本發(fā)明涉及一種純化
技術(shù)領(lǐng)域：
，且特別涉及一種細(xì)胞色素c及其精制方法。
背景技術(shù)：
：細(xì)胞色素是各種生物體中都很常見的蛋白質(zhì)，它是一類含有鐵卟啉基團(tuán)的電子傳遞蛋白，只存在于缺氧細(xì)胞中，廣泛存在于真核生物的線粒體內(nèi)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，植物的葉綠體中，以及光合成微生物和細(xì)菌中。細(xì)胞色素在線粒體內(nèi)膜上起傳遞電子的作用。細(xì)胞色素c是細(xì)胞色素中的一種，它在線粒體呼吸鏈上位于細(xì)胞色素b和細(xì)胞色素氧化酶之間，是呼吸鏈的一種重要的組成部分。每分子細(xì)胞色素c含有一個血紅素和一條多肽鏈，細(xì)胞色素c是一種穩(wěn)定的可溶性蛋白，它易溶于水及酸性溶液。在酶存在的情況下，細(xì)胞色素c對組織的氧化、還原有迅速的酶促作用。通常外源性細(xì)胞色素c不能進(jìn)入健康細(xì)胞，但在缺氧時，細(xì)胞膜的通透性增加，細(xì)胞色素c可用于組織缺氧的急救和輔助用藥，如一氧化碳中毒、催眠藥中毒、新生兒窒息、嚴(yán)重休克缺氧、麻醉及肺部疾病引起的呼吸困難、高山缺氧、腦缺氧、心臟病引起的缺氧等。目前，臨床上應(yīng)用的細(xì)胞色素c主要是從動物臟器或者酵母中分離純化而得。制備過程復(fù)雜，制備的細(xì)胞色素c產(chǎn)品純度不夠高，易發(fā)生動物過敏反應(yīng)。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種細(xì)胞色素c的制備方法，此細(xì)胞色素c的制備方法制備過程簡單，條件溫和，制備得到的細(xì)胞色素c純度高，具有較大的工業(yè)生產(chǎn)前景。本發(fā)明的另一目的在于提供一種細(xì)胞色素c，通過上述的細(xì)胞色素c的制備方法制備而得，此細(xì)胞色素c的純度高。本發(fā)明解決其技術(shù)問題是采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的。本發(fā)明提出一種細(xì)胞色素c的精制方法，其包括：將溶脹后的交聯(lián)葡聚糖凝膠置入層析柱內(nèi)；用緩沖液平衡層析柱使得流出液的ph值和電導(dǎo)率與上柱的緩沖液的ph值和電導(dǎo)率一致；調(diào)節(jié)細(xì)胞色素c的粗品溶液的ph值至與緩沖液的ph值一致后過濾得到澄清的上樣液；將上樣液過柱，并用注射用水進(jìn)行洗脫作業(yè)，當(dāng)流穿液變紅時開始收集流穿液直至流穿液變?yōu)闊o色；將收集到的流穿液依次進(jìn)行透析以及過濾。本發(fā)明提出一種細(xì)胞色素c，通過上述的細(xì)胞色素c的精制方法制得。本發(fā)明實施例的一種細(xì)胞色素c及其精制方法有益效果是：本發(fā)明提供的細(xì)胞色素c主要通過凝膠層析技術(shù)制得，凝膠層析技術(shù)的優(yōu)點主要通過以下幾方面進(jìn)行體現(xiàn)：1)凝膠層析操作簡單，只需將溶脹后的凝膠裝入層析柱后再用緩沖液進(jìn)行過柱處理就能制得，相比現(xiàn)有技術(shù)的制備方法，此制備方法更加的簡單便捷。2)凝膠層析的設(shè)備簡單，僅僅需要一根層析柱就能進(jìn)行。3)凝膠層析的分離效果好，通過緩沖液過柱、上樣液的過柱以及洗脫作業(yè)能使得溶液中不同分子量組分得到有效地分離，從而提高細(xì)胞色素c的純度。