本發(fā)明涉及動(dòng)物生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)異性孿生母牛sry相對(duì)含量的方法。

背景技術(shù)：

母牛繁殖機(jī)理的深入研究和胚胎生物技術(shù)的快速發(fā)展使得人工誘導(dǎo)母牛雙胎得以成為現(xiàn)實(shí)。雙胎中若為異性孿生則公母犢的繁殖力都將受到影響，尤其以母犢受影響最大，有近85％的母犢不具備生育能力。雖然其中仍有15％左右的母犢是可育的，但在實(shí)踐生產(chǎn)中，由于缺乏有效的早期鑒別方法，這些可育的母犢常被當(dāng)做公犢處理或者飼養(yǎng)。

常規(guī)pcr技術(shù)能對(duì)核酸分子進(jìn)行特異性的定性檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)在反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累可實(shí)現(xiàn)pcr擴(kuò)增過程中的實(shí)時(shí)監(jiān)控和連續(xù)性分析，檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性都比常規(guī)pcr技術(shù)要高。

sry基因是y染色體上決定哺乳動(dòng)物雄性性別的重要基因片段，在系統(tǒng)進(jìn)化中具有高度的保守性。sry基因在人類醫(yī)學(xué)中主要用于檢測(cè)性別發(fā)育異常患者的染色體組成，分析可能的患病原因，為科學(xué)治療疾病提供依據(jù)；在動(dòng)物生產(chǎn)上主要應(yīng)用在奶牛胚胎性別鑒定和性別控制上。

目前認(rèn)為，異性孿生母牛不育是由于發(fā)育較早的雄性胎兒產(chǎn)生的激素及xy細(xì)胞通過共用的尿囊膜之間的血管吻合支影響了雌性胎兒的生殖系統(tǒng)發(fā)育。因此，異性孿生不育母牛體內(nèi)存在xx/xy嵌合體，檢測(cè)xx/xy嵌合體的存在為鑒別異性孿生母牛是否可育提供了一個(gè)可能的途徑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)異性孿生母牛sry相對(duì)含量的方法。

本發(fā)明首先保護(hù)引物對(duì)i，由引物sry-f和引物sry-r組成；

所述引物sry-f為如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列1所示的單鏈dna分子；

(a2)將序列1經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代且與序列1具有相同功能的dna分子；

所述引物sry-r為如下(a3)或(a4)：

(a3)序列表的序列2所示的單鏈dna分子；

(a4)將序列2經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代且與序列2具有相同功能的dna分子。

本發(fā)明還保護(hù)引物組合，由所述引物對(duì)i和引物對(duì)ii組成；

所述引物對(duì)ii由引物gapdh-f和引物gapdh-r組成；

所述引物gapdh-f為如下(b1)或(b2)：

(b1)序列表的序列3所示的單鏈dna分子；

(b2)將序列3經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代且與序列3具有相同功能的dna分子；

所述引物gapdh-r為如下(b3)或(b4)：

(b3)序列表的序列4所示的單鏈dna分子；

(b4)將序列4經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代且與序列4具有相同功能的dna分子。

