炎診斷的準(zhǔn)確率。

其中，所述試劑盒包括基因檢測(cè)試劑盒和蛋白免疫檢測(cè)試劑盒；所述基因檢測(cè)試劑盒包括用于檢測(cè)maged1基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑；所述蛋白免疫檢測(cè)試劑盒包括maged1蛋白的特異性抗體。進(jìn)一步，所述試劑包括使用rt-pcr、實(shí)時(shí)定量pcr、免疫檢測(cè)、原位雜交或芯片方法檢測(cè)maged1基因表達(dá)水平過(guò)程中所需的試劑。優(yōu)選度，所述試劑包括針對(duì)maged1基因的引物和/或探針。根據(jù)maged1基因的核苷酸序列信息容易設(shè)計(jì)出可以用于檢測(cè)maged1基因表達(dá)水平的引物和探針。

所述高通量測(cè)序平臺(tái)包括檢測(cè)maged1基因表達(dá)水平的試劑。

所述試紙包括試紙載體和固定在試紙載體上的寡核苷酸，所述寡核苷酸能夠檢測(cè)maged1基因的轉(zhuǎn)錄水平。

與maged1基因的核酸序列雜交的探針可以是dna、rna、dna-rna嵌合體、pna或其它衍生物。所述探針的長(zhǎng)度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結(jié)合，任何長(zhǎng)度都可以。所述探針的長(zhǎng)度可短至25、20、15、13或10個(gè)堿基長(zhǎng)度。同樣，所述探針的長(zhǎng)度可長(zhǎng)至60、80、100、150、300個(gè)堿基對(duì)或更長(zhǎng)，甚至整個(gè)基因。由于不同的探針長(zhǎng)度對(duì)雜交效率、信號(hào)特異性有不同的影響，所述探針的長(zhǎng)度通常至少是14個(gè)堿基對(duì)，最長(zhǎng)一般不超過(guò)30個(gè)堿基對(duì)，與目的核苷酸序列互補(bǔ)的長(zhǎng)度以15-25個(gè)堿基對(duì)最佳。所述探針自身互補(bǔ)序列最好少于4個(gè)堿基對(duì)，以免影響雜交效率。

進(jìn)一步，所述maged1蛋白的特異性抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體。所述maged1蛋白的特異性抗體包括完整的抗體分子、抗體的任何片段或修飾(例如，嵌合抗體、scfv、fab、f(ab’)2、fv等。只要所述片段能夠保留與maged1蛋白的結(jié)合能力即可。用于蛋白質(zhì)水平的抗體的制備時(shí)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且本發(fā)明可以使用任何方法來(lái)制備所述抗體。

在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述針對(duì)maged1基因的引物序列如下：正向引物序列如seqidno.1所示，反向引物如seqidno.2所示。

用于診斷強(qiáng)直性脊柱炎的maged1基因及其表達(dá)產(chǎn)物的來(lái)源包括但不限于血液、組織液、尿液、唾液、脊髓液等可以獲得基因組dna的體液。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，用于診斷強(qiáng)直性脊柱炎的maged1基因及其表達(dá)產(chǎn)物的來(lái)源是血液。在發(fā)明的具體實(shí)施方案中，血液是取自強(qiáng)直性脊柱炎患者和正常人的血液。

本發(fā)明的maged1基因的具體序列可在國(guó)際公共核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)genebank中查詢到。

本發(fā)明的maged1蛋白包括maged1蛋白本身與maged1蛋白的部分肽，maged1蛋白的部分肽含有與強(qiáng)直性脊柱炎相關(guān)的功能域。

本發(fā)明的maged1蛋白包括maged1蛋白(序列可以在ncbi上查詢到)以及maged1蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括maged1蛋白保守性變異蛋白質(zhì)、或其活性片段，或其活性衍生物，等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊條件下能與maged1的dna雜交的dna所編碼的蛋白質(zhì)。

通常，已知的是，一個(gè)蛋白質(zhì)中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的修飾不會(huì)影響蛋白質(zhì)的功能。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)可改變單個(gè)氨基酸或小百分比的氨基酸或?qū)Π被嵝蛄械膫€(gè)別添加、缺失、插入、替換是保守修飾，其中蛋白質(zhì)的改變產(chǎn)生具有相似功能的蛋白質(zhì)。提供功能相似的氨基酸的保守替換表是本領(lǐng)域公知的。

本發(fā)明的maged1蛋白也包括對(duì)氨基酸序列的非保守修飾，只要經(jīng)過(guò)修飾的蛋白質(zhì)仍然能夠保留maged1蛋白的生物學(xué)活性即可。在此類修飾蛋白質(zhì)中突變的氨基酸數(shù)目通常是10個(gè)或者更少，例如6個(gè)或者更少，例如3個(gè)或者更少。