4)凝膠層析的重復(fù)性高，樣品的回收率高，凝膠層析是在層析柱中進(jìn)行的，此層析柱經(jīng)過消毒殺菌后能多次重復(fù)利用。同時，利用sephadex進(jìn)行分離作業(yè)，sephadex本身又是一種不帶電荷的惰性載體，不與溶質(zhì)發(fā)生相互作用，進(jìn)一步提高了層析的重復(fù)性。并且，層析柱為作業(yè)主要進(jìn)行的場所，經(jīng)過層析柱后的樣品均能被回收，因此樣品的回收率得到提高。5)凝膠層析的分離條件溫和，大多都在中性條件下進(jìn)行的。具體實施方式為使本發(fā)明實施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。下面對本發(fā)明實施例的一種細(xì)胞色素c及其精制方法進(jìn)行具體說明。一種細(xì)胞色素c的精制方法，其包括：將溶脹后的交聯(lián)葡聚糖凝膠置入層析柱內(nèi)；用緩沖液平衡層析柱使得流出液的ph值和電導(dǎo)率與上柱的緩沖液的ph值和電導(dǎo)率一致；調(diào)節(jié)細(xì)胞色素c的粗品溶液的ph值至與緩沖液的ph值一致后過濾得到澄清的上樣液；將上樣液過柱，并用注射用水進(jìn)行洗脫作業(yè)，當(dāng)流穿液變紅時開始收集流穿液直至流穿液變?yōu)闊o色；將收集到的流穿液依次進(jìn)行透析以及過濾。具體地，將溶脹后的交聯(lián)葡聚糖凝膠置入層析柱內(nèi)。其中，溶脹是高分子聚合物在溶劑中體積發(fā)生膨脹的現(xiàn)象。聚合物溶解時必須先經(jīng)過吸收溶劑從而使聚合物膨脹的過程。聚合物溶解時先溶脹的原因是：1.聚合物蜷曲的形狀能提供溶劑分子擴(kuò)散進(jìn)去的空間；2.溶劑分子較小，擴(kuò)散速度較快，在聚合物擴(kuò)散至溶劑中引起它溶解之前，溶劑分子已擴(kuò)散到聚合物分子間引起它的溶脹。并且，溶劑可以選擇為乙醇，乙醇較為環(huán)保，殘留在聚合物上的乙醇可揮發(fā)，不會帶入多于的雜質(zhì)。當(dāng)然，在本發(fā)明的其他實施例中，溶劑可以根據(jù)具體地需求進(jìn)行相應(yīng)地選擇，例如可以選擇為蒸餾水等，本發(fā)明不做限定。其中，交聯(lián)葡聚糖凝膠的商品名為sephadex，不同規(guī)格型號的葡聚糖用英文字母g表示，g后面的阿拉伯?dāng)?shù)為凝膠得水值的10倍。例如，g-25為每克凝膠膨脹時吸水2.5克，同樣g-200為每克干膠吸水20克。交聯(lián)葡聚糖凝膠的種類有g(shù)-10、g-15、g-25、g-50、g-75、g-100、g-150、和g-200。因此，"g"反映，凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分布范圍。在本發(fā)明的實施例中，交聯(lián)葡聚糖凝膠包括sephadexg-75、sephadexg-100、sephadexg-150、sephadexg-200中的任一種。sephadexg-75分離范圍3000-80000適用于蛋白分離純化、分子量測定、平衡常數(shù)測定。sephadexg-100分離范圍4000-150000適用于蛋白分離純化、分子量測定、平衡常數(shù)測定。sephadexg-150的分離范圍5000-300000適用于蛋白分離純化、分子量測定、平衡常數(shù)測定。sephadexg-200的分離范圍5000-600000適用于蛋白分離純化、分子量測定、平衡常數(shù)測定。