本發(fā)明屬于微生物學(xué)檢測(cè)方面的質(zhì)量控制領(lǐng)域，特別涉及一種藥品中霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)能力驗(yàn)證樣品及其制備方法。

背景技術(shù)：

藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域非常特殊。目前，雖然國(guó)內(nèi)外已有認(rèn)可機(jī)構(gòu)組織藥品微生物學(xué)能力驗(yàn)證的先例，但針對(duì)霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)樣品制備方法，以及均勻性和穩(wěn)定性研究的數(shù)據(jù)卻并不詳盡，即霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)樣品仍屬空白領(lǐng)域。

霉菌在自然界分布極廣，土壤、水域、空氣、動(dòng)植物體內(nèi)外都可生長(zhǎng)霉菌，霉菌和酵母也可造成中腐敗變質(zhì)。由于霉菌和酵母能抵抗熱、冷凍，以及抗菌素和輻照等貯藏及保藏技術(shù)，它們能轉(zhuǎn)換某些不利于細(xì)菌的物質(zhì)，而促進(jìn)致病細(xì)菌的生長(zhǎng)；有些霉菌能夠合成有毒代謝產(chǎn)物－霉菌毒素。如果制備的霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)樣品中，目標(biāo)菌群易發(fā)生變化(繁殖和死亡等)，就會(huì)導(dǎo)致樣品的保存期短，樣品的均勻性和穩(wěn)定性差。因此，綜合考慮細(xì)菌的生化特性，選取性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定的菌群作為目標(biāo)菌群對(duì)保證樣品的均勻性和穩(wěn)定性十分重要。霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)樣品制備的工藝技術(shù)要求比較高，并且樣品的均勻性和穩(wěn)定性與凍干的菌種、凍干的工藝條件、凍干保護(hù)劑的使用、再水化的介質(zhì)等均有密切的關(guān)系。

藥品中霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)指標(biāo)，直接反映著藥品的衛(wèi)生質(zhì)量與潛在致病風(fēng)險(xiǎn)。如果霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)數(shù)超過(guò)一定限量，會(huì)導(dǎo)致患者感染甚至有致命的風(fēng)險(xiǎn)。因此，制備均勻性與穩(wěn)定性俱佳的霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)樣品，可以避免霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)檢驗(yàn)的隨意性和不確定性，真實(shí)地反映檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的能力。這對(duì)提高實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制水平，保障藥品安全，甚至于打破國(guó)際貿(mào)易壁壘、提高我國(guó)藥品國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力都具有特殊重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)測(cè)定樣品中總的活的細(xì)菌數(shù)目在運(yùn)輸、儲(chǔ)存和測(cè)試等過(guò)程中菌落數(shù)都可發(fā)生變化的問(wèn)題，提供一種藥品中霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)能力驗(yàn)證樣品，均勻性、穩(wěn)定性符合能力驗(yàn)證要求，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供該樣品的制備方法，工藝簡(jiǎn)單，成功率高。

本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的所采用的技術(shù)方案是：藥品中霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)能力驗(yàn)證樣品，其特征是：包括目標(biāo)菌群與背景菌群，所述目標(biāo)菌群為藥品中或生產(chǎn)過(guò)程中易污染的霉菌和酵母菌，所述背景菌群由大腸埃希菌(e.coil)、肺炎克雷伯菌(klebsiellapnenmoniae)、金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、蠟樣芽胞桿菌(bacilluscereus)組成。

所述霉菌為黑曲霉(aspergillusnige)、酵母菌為釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)。

所述樣品以海藻糖、脫脂奶粉和無(wú)菌水為基質(zhì)，其中海藻糖的體積分?jǐn)?shù)為12％、脫脂奶粉的體積分?jǐn)?shù)為0.5％。

所述樣品中目標(biāo)菌群的目標(biāo)濃度為10²～10³cfu/ml，背景菌群的目標(biāo)濃度為10²cfu/ml。

一種藥品中霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)能力驗(yàn)證樣品的制備方法，其特征是：包括樣品添加菌株的選擇、凍干保護(hù)劑的配制、樣品凍干、樣品的均勻性和穩(wěn)定性試驗(yàn)四個(gè)步驟，其中樣品凍干過(guò)程為：菌株復(fù)蘇傳代—增菌—菌懸液配制—凍干和包裝—儲(chǔ)存，具體過(guò)程為：(1)菌株復(fù)蘇傳代

將標(biāo)準(zhǔn)菌株接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基中，在36±1℃下使其復(fù)蘇和生長(zhǎng)，并對(duì)復(fù)蘇的菌株進(jìn)行鑒定；

(2)增菌

目標(biāo)菌群培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末，背景菌群培養(yǎng)至穩(wěn)定期，從斜面刮取菌落，加到10ml的凍干保護(hù)劑中制成相應(yīng)單一菌種的菌液；