通過(guò)添加一個(gè)氨基酸或多個(gè)氨基酸殘基修飾的蛋白質(zhì)的例子是maged1蛋白的融合蛋白。對(duì)于與maged1蛋白融合的肽或者蛋白質(zhì)沒有限制，只要所得的融合蛋白保留maged1蛋白的生物學(xué)活性即可。

在本發(fā)明的上下文中，“診斷強(qiáng)直性脊柱炎”既包括判斷受試者是否已經(jīng)患有強(qiáng)直性脊柱炎、也包括判斷受試者是否存在患有強(qiáng)直性脊柱炎的風(fēng)險(xiǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1顯示利用qpcr檢測(cè)maged1基因在強(qiáng)直性脊柱炎患者和正常人中的表達(dá)差異；

圖2顯示利用westernblot檢測(cè)maged1蛋白在強(qiáng)直性脊柱炎患者和正常人中的表達(dá)差異。

具體的實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例1篩選強(qiáng)直性脊柱炎患者和正常人中差異表達(dá)的基因

1、樣本采集：

病例樣本全部采集自門診病人，患者的診斷由富有臨床經(jīng)驗(yàn)的風(fēng)濕病科醫(yī)師根據(jù)1984年提出修訂的紐約標(biāo)準(zhǔn)作出，并通過(guò)多次隨訪確診。對(duì)照樣本來(lái)自南方中心樣本庫(kù)中年齡、性別匹配，無(wú)關(guān)節(jié)炎病史的個(gè)體。

在知情同意的基礎(chǔ)上隨機(jī)收集了5個(gè)病人和7個(gè)正常對(duì)照個(gè)體的外周血樣本。

2、全血總rna提取

取空腹血2ml經(jīng)edta.na2抗凝，全血0.3ml采用3s柱離心式血液總rna抽提試劑盒(k3620上海博彩生物科技有限公司)抽取rna，rna提取物于-80℃保存。

3、rna樣品的質(zhì)量分析

利用nanodrop2000對(duì)所提rna的濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)rna完整性，agilent2100測(cè)定rin值。單次建庫(kù)要求rna總量5μg，濃度≥200ng/μl，od260/280介于1.8～2.2之間。

4、片段化rna

illumina平臺(tái)是針對(duì)短序列片段進(jìn)行測(cè)序，mrna平均長(zhǎng)度可能達(dá)幾kb，因此需要對(duì)其進(jìn)行隨機(jī)打斷。利用金屬離子，可以將rna隨機(jī)斷裂成200bp左右的小片段。

5、反轉(zhuǎn)合成cdna

在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，利用隨機(jī)引物，以mrna為模板反轉(zhuǎn)合成一鏈cdna，進(jìn)行二鏈合成時(shí)，dntps試劑中用dutp代替dttp，使cdna第二鏈中堿基包含a/u/c/g。

6、連接adaptor

雙鏈的cdna結(jié)構(gòu)為粘性末端，加入endrepairmix將其補(bǔ)成平末端，隨后在3’末端加上一個(gè)a堿基，用于連接y字形的接頭。

7、ung酶消化cdna二鏈

在pcr擴(kuò)增前，用ung酶將cdna第二鏈消化，從而使文庫(kù)中僅包含cdna第一鏈。

8、illuminax-ten上機(jī)測(cè)序

illuminax-ten測(cè)序平臺(tái)，進(jìn)行2*150bp測(cè)序。

9、生物信息學(xué)分析

測(cè)序數(shù)據(jù)獲得以后的rawdata分析過(guò)程如下所示：

(1)用cutadapt對(duì)reads的5’和3’段進(jìn)行trim，trim掉質(zhì)量<20的堿基，并且刪掉n大于10％的reads；

(2)tophat比對(duì)到參考基因組上。所用的參考基因組版本為grch38.p7，fasta和gff文件下載自ncbi；

(3)cuffquant定量mrna的表達(dá)量并標(biāo)準(zhǔn)化輸出；

(4)在r環(huán)境下用degseq包比較對(duì)照組跟疾病組mrna的表達(dá)差異。顯著差異mrna篩選條件：p-value<0.05。

10、結(jié)果

rna-seq結(jié)果顯示，強(qiáng)直性脊柱炎患者和正常人之間共篩選出523個(gè)差異表達(dá)基因，其中，上調(diào)表達(dá)基因?yàn)?42個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因?yàn)?81個(gè)。根據(jù)p-value排序，選擇maged1基因進(jìn)行大樣本驗(yàn)證。

實(shí)施例2大樣本驗(yàn)證差異表達(dá)基因

1、樣本采集

病例樣本全部采集自門診病人，患者的診斷由富有臨床經(jīng)驗(yàn)的風(fēng)濕病科醫(yī)師根據(jù)1984年提出修訂的紐約標(biāo)準(zhǔn)作出，并通過(guò)多次隨訪確診。對(duì)照樣本來(lái)自南方中心樣本庫(kù)中年齡、性別匹配，無(wú)關(guān)節(jié)炎病史的個(gè)體。