換言之，sephadexg-75、sephadexg-100、sephadexg-150以及sephadexg-200的交聯(lián)度相對較小，吸液量大，凝膠的孔徑大，分離限大，凝膠的強(qiáng)度小，更有利于細(xì)胞色素c的提純。當(dāng)然，在本發(fā)明的其他實施例中，可以根據(jù)需求調(diào)整交聯(lián)葡聚糖凝膠的種類，本發(fā)明不做限定。其中，層析柱是凝膠層析技術(shù)中的主體，一般用玻璃管或有機(jī)玻璃管。將溶脹后的交聯(lián)葡聚糖凝膠置入層析柱內(nèi)的過程稱為裝柱，裝柱是一次性置入柱內(nèi)，一次性置入避免了柱內(nèi)產(chǎn)生氣體或斷層。當(dāng)然，在本發(fā)明的其他實施例中，裝柱的具體步驟可以根據(jù)需求進(jìn)行調(diào)整，本發(fā)明不做限定。在本發(fā)明的實施例中，層析柱的柱比為25～100:1，在此柱比下，細(xì)胞色素c中分子量相差不大的大分子物質(zhì)可以得到有效地分離，從而達(dá)到進(jìn)一步地精制。當(dāng)然，在本發(fā)明的其他實施例中，柱比可以根據(jù)需求進(jìn)行調(diào)整。具體地，用緩沖液平衡層析柱使得流出液的ph值和電導(dǎo)率與上柱的緩沖液的ph值和電導(dǎo)率一致。其中，緩沖液是使得層析柱內(nèi)介質(zhì)的保持物理與化學(xué)平衡的一類物質(zhì)。在本發(fā)明的實施例中，緩沖液包括磷酸鹽緩沖液、tris緩沖液、hepes緩沖液、tes緩沖液以及mops緩沖液中的任一種。磷酸鹽緩沖液是常用的用于生物學(xué)研究的一個緩沖溶液。有助于保持恒定的ph值和電導(dǎo)率。tris緩沖液中的tris為弱堿，在25℃下，它的pka為8.1；根據(jù)緩沖理論，tris緩沖液的有效緩沖范圍在ph7.0到9.2之間，tris緩沖液能有效地維持層析柱內(nèi)的ph值和電導(dǎo)率。mops緩沖液是一類生物緩沖劑，有助于保持恒定的ph值和電導(dǎo)率。其中，利用緩沖液平衡層析柱至少需要3～5個柱體積，柱體積為凝膠樁柱后，從柱的底板到凝膠沉積表面的體積。經(jīng)過3～5個柱體積的緩沖液平衡至基線變得平穩(wěn)，并且流出液的ph值和電導(dǎo)率與上柱的緩沖液的ph值和電導(dǎo)率一致。當(dāng)然，在本發(fā)明的其他實施例中，緩沖液的用量可以根據(jù)具體情況進(jìn)行相應(yīng)地調(diào)整，本發(fā)明不做限定。具體地，調(diào)節(jié)細(xì)胞色素c的粗品溶液的ph值和電導(dǎo)率至與緩沖液的ph值和電導(dǎo)率一致后過濾得到澄清的上樣液。在本發(fā)明的實施例中，調(diào)節(jié)ph是采用0.1～0.2m的鹽酸進(jìn)行的。細(xì)胞色素c的粗品溶液與緩沖液的ph一致，標(biāo)志著粗品溶液的ph與凝膠的ph相同，這樣上樣液進(jìn)行過柱時，細(xì)胞色素c中的雜質(zhì)的分離的效果更好。當(dāng)然，在本發(fā)明的其他實施例中，也可以采用其他試劑對ph進(jìn)行調(diào)節(jié)，例如可以為醋酸等，本發(fā)明不做限定。其中，細(xì)胞色素c的粗品溶液的體積為凝膠體積的5～6％，這個比例的凝膠與細(xì)胞色素c能充分的作用，能減少凝膠的浪費，使得凝膠充分發(fā)揮作用。鹽酸的濃度為0.1～0.2mol/l。