(3)菌懸液配制

將上一過(guò)程得到的菌液與凍干保護(hù)劑混合，按目標(biāo)菌群的目標(biāo)濃度10²～10³cfu/ml和背景菌群的目標(biāo)濃度10²cfu/ml配制菌懸液，分別配制2個(gè)目標(biāo)菌的菌懸液和4個(gè)背景菌的菌懸液，分別按1:1體積比混合形成目標(biāo)菌群懸液和背景菌群懸液，再將目標(biāo)菌群懸液與背景菌群懸液按1:1體積比混合，得到混合菌懸液，置于磁力攪拌器上不斷攪拌下分裝到樣品瓶中，加上瓶塞，但要留有空隙，不要蓋實(shí)；

(4)凍干和包裝

將裝有混合菌懸液的樣品瓶開蓋放入凍干機(jī)中，冷凍干燥40～50h，當(dāng)樣品冷凍干燥結(jié)束后，直接進(jìn)行箱內(nèi)加塞，關(guān)閉機(jī)器，樣品瓶中樣品為真空狀態(tài)；

(5)儲(chǔ)存

將樣品放置在-18℃條件下避光保存，從全部樣品中隨機(jī)挑選樣品進(jìn)行均勻性和穩(wěn)定性試驗(yàn)，滿足要求后發(fā)放給參試實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)。

所述凍干保護(hù)劑為含有海藻糖和脫脂奶粉的無(wú)菌水，其中體積分?jǐn)?shù)分別為：海藻糖12％、脫脂奶粉0.5％。

所述樣品的均勻性和穩(wěn)定性試驗(yàn)按照cnas—gl03《能力驗(yàn)證樣品均勻性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)指南》進(jìn)行。

本發(fā)明菌種的選擇采用黑霉菌、釀酒酵母作為霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)樣品的目標(biāo)菌群，以大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌作為背景菌群。以黑霉菌、釀酒酵母作為目標(biāo)菌群，可以最大程度保證測(cè)試樣品的穩(wěn)定性，即使在運(yùn)輸及儲(chǔ)存中大腸埃希菌的含量發(fā)生變化，在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上也不會(huì)影響霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)的總量。

本發(fā)明的霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)能力驗(yàn)證樣品具有以下優(yōu)勢(shì)特性：活的微生物、數(shù)量不發(fā)生變化、生化特征不發(fā)生變異，從滿足特殊運(yùn)輸?shù)臈l件著手，通過(guò)特殊工藝的研究、穩(wěn)定性和均勻性的研究等形成一套完善的能力驗(yàn)證的樣品制備技術(shù)，完全適合開展藥品中霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)(定量)項(xiàng)目的考核，正確評(píng)價(jià)能力驗(yàn)證結(jié)果。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明工藝流程圖。

圖2為4℃條件下樣品霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果圖。

圖3為在不同溫度下樣品的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述，但本發(fā)明并不局限于具體實(shí)施例。

實(shí)施例1

藥品中霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)能力驗(yàn)證樣品，包括目標(biāo)菌群與背景菌群，所述目標(biāo)菌群由黑曲霉(aspergillusnige)、釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)組成，所述背景菌群由大腸埃希菌(e.coil)、肺炎克雷伯菌(klebsiellapnenmoniae)、金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、蠟樣芽胞桿菌(bacilluscereus)組成。

所述樣品以海藻糖、脫脂奶粉和無(wú)菌水為基質(zhì)，其中海藻糖體積分?jǐn)?shù)為12％、脫脂奶粉體積分?jǐn)?shù)為0.5％。

所述樣品中目標(biāo)菌群的濃度為10²～10³cfu/ml，背景菌群的濃度為10²cfu/ml。

實(shí)施例2

如圖1所示，一種實(shí)施例1中藥品中霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)能力驗(yàn)證樣品的制備方法，包括樣品添加菌株的選擇、凍干保護(hù)劑的配制、樣品凍干、樣品的均勻性和穩(wěn)定性試驗(yàn)四個(gè)步驟，具體步驟如下：

1、樣品添加菌株的選擇

按照目標(biāo)菌群：黑曲霉(aspergillusnige)、釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)，背景菌群：大腸埃希菌(e.coil)、肺炎克雷伯菌(klebsiellapnenmoniae)、金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、蠟樣芽胞桿菌(bacilluscereus)選擇標(biāo)準(zhǔn)菌株，所有標(biāo)準(zhǔn)菌株均購(gòu)于政府指定的機(jī)構(gòu)，并附有菌株證書，保證了菌株的溯源性。

2、凍干保護(hù)劑的配制

樣品以海藻糖、脫脂奶粉和無(wú)菌水為基質(zhì)(體積分?jǐn)?shù)：海藻糖12％，脫脂奶粉0.5％)配制凍干保護(hù)劑。

3、樣品凍干

(1)菌株復(fù)蘇傳代

將標(biāo)準(zhǔn)菌株接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，在36±1℃下使其復(fù)蘇和生長(zhǎng)，并對(duì)復(fù)蘇的菌株進(jìn)行鑒定；

(2)增菌

目標(biāo)菌群培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末，背景菌群培養(yǎng)至穩(wěn)定期，從斜面刮取菌落，得到含有相應(yīng)單一菌種的菌液；

