本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體是一種特異性識(shí)別山羊ifn-γ的單克隆抗體制備方法，所得單克隆抗體僅識(shí)別山羊ifn-γ蛋白抗原，不與其他細(xì)胞因子發(fā)生交叉反應(yīng)。
背景技術(shù)：
：ifn-γ作為生物體內(nèi)抗病毒感染、抗腫瘤的重要細(xì)胞因子，在免疫應(yīng)答中對(duì)apc、巨噬細(xì)胞、nk細(xì)胞、b細(xì)胞的膜分子表達(dá)、活化和分化都有非常積極地促進(jìn)作用?，F(xiàn)今，對(duì)于人類及小鼠的ifn-γ研究的比較透徹，但山羊ifn-γ的相關(guān)研究卻鮮有報(bào)道，這極大地限制了對(duì)山羊疾病診斷和治療及其體內(nèi)炎癥反應(yīng)機(jī)制的研究，目前，市場上未見有山羊ifn-γ的相應(yīng)產(chǎn)品。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題與缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種特異性識(shí)別山羊ifn-γ的單克隆抗體制備方法，其識(shí)別山羊ifn-γ的最低含量限度為0.2％，且不與其他細(xì)胞因子發(fā)生交叉反應(yīng)，為山羊ifn-γ標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用奠應(yīng)基礎(chǔ)。實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的所采用的技術(shù)方案是一種特異性識(shí)別山羊ifn-γ蛋白的單克隆抗體制備方法，用原核表達(dá)純化的山羊ifn-γ作為免疫原，多次免疫balb/c小鼠，分離脾細(xì)胞，與sp2/0瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，篩選能穩(wěn)定分泌特異性識(shí)別山羊ifn-γ蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。該方法以大腸桿菌原核表達(dá)并純化的山羊ifn-γ為免疫原，設(shè)計(jì)免疫程序，免疫balb/c小鼠。所述設(shè)計(jì)免疫程序具體如下：首次免疫，原核表達(dá)純化山羊ifn-γ蛋白與完全弗氏佐劑等量混合，腹部皮下多點(diǎn)注射，200ul/只(1mg/ml)；兩周后，第二次免疫，原核表達(dá)純化山羊ifn-γ蛋白與不完全弗氏佐劑等量混合，腹部皮下多點(diǎn)注射，200ul/只；兩周后，第三次免疫，直接免疫用無菌注射水溶解的原核表達(dá)純化山羊ifn-γ蛋白，腹腔注射，100ul/只；融合前三天，加強(qiáng)免疫，直接用無菌注射水溶解的原核表達(dá)純化山羊ifn-γ蛋白尾靜脈注射，100ul/只。采用本發(fā)明的方法制備的雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體能夠特異性識(shí)別天然的山羊ifn-γ。采用本發(fā)明的方法所獲單克隆抗體可用于免疫組化試驗(yàn)、開發(fā)熒光抗體標(biāo)記技術(shù)、檢測試劑盒等，該株單抗識(shí)別山羊ifn-γ的最低含量限度為0.2％，且不與其他細(xì)胞因子發(fā)生交叉反應(yīng)，為山羊ifn-γ標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用奠應(yīng)基礎(chǔ)。具體實(shí)施方式本發(fā)明通過制備僅識(shí)別山羊ifn-γ的單克隆抗體，具體實(shí)施方式如下，以下實(shí)施用于說明本發(fā)明，但不限制本發(fā)明的使用范圍。實(shí)施例1一種特異性識(shí)別山羊ifn-γ的單克隆抗體制備方法，具體包括下列步驟：1)制備免疫抗原挑取ifn-γ-pet32-bl21(de3)大腸桿菌(此菌為本實(shí)驗(yàn)室保留，可大量表達(dá)山羊ifn-γ蛋白)擴(kuò)大培養(yǎng)，0.3mol/liptg于30℃6小時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)、10000rpm離心2min，pbs洗滌3次，40v2s2min超聲破裂，11700rpm離心2min收集上清，再通過ni-nat法進(jìn)行純化，于凍干機(jī)內(nèi)48小時(shí)凍干后保存?zhèn)溆?，?jīng)測定1mg干粉中含有0.2mg蛋白，用無菌注射水溶解使其終濃度為1mg/ml，4℃?zhèn)溆谩?)設(shè)計(jì)免疫程序取6-8周齡雌性balb/c小鼠，進(jìn)行免疫，共免疫4次。