本發(fā)明還保護(hù)所述引物對(duì)i或所述引物組合的應(yīng)用，為如下(c1)-(c6)任一種：

(c1)檢測(cè)sry相對(duì)含量；

(c2)制備用于檢測(cè)sry相對(duì)含量的試劑盒；

(c3)檢測(cè)異性孿生母牛sry相對(duì)含量；

(c4)制備用于檢測(cè)異性孿生母牛sry相對(duì)含量的試劑盒；

(c5)鑒別異性孿生母牛是否可育；

(c6)制備用于鑒別異性孿生母牛是否可育的試劑盒。

本發(fā)明還保護(hù)含有所述引物對(duì)i或所述引物組合的試劑盒；所述試劑盒的用途為如下(d1)或(d2)或(d3)：

(d1)檢測(cè)sry相對(duì)含量；

(d2)檢測(cè)異性孿生母牛sry相對(duì)含量；

(d3)鑒別異性孿生母牛是否可育。

所述試劑盒還包括2×sybrgreenmaster(rox)和超純?nèi)ルx子水。

所述2×sybrgreenmaster具體可為購買自roche的貨號(hào)為04913850001的產(chǎn)品。

所述超純?nèi)ルx子水為不含dna和rna降解酶的無菌水(dnase/rnase-freewater)。

所述含有所述引物組合的試劑盒組分具體可如表4所示。所述目標(biāo)引物sry由引物sry-f和引物sry-r組成。引物sry-f和引物sry-r的濃度均為10μm。所述內(nèi)參引物gapdh由引物gapdh-f和引物gapdh-r組成。引物gapdh-f和引物gapdh-r的濃度均為10μm。

本發(fā)明還保護(hù)以上任一所述試劑盒的制備方法，包括將各條引物單獨(dú)包裝的步驟。

本發(fā)明還保護(hù)一種檢測(cè)異性孿生母牛sry相對(duì)含量的方法(方法甲)，包括如下步驟：分別提取待測(cè)異性孿生母牛與待測(cè)異性孿生母牛屬于同一品種的正常公牛的基因組dna；采用實(shí)時(shí)熒光定量pcr，以gapdh基因?yàn)閮?nèi)參基因，檢測(cè)各個(gè)基因組dna中sry基因的相對(duì)含量，以正常公牛基因組dna中sry基因的相對(duì)含量為100％，得到待測(cè)異性孿生母牛基因組dna中sry基因相對(duì)值。

本發(fā)明還保護(hù)一種鑒別異性孿生母牛是否可育的方法(方法乙)，包括如下步驟：分別提取待測(cè)異性孿生母牛和與待測(cè)異性孿生母牛屬于同一品種的正常公牛的基因組dna；采用實(shí)時(shí)熒光定量pcr，以gapdh基因?yàn)閮?nèi)參基因，檢測(cè)各個(gè)基因組dna中sry基因的相對(duì)含量，以正常公?；蚪Mdna中sry基因的相對(duì)含量為100％，得到待測(cè)異性孿生母牛基因組dna中sry基因相對(duì)值；根據(jù)待測(cè)異性孿生母牛基因組dna中sry基因相對(duì)值判斷異性孿生母牛是否可育。

所述方法乙中，“根據(jù)待測(cè)異性孿生母?；蚪Mdna中sry基因相對(duì)值判斷異性孿生母牛是否可育”的判斷標(biāo)準(zhǔn)具體可為：如果待測(cè)異性孿生母牛基因組dna中sry基因相對(duì)值＜0.5％，待測(cè)異性孿生母牛為或候選為可育母牛。

以上任一所述熒光定量pcr中，采用引物對(duì)i檢測(cè)sry基因，采用引物對(duì)ii檢測(cè)gapdh基因。

以上任一所述實(shí)時(shí)熒光定量pcr的反應(yīng)體系具體可如表1所示。更具體可如表2所示。

以上任一所述熒光定量pcr的反應(yīng)程序具體可為：第一階段：熱啟動(dòng)95℃10min；第二階段：變性95℃30s，退火60℃60s，延伸72℃15s，此階段循環(huán)40次，退火階段末采集熒光信號(hào)；第三階段：熔解曲線95℃1min，55℃30s，之后在95℃-55℃間連續(xù)采集熒光信號(hào)(如果不需要獲得熔解曲線，可以省略第三階段)。

以上任一所述方法中，還包括提取正常母牛的血液基因組dna的步驟。所述方法中，設(shè)置正常公牛的基因組dna作為模板的樣本參照組(calibration)，設(shè)置正常母牛的基因組dna作為模板的陰性對(duì)照組(negativecontrol)，設(shè)置超純?nèi)ルx子水作為模板的空白對(duì)照組(notemplatecontrol)，設(shè)置待測(cè)異性孿生母牛的基因組dna作為模板的實(shí)驗(yàn)組(unknown)。所述方法中，所述實(shí)時(shí)熒光定量pcr的反應(yīng)程序：第一階段：熱啟動(dòng)95℃10min；第二階段：變性95℃30s，退火60℃60s，延伸72℃15s，此階段循環(huán)40次，退火階段末采集熒光信號(hào)；第三階段：熔解曲線95℃1min，55℃30s，之后在95℃-55℃間連續(xù)采集熒光信號(hào)(如果不需要獲得熔解曲線，可以省略第三階段)。