當(dāng)然，在本發(fā)明的其他實施例中，細(xì)胞色素c的粗品溶液的具體用量與鹽酸的濃度都可以根據(jù)需求進(jìn)行調(diào)整，只要保證調(diào)節(jié)至與緩沖液相同的ph值和電導(dǎo)率即可，本發(fā)明不做限定。其中，澄清的上樣液通過濾孔尺寸為0.3～0.5μm第一濾膜過濾得到。濾膜是是處理溶液中溶質(zhì)的分離和增濃，也常用于膠狀懸浮液的分離，其應(yīng)用領(lǐng)域在不斷擴(kuò)大。在膜的一側(cè)施以適當(dāng)壓力，就能篩出小于孔徑的溶質(zhì)分子，以分離分子量大于500道爾頓(原子質(zhì)量單位)、粒徑大于10納米的顆粒。經(jīng)過濾膜過濾后的上樣液中的大顆粒雜質(zhì)被過濾掉，間接地提高了細(xì)胞色素c的粗品溶液的純度。當(dāng)然，在本發(fā)明的其他實施例中，濾孔的尺寸可以根據(jù)需求進(jìn)行調(diào)整，本發(fā)明不做限定。具體地，將上樣液過柱，并用注射用水進(jìn)行洗脫作業(yè)，在流穿液變紅至變?yōu)闊o色的過程中收集流穿液。過柱是指將液體流過層析柱的行為。流穿液從變紅后直至變?yōu)闊o色過程中，被分離后的細(xì)胞色素c得以完全地被收集。其中，上樣液以2～4ml/min的速度過柱，流速低，洗脫峰窄，從而增加了分辨率。有顏色的細(xì)胞色素c的粗品經(jīng)過凝膠樹脂后各部分得到有效地分離。當(dāng)然，在本發(fā)明的其他實施例中，流速也可以根據(jù)需求進(jìn)行選擇，本發(fā)明不做限定。作為優(yōu)選的方案，上樣液可以采用勻速過柱，勻速過柱可避免氣泡或斷層的產(chǎn)生。其中，注射用水指符合中國藥典注射用水項下規(guī)定的水。注射用水以2～4ml/min的速度過柱，流速低，洗脫峰窄，進(jìn)一步增加了分辨率。為蒸餾水或去離子經(jīng)蒸餾所得的水，故又稱重蒸餾水。注射用水能有效控制微生物污染且同時控制細(xì)菌內(nèi)毒素的水平。各部分得到有效分離后的細(xì)胞色素c的粗品經(jīng)過注射用水洗脫后的得到完全的分離純化細(xì)胞色素c精品。具體地，將收集到的流穿液依次進(jìn)行透析以及過濾。其中，流穿液用5kd膜透析至溶液電導(dǎo)率小于500μs。5kd膜的截流率小，截流的的效果更好，當(dāng)溶液的電導(dǎo)率小于500μs時，標(biāo)志著溶液當(dāng)中的雜質(zhì)離子被去除干凈，從而保證了純化的效果。其中，過濾是通過濾孔尺寸為0.2～0.3μm的第二濾膜進(jìn)行的。采用比第一濾膜的濾孔尺寸更小的第二濾膜能有效地去除第一濾膜未去除的雜質(zhì)，提高分離效果與純化度。進(jìn)一步地，在本發(fā)明的較佳實施例中，細(xì)胞色素c的精制方法還包括在用緩沖液平衡層析柱之前用0.1～2.0m的naoh溶液以2～4ml/min的流速沖洗放入層析柱內(nèi)的交聯(lián)葡聚糖凝膠4～24h后，再以2～4ml/min的流速用注射用水洗滌至層析柱內(nèi)的ph為7～8。此步驟主要是對凝膠樹脂的處理，一方面使得凝膠樹脂的層析分離效果更加好，另一方面減小了上樣液的負(fù)擔(dān)，減小了ph對于分離提純的影響。當(dāng)然，在本發(fā)明的其他實施例中，細(xì)胞色素c的精制方法還可以包括其他步驟，例如將過濾后得到的流穿液進(jìn)行冷凍以及干燥處理等。進(jìn)行冷凍干燥處理能有效地抑制細(xì)菌增長與繁殖，便于精品的細(xì)胞色素c的保存與工業(yè)化利用。一種細(xì)胞色素c，通過此細(xì)胞色素c的精制方法制得。