免疫方案如下：首次免疫，將純化山羊ifn-γ溶液與完全弗氏佐劑等體積混勻，形成油包水狀態(tài)，以200ul/只的劑量免疫小鼠，腹部皮下多點(diǎn)注射；二免于首免后2周進(jìn)行，將純化山羊ifn-γ溶液與不完全弗氏佐劑等量混合，形成油包水狀態(tài)，劑量與方法同上；三免于二免后2周進(jìn)行，直接注射純化山羊ifn-γ溶液，100ul/只，腹腔注射；三免后一周，測其血清效價(jià)達(dá)到1∶106，尾靜脈加強(qiáng)免疫，劑量同三免，三天后進(jìn)行細(xì)胞融合。3)制備雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞融合前一天，制備飼養(yǎng)層細(xì)胞：無菌條件下，抽取balb/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板備用。細(xì)胞融合：無菌條件下，將分離的脾細(xì)胞與sp2/0瘤細(xì)胞按108∶2×107個(gè)細(xì)胞數(shù)的比例進(jìn)行混合，在2mlpeg1500的作用下進(jìn)行細(xì)胞融合，將融合后的雜交瘤細(xì)胞鋪于含有飼養(yǎng)層細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4)篩選雜交瘤細(xì)胞按照常規(guī)間接elisa檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清：分別用經(jīng)con-a刺激后的山羊淋巴細(xì)胞上清液、純化后的ifn-γ蛋白、pet32-bl21(de3)大腸桿菌空載體表達(dá)的標(biāo)簽蛋白(標(biāo)簽蛋白)分別作為包被抗原，200ul/孔，包被后，4℃過夜，pbst(pbs與吐溫20以2000∶1混勻)洗滌3遍，加入細(xì)胞培養(yǎng)上清，以陰性小鼠血清作為陰性對(duì)照，100ul/孔，每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)，37℃孵育1h，pbst洗滌3遍，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體，1∶5000稀釋，100ul/孔，37℃孵育1h，pbst洗滌3遍，加入tmb顯色液，37℃孵育20min，加入終止液，置于酶標(biāo)儀檢測各孔o(hù)d450值，以s/p＞2.1為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)記并篩選含有陽性雜交瘤細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)孔。將篩選得到的陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行單克隆化培養(yǎng)，單克隆化培養(yǎng)采用有限稀釋法：首先，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行適當(dāng)稀釋；如取230個(gè)活細(xì)胞懸浮于4.6ml的培養(yǎng)液中，此時(shí)，平均每0.1ml溶液含有5個(gè)細(xì)胞，接種于96孔板，每孔0.1ml，共36孔；剩余1ml，再加4ml培養(yǎng)基，共5ml，此時(shí)，平均每0.1ml溶液含1個(gè)細(xì)胞，接種于其次的36孔，每孔0.1ml；最后剩余1.4ml，再補(bǔ)加1.4ml，共2.4ml，接種于剩余24孔，每孔0.1ml，此時(shí)每孔0.5個(gè)細(xì)胞。鋪板結(jié)束后，置于顯微鏡下，標(biāo)記出只含有一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)孔。5)制備小鼠腹水?dāng)U大培養(yǎng)單克隆化的雜交瘤細(xì)胞，制備小鼠腹水，操作如下：小鼠注射液體石蠟，一周后，每只小鼠注射105個(gè)細(xì)胞，約7-12天后，小鼠大量產(chǎn)生腹水，將抽取的腹水，3000rpm離心10min，去除上層油脂及下層沉淀，收集澄清的腹水，置于-80℃保存。試驗(yàn)例1單克隆抗體鑒定1)單克隆抗體亞型鑒定：亞型鑒定采用sigma公司的免疫球蛋白標(biāo)準(zhǔn)亞類鑒定試劑盒進(jìn)行鑒定，具體步驟按試劑盒的說明書操作。主要步驟如下：將待測細(xì)胞培養(yǎng)上清加入已包被抗原的酶標(biāo)板中，100ul/孔，室溫下作用2h，pbst洗滌3次。同型特異試劑igm、iga、igg1、igg2a、igg2b和igg3，分別用pbst緩沖液1000倍稀釋，100ul/孔，室溫作用30min，pbst洗滌3遍。辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊igg，用pbst以1∶2500稀釋，100ul/孔，室溫作用15min，pbst洗滌3遍。加入新配底物，100ul/孔，室溫下作用10-15min。用3mol/l的naoh終止反應(yīng)，50ul/孔，觀察結(jié)果。本發(fā)明單克隆抗體亞型為igg1。2)單克隆抗體效價(jià)測定取經(jīng)con-a刺激后的山羊淋巴細(xì)胞上清，200ul/孔，包被后，4℃過夜，pbst洗滌3遍，加入10倍連續(xù)稀釋的腹水，以陰性小鼠血清作為陰性對(duì)照，以pbst作為空白對(duì)照，100ul/孔，每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)，37℃孵育1～2h，pbst洗滌3遍，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體，1∶5000稀釋，100ul/孔，37℃孵育1h，pbst洗滌3遍，加入tmb顯色液，37℃孵育20min，加入終止液，置于酶標(biāo)儀檢測各孔o(hù)d450值，以s/p＞2.1為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)，以陽性反應(yīng)的最大稀釋度作為腹水的檢測效價(jià)。注：淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清效價(jià)檢測，將細(xì)胞培養(yǎng)上清倍比稀釋，其余方法同上。elisa檢測結(jié)果如下：細(xì)胞培養(yǎng)上清效價(jià)為29；小鼠腹水效價(jià)為108。細(xì)胞培養(yǎng)上清檢測結(jié)果：小鼠腹水檢測結(jié)果：3)單克隆抗體特異性鑒定分別以淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清，il-17重組蛋白、il-1β重組蛋白(本實(shí)驗(yàn)室制備)作為包被抗原，包被后，4℃過夜。pbst洗滌3遍，將小鼠腹水1∶1000稀釋后，100ul/孔，另設(shè)陰性血清、空白對(duì)照，孵育1～2h。pbst洗滌3遍，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠抗體，1∶5000稀釋，100ul/孔，孵育1h。pbst洗滌3遍，加入tmb顯色液，避光孵育20min。加入終止液100ul/孔，置于酶標(biāo)儀中檢測od450值。具體檢測結(jié)果如下：所得小鼠腹水僅特異性識(shí)別含有ifn-γ的淋巴上清，不識(shí)別il-17重組蛋白和il-1β重組蛋白。4)單克隆抗體靈敏度測定稱取原核表達(dá)的ifn-γ純化蛋白包被，使其包被濃度為1ug/孔，做3個(gè)重復(fù)，之后進(jìn)行2倍比稀釋，按照如上所述elisa檢測方法進(jìn)行操作，置于酶標(biāo)儀檢測各孔o(hù)d450值，以s/p＞2.1為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)，以陽性反應(yīng)的最大稀釋度作為小鼠腹水檢測的最低限度。靈敏度檢測結(jié)果如下：當(dāng)上清液稀釋比例為1∶210時(shí)，其od450值與陰性培養(yǎng)基od450值差異不顯著，則小鼠腹水的最低檢測限度為0.2％。小鼠腹水檢測結(jié)果：試驗(yàn)例2取淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液、血乳(確診嚴(yán)重乳房炎)、空白載體純化蛋白及rpmi1640不完全培養(yǎng)基，包被于96孔酶標(biāo)板上，200ul/孔，每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)，置于4℃，過夜。pbst洗滌3遍，將1∶1000稀釋的小鼠腹水加入各孔，100ul/孔，37℃孵育1～2h。pbst洗滌3遍，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體，1∶5000稀釋，100ul/孔，37℃孵育1h。pbst洗滌3遍，加入tmb顯色液，37℃避光孵育20min。加入終止液，置于酶標(biāo)儀檢測各孔o(hù)d450值，取樣品平均值與已知標(biāo)簽蛋白值進(jìn)行比較，所得結(jié)果如下：所檢樣品淋巴上清血乳培養(yǎng)基標(biāo)簽蛋白平均od450值1.0921.0990.0780.071結(jié)果判定：1號(hào)、2號(hào)樣品od450值顯著高于后者，說明淋巴上清和血乳中含有大量ifn-γ蛋白；而新鮮培養(yǎng)基和空白載體蛋白o(hù)d450值接近空白值，說明其不含有ifn-γ蛋白。當(dāng)前第1頁12