以上任一所述血液基因組dna具體可為頸靜脈edta抗凝全血的基因組dna。

以上任一所述異性孿生母牛具體可為異性孿生荷斯坦母牛。

以上任一所述正常公牛具體可為正常荷斯坦公牛。

本發(fā)明采用實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)待測(cè)樣本體內(nèi)sry的相對(duì)定量，本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)如下：(1)早期：異性孿生母犢出生后即可采血檢測(cè)；(2)快速：dna提取1小時(shí)，熒光定量pcr反應(yīng)2小時(shí)后直接讀取結(jié)果；(3)準(zhǔn)確：由于異性孿生母牛嵌合程度不同，xx/xy比例不同，部分樣本xy比例低，在常規(guī)pcr檢測(cè)中條帶不明顯容易誤判為陰性，此外常規(guī)pcr反應(yīng)后產(chǎn)物需電泳后在紫外燈下觀察陰陽性，對(duì)檢測(cè)人員危害大，而本發(fā)明反應(yīng)后能直接讀出sry的相對(duì)含量數(shù)值，不受肉眼分辨力的影響；(4)穩(wěn)定：本發(fā)明提供的方法可實(shí)現(xiàn)pcr擴(kuò)增過程中的實(shí)時(shí)監(jiān)控和連續(xù)性分析，引物特異性通過熔解曲線得到驗(yàn)證，靈敏度高，穩(wěn)定性好。采用本發(fā)明的方法對(duì)待測(cè)樣本體內(nèi)sry的相對(duì)定量，可為異性孿生母牛的可育性鑒別提供數(shù)據(jù)參考。

附圖說明

圖1為目標(biāo)引物sry的擴(kuò)增曲線。

圖2為目標(biāo)引物sry的熔解曲線。

圖3為內(nèi)參引物gapdh的擴(kuò)增曲線。

圖4為內(nèi)參引物gapdh的熔解曲線。

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)，結(jié)果取平均值。以下實(shí)施例中的超純?nèi)ルx子水為不含dna和rna降解酶的無菌水(dnase/rnase-freewater)。

2×sybrgreenmaster：roche，貨號(hào)：04913850001。

實(shí)施例1、檢測(cè)方法的建立

待測(cè)異性孿生母牛、正常公牛和正常母牛均為同一品種的牛。

分別采集待測(cè)異性孿生母牛、正常公牛和正常母牛的頸靜脈全血，置于edta采血管中，提取基因組dna。采用實(shí)時(shí)熒光定量pcr，以gapdh基因?yàn)閮?nèi)參基因，檢測(cè)各個(gè)基因組dna中sry基因的相對(duì)含量，以正常公牛基因組dna中sry基因的相對(duì)含量為100％，得到待測(cè)異性孿生母?；蚪Mdna中sry基因相對(duì)值(待測(cè)異性孿生母牛基因組dna中sry基因相對(duì)值＝待測(cè)異性孿生母?；蚪Mdna中sry基因的相對(duì)含量/正常公?；蚪Mdna中sry基因的相對(duì)含量)。如果待測(cè)異性孿生母?；蚪Mdna中sry基因相對(duì)值＜0.5％，待測(cè)異性孿生母牛為或候選為可育母牛。