在知情同意的基礎(chǔ)上隨機(jī)收集了30個(gè)病人和45個(gè)正常對(duì)照個(gè)體的外周血樣本。

2、全血總rna提取

取空腹血2ml經(jīng)edta.na2抗凝，全血0.3ml采用3s柱離心式血液總rna抽提試劑盒(k3620上海博彩生物科技有限公司)抽取rna，rna提取物于-80度保存。

3、應(yīng)用rt-pcr

全血總rna合成cdna使用takara反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒(drr037s大連寶生物工程有限公司)?？偡磻?yīng)體系為20μl，包括2*sybrpremixextaptm，1-100ngcdna，50pmol/μl引物。兩步法pcr循環(huán)條件：預(yù)變性95度30s，1個(gè)循環(huán)；變性95度5s，退火/延伸60度20s共45個(gè)循環(huán)。溶解曲線分析95度1s，60度10s，95度1s。

引物序列如下：

擴(kuò)增maged1基因的正向引物序列為5’-aataagttggtcaagtac-3’(seqidno.1)，反向引物序列為5’-atatacaggtgttcttct-3’(seqidno.2)；

擴(kuò)增gapdh基因的正向引物序列為5’-aaagggtcatcatctctg-3’(seqidno.3)，反向引物序列為5’-gctgttgtcatacttctc-3’(seqidno.4)。

4、相對(duì)定量分析

相對(duì)定量分析采用lightcyclerrelativequantification(version1.5)軟件，標(biāo)準(zhǔn)化比值計(jì)算公式采用2^-△△ct法，△ct(患者樣本)＝ct目的基因-ct內(nèi)參基因，△ct(校正品)＝ct目的基因-ct內(nèi)參基因，△△ct＝△ct(患者樣本)-△ct(校正品)

5、結(jié)果

結(jié)果如圖1所示，與正常人相比，強(qiáng)直性脊柱炎患者血液中maged1基因表達(dá)量明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

實(shí)施例2血液中maged1蛋白的差異表達(dá)

1、單核細(xì)胞分離

外周血10ml，注入盛肝素的無(wú)菌小瓶中，加蓋后立即輕輕搖勻。用無(wú)菌吸管加入等體積的hbss(nacl8.0g，na2hpo40.132g，kh2po40.06g，kcl0.4g，酚紅1ml，nahco30.35g，d-葡萄糖1.0g，溶于1000ml雙蒸水)，以降低紅細(xì)胞的凝聚。吸取8ml淋巴細(xì)胞分層液置50ml離心管中，將稀釋血液沿管壁緩慢加入，保持界面清楚，勿使兩者相混，在20℃2000r/min離心30min，小心吸取分層液與血漿交接部位混濁的灰白色層，即淋巴細(xì)胞層，加入另一支離心管中，用5倍體積的hbss洗滌2次，依次以2000r/min、1500r/min在室溫下離心10min，以便去除大部分混雜的血小板，用10ml雙蒸水與細(xì)胞團(tuán)塊混合1min，使殘余紅細(xì)胞裂解，然后迅速加入等量1.8％nacl溶液，2000r/min離心，去上清，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后用hbss溶液調(diào)整細(xì)胞至1×10⁶個(gè)/ml備用。

3、單核細(xì)胞總蛋白質(zhì)提取

將上述實(shí)驗(yàn)所得細(xì)胞懸液(濃度為1×10⁶個(gè)/ml)室溫1000r/min離心10min，棄上清后加入100μl裂解緩沖液，4℃震蕩1h，用超聲波儀破碎細(xì)胞，每次10s，共10次，于4℃12000r/min離心1h；取上清用brandford法定量蛋白，分裝成2.5μg/μl，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

4、westernblot檢測(cè)

將提取的蛋白定量進(jìn)行sds-page電泳，之后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、顯色。

5、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

將蛋白條帶的灰度值使用imagej軟件進(jìn)行分析，以β-actin為內(nèi)參，將目的白條帶的灰度值進(jìn)行歸一化處理。結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來(lái)表示，采用spss13.0統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)p<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

6、結(jié)果

結(jié)果如圖2所示，與正常人相比，強(qiáng)直性脊柱炎患者血液中maged1蛋白含量降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。

上述實(shí)施例的說(shuō)明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。

sequencelisting

<110>北京泱深生物信息技術(shù)有限公司

<120>強(qiáng)直性脊柱炎診斷相關(guān)基因

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

aataagttggtcaagtac18

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<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

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<212>dna

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<400>3

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<212>dna

<213>人工序列

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gctgttgtcatacttctc18