(3)菌懸液配制

將上一過(guò)程得到的菌液與凍干保護(hù)劑混合，按目標(biāo)菌群的目標(biāo)濃度10²～10³cfu/ml和背景菌群的目標(biāo)濃度10²cfu/ml配制菌懸液。為保證得到的最終樣品中含有以上目標(biāo)濃度的菌株，本實(shí)施例中按照目標(biāo)菌10³cfu/ml分別配制2個(gè)目標(biāo)菌的菌懸液，按1:1體積比混合，形成目標(biāo)菌群懸液；背景菌按10²cfu/ml配制4個(gè)背景菌的菌懸液，按1:1體積比混合，形成背景菌群懸液；背景菌群懸液與目標(biāo)菌群懸液按1:1體積比混合，得到混合菌懸液，采用比濁法檢查菌株含量；置于磁力攪拌器上不斷攪拌下取1.0ml分裝到樣品瓶(西林瓶)中，加上瓶塞，但要留有空隙，不要蓋實(shí)；

(4)凍干和包裝

將裝有混合菌懸液的樣品瓶開蓋放入凍干機(jī)中，冷凍干燥機(jī)參數(shù)按如下設(shè)置：

冷凍速度(coolingrate)0.5℃/min

早期冷凍點(diǎn)(incipientfreezingpoint)-1℃15min

冷凍溫度(coolingtemperature)-40℃

共熔點(diǎn)(meltingpointeutectictemperature)-29℃

加熱溫度(heatingtemperature)20℃120min

啟動(dòng)冷凍干燥機(jī)，機(jī)器直接進(jìn)入程序化的冷凍干燥過(guò)程，整個(gè)凍干過(guò)程40h；

當(dāng)樣品冷凍干燥結(jié)束后，直接進(jìn)行箱內(nèi)加塞；關(guān)閉機(jī)器。剔除塞子不緊的西林瓶，西林瓶中樣品為真空狀態(tài)；

(5)儲(chǔ)存

將樣品放置在-18℃條件下避光保存，并對(duì)保存的樣品進(jìn)行適當(dāng)管理和檢測(cè)，從全部樣品中隨機(jī)挑選樣品進(jìn)行均勻性和穩(wěn)定性試驗(yàn)，滿足要求后發(fā)放給參試實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)。

4、樣品的均勻性和穩(wěn)定性試驗(yàn)

對(duì)樣品中目標(biāo)菌的均勻性和穩(wěn)定性檢查是驗(yàn)證樣品制備過(guò)程有效性的主要方法。檢查樣品均勻性和穩(wěn)定性按照cnas—gl03《能力驗(yàn)證樣品均勻性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)指南》進(jìn)行。

所得樣品均勻性和穩(wěn)定性檢測(cè)方法及結(jié)果如下：

分別隨機(jī)選取12個(gè)樣品，采用中國(guó)藥典2015年版四部通則1105非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法，在重復(fù)條件測(cè)試2×12份樣品的霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)。結(jié)果數(shù)據(jù)用單因素方差分析(anov)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，統(tǒng)計(jì)步驟及結(jié)果如下：

表1方差分析公式

上表中，

表2樣品均勻性檢測(cè)結(jié)果

表3樣品均勻性試驗(yàn)方差分析結(jié)果

結(jié)論：在95％置信概率下，與其他因素對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響相比，樣品的不均勻性是可接受的。

采用兩種類型的穩(wěn)定性試驗(yàn)：一種是在短期貯存溫度(4℃)下的穩(wěn)定性試驗(yàn)，另一種是在高的溫度(模擬樣品的運(yùn)輸條件)下的穩(wěn)定性試驗(yàn)，選用三個(gè)溫度點(diǎn)，分別為20℃、36℃和45℃。定期檢測(cè)樣品，針對(duì)不同溫度點(diǎn)不同的保存時(shí)間測(cè)試3個(gè)樣本，將2×3份樣品結(jié)果的均值(對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化后)與均勻性測(cè)試結(jié)果比較，之間的絕對(duì)差值除以測(cè)試計(jì)劃中能力評(píng)價(jià)用穩(wěn)健標(biāo)準(zhǔn)差s^*，比值小于0.3為原則確定在不同溫度條件下符合能力驗(yàn)證樣品要求的最長(zhǎng)保存時(shí)間。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2和圖3。

實(shí)施例3

本實(shí)施例中所述的藥品中霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)能力驗(yàn)證樣品的制備方法的各步驟均與實(shí)施例2中相同，不同的技術(shù)參數(shù)為：菌株培養(yǎng)基選用營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基；菌懸液配制中，目標(biāo)菌群懸液中各目標(biāo)菌的濃度按照5×10³cfu/ml配制，背景菌群懸液中各背景菌的濃度按照10³cfu/ml配制；凍干過(guò)程45h。

實(shí)施例4

本實(shí)施例中所述的藥品中霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)能力驗(yàn)證樣品的制備方法的各步驟均與實(shí)施例3中相同，不同的技術(shù)參數(shù)為：菌懸液配制中，目標(biāo)菌群懸液中各目標(biāo)菌的濃度按照4.5×10³cfu/ml配制；凍干過(guò)程50h。