用于檢測(cè)sry基因的引物對(duì)由引物sry-f和引物sry-r組成。用于檢測(cè)gapdh基因的引物對(duì)由引物gapdh-f和引物gapdh-r組成。

sry-f：5’-gccacagaaatcgcttcc-3’；

sry-r：5’-ccgtgtagccaatgttacctt-3’；

gapdh-f：5’-gtgagagacggaacaggaagaa-3’；

gapdh-r：5’-atgagggaagacaggacaaagc-3’。

實(shí)時(shí)熒光定量pcr的反應(yīng)體系(20μl)如表1所示。

表1實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系

對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行多次參數(shù)優(yōu)化，得到最優(yōu)的實(shí)時(shí)熒光定量pcr的反應(yīng)體系(20μl)，如表2所示。

表2實(shí)時(shí)熒光定量pcr最優(yōu)擴(kuò)增反應(yīng)體系

設(shè)置正常公牛的基因組dna作為模板的樣本參照組(calibration)，設(shè)置正常母牛的基因組dna作為模板的陰性對(duì)照組(negativecontrol)，設(shè)置超純?nèi)ルx子水作為模板的空白對(duì)照組(notemplatecontrol)，設(shè)置待測(cè)異性孿生母牛的基因組dna作為模板的實(shí)驗(yàn)組(unknown)。

實(shí)時(shí)熒光定量pcr的反應(yīng)程序：第一階段：熱啟動(dòng)95℃10min；第二階段：變性95℃30s，退火60℃60s，延伸72℃15s，此階段循環(huán)40次，退火階段末采集熒光信號(hào)；第三階段：熔解曲線95℃1min，55℃30s，之后在95℃-55℃間連續(xù)采集熒光信號(hào)(如果不需要獲得熔解曲線，可以省略第三階段)。

實(shí)施例2、檢測(cè)方法的驗(yàn)證

供試牛：12頭異性孿生20月齡荷斯坦母牛、2頭正常荷斯坦公牛和2頭正常荷斯坦母牛，均采自河北省涿州市中國農(nóng)業(yè)大學(xué)肉牛實(shí)踐基地。

采集供試牛的頸靜脈全血，置于edta采血管中，提取基因組dna。采用實(shí)時(shí)熒光定量pcr，以gapdh基因?yàn)閮?nèi)參基因，檢測(cè)各個(gè)基因組dna中sry基因的相對(duì)含量，以正常公?；蚪Mdna中sry基因的相對(duì)含量為100％，得到待測(cè)異性孿生母?；蚪Mdna中sry基因相對(duì)值(待測(cè)異性孿生母?；蚪Mdna中sry基因相對(duì)值＝待測(cè)異性孿生母牛基因組dna中sry基因的相對(duì)含量/正常公?；蚪Mdna中sry基因的相對(duì)含量)。結(jié)果見表3。

用于檢測(cè)sry基因的引物對(duì)由引物sry-f和引物sry-r組成。用于檢測(cè)gapdh基因的引物對(duì)由引物gapdh-f和引物gapdh-r組成。

sry-f：5’-gccacagaaatcgcttcc-3’：

sry-r：5’-ccgtgtagccaatgttacctt-3’：

gapdh-f：5’-gtgagagacggaacaggaagaa-3’；

gapdh-r：5’-atgagggaagacaggacaaagc-3’。

實(shí)時(shí)熒光定量pcr的反應(yīng)體系(20μl)，如表2所示。

設(shè)置正常公牛的基因組dna作為模板的樣本參照組(calibration)，設(shè)置正常母牛的基因組dna作為模板的陰性對(duì)照組(negativecontrol)，設(shè)置超純?nèi)ルx子水作為模板的空白對(duì)照組(notemplatecontrol)，設(shè)置待測(cè)異性孿生母牛的基因組dna作為模板的實(shí)驗(yàn)組(unknown)。

實(shí)時(shí)熒光定量pcr的反應(yīng)程序：第一階段：熱啟動(dòng)95℃10min；第二階段：變性95℃30s，退火60℃60s，延伸72℃15s，此階段循環(huán)40次，退火階段末采集熒光信號(hào)；第三階段：熔解曲線95℃1min，55℃30s，之后在95℃-55℃間連續(xù)采集熒光信號(hào)。

同時(shí)采用自然交配后能否成功妊娠并產(chǎn)犢的方法進(jìn)行待測(cè)異性孿生母牛的可育性驗(yàn)證，結(jié)果見表3。

正常公牛sry基因的擴(kuò)增曲線如圖1所示。正常公牛sry基因的熔解曲線如圖2所示。正常公牛gapdh基因的擴(kuò)增曲線如圖3所示。正常公牛gapdh基因的熔解曲線如圖4所示。

結(jié)果表明，圖1和圖3均得到“s”型曲線，圖2和圖4的熔解曲線均只出現(xiàn)單一峰，說明引物特異性好，合成產(chǎn)物單一。采用實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法并通過驗(yàn)證，篩選出編號(hào)為3和編號(hào)為6的兩頭異性孿生母牛。

表3sry基因相對(duì)值

實(shí)施例3、檢測(cè)sry相對(duì)含量的試劑盒

根據(jù)實(shí)施例1和實(shí)施例2的結(jié)果，設(shè)計(jì)了用于檢測(cè)sry相對(duì)含量的試劑盒。

試劑盒中主要由2×sybrgreenmaster(rox)、目標(biāo)引物sry、內(nèi)參引物gapdh以及超純?nèi)ルx子水組成，適用于50次和100次反應(yīng)的產(chǎn)品組成列于表4。

表4試劑盒組成

試劑盒中，目標(biāo)引物sry由引物sry-f和引物sry-r組成，并且引物sry-f和引物sry-r的濃度均為10μm；內(nèi)參引物gapdh由引物gapdh-f和引物gapdh-r組成，并且引物gapdh-f和引物gapdh-r的濃度均為10μm。

sry-f：5’-gccacagaaatcgcttcc-3’：

sry-r：5’-ccgtgtagccaatgttacctt-3’：

gapdh-f：5’-gtgagagacggaacaggaagaa-3’；

gapdh-r：5’-atgagggaagacaggacaaagc-3’。

所述試劑盒的使用方法為：分別采集待測(cè)異性孿生母牛、正常公牛和正常母牛的頸靜脈全血，置于edta采血管中，提取基因組dna。采用實(shí)時(shí)熒光定量pcr，以gapdh基因?yàn)閮?nèi)參基因，檢測(cè)各個(gè)基因組dna中sry基因的相對(duì)含量，以正常公牛基因組dna中sry基因的相對(duì)含量為100％，得到待測(cè)異性孿生母牛基因組dna中sry基因相對(duì)值(待測(cè)異性孿生母?；蚪Mdna中sry基因相對(duì)值＝待測(cè)異性孿生母牛基因組dna中sry基因的相對(duì)含量/正常公?；蚪Mdna中sry基因的相對(duì)含量)。

實(shí)時(shí)熒光定量pcr的反應(yīng)體系，如表5所示。

表5實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)體系

設(shè)置正常公牛的基因組dna作為模板的樣本參照組(calibration)，設(shè)置正常母牛的基因組dna作為模板的陰性對(duì)照組(negativecontrol)，設(shè)置超純?nèi)ルx子水作為模板的空白對(duì)照組(notemplatecontrol)，設(shè)置待測(cè)異性孿生母牛的基因組dna作為模板的實(shí)驗(yàn)組(unknown)。

實(shí)時(shí)熒光定量pcr的反應(yīng)程序：第一階段：熱啟動(dòng)95℃10min；第二階段：變性95℃30s，退火60℃60s，延伸72℃15s，此階段循環(huán)40次，退火階段末采集熒光信號(hào)；第三階段：熔解曲線95℃1min，55℃30s，之后在95℃-55℃間連續(xù)采集熒光信號(hào)。

sequencelisting

<110>中國農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>一種檢測(cè)異性孿生母牛sry相對(duì)含量的方法

<160>4

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

gccacagaaatcgcttcc18

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

ccgtgtagccaatgttacctt21

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

gtgagagacggaacaggaagaa22

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

atgagggaagacaggacaaagc22