以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的特征和性能作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。實施例1本實施例提供了一種細(xì)胞色素c，通過以下方法精制得到：將溶脹后的sephadexg-75置入層析柱內(nèi)；用pbs緩沖液平衡層析柱使得流出液的ph值和電導(dǎo)率與上柱的緩沖液的ph值和電導(dǎo)率一致；用0.1m鹽酸調(diào)節(jié)細(xì)胞色素c的粗品溶液的ph至與緩沖液的ph值一致后用濾孔尺寸為0.3μm的第一濾膜過濾得到澄清的上樣液；將上樣液以2ml/min的速度勻速過柱，并用注射用水以2ml/min的速度進(jìn)行洗脫作業(yè)，當(dāng)流穿液變紅時開始收集流穿液直至流穿液變?yōu)闊o色；將收集到的流穿液依次進(jìn)行透析以及過濾，透析是用5kd膜透析至溶液電導(dǎo)率為500μs。過濾是通過濾孔尺寸為0.2μm的第二濾膜進(jìn)行的。實施例2本實施例提供了一種細(xì)胞色素c，與實施例1提供的細(xì)胞色素c的區(qū)別在于，本實施例提供的細(xì)胞色素c通過以下方法精制得到：將溶脹后的sephadexg-100置入層析柱內(nèi)；用tris緩沖液平衡層析柱使得流出液的ph值和電導(dǎo)率與上柱的緩沖液的ph值和電導(dǎo)率一致；用0.15m鹽酸調(diào)節(jié)細(xì)胞色素c的粗品溶液的ph至與緩沖液的ph值一致后用濾孔尺寸為0.45μm的第一濾膜過濾得到澄清的上樣液；將上樣液以3ml/min的速度勻速過柱，并用注射用水以3ml/min的速度進(jìn)行洗脫作業(yè)，當(dāng)流穿液變紅時開始收集流穿液直至流穿液變?yōu)闊o色；將收集到的流穿液依次進(jìn)行透析以及過濾，透析是用5kd膜透析至溶液電導(dǎo)率為480μs。過濾是通過濾孔尺寸為0.22μm的第二濾膜進(jìn)行的。實施例3本實施例提供了一種細(xì)胞色素c，與實施例1提供的細(xì)胞色素c的區(qū)別在于，本實施例提供的細(xì)胞色素c通過以下方法精制得到：將溶脹后的sephadexg-150置入層析柱內(nèi)；用tris緩沖液平衡層析柱使得流出液的ph值和電導(dǎo)率與上柱的緩沖液的ph值和電導(dǎo)率一致；用0.2m鹽酸調(diào)節(jié)細(xì)胞色素c的粗品溶液的ph至與緩沖液的ph值一致后用濾孔尺寸為0.5μm的第一濾膜過濾得到澄清的上樣液；將上樣液以4ml/min的速度勻速過柱，并用注射用水以4ml/min的速度進(jìn)行洗脫作業(yè)，當(dāng)流穿液變紅時開始收集流穿液直至流穿液變?yōu)闊o色；將收集到的流穿液依次進(jìn)行透析以及過濾，透析是用5kd膜透析至溶液電導(dǎo)率為470μs。過濾是通過濾孔尺寸為0.3μm的第二濾膜進(jìn)行的。實施例4本實施例提供了一種細(xì)胞色素c，與實施例1提供的細(xì)胞色素c的區(qū)別在于，本實施例提供的細(xì)胞色素c通過以下方法精制得到：將溶脹后的sephadexg-150置入層析柱內(nèi)；用0.1m的naoh溶液以2ml/min的流速沖洗放入層析柱內(nèi)的sephadexg-1504h后，再以2ml/min的流速用注射用水洗滌至層析柱內(nèi)的ph為7。用tris緩沖液平衡層析柱使得流出液的ph值和電導(dǎo)率與上柱的緩沖液的ph值和電導(dǎo)率一致；用0.1m鹽酸調(diào)節(jié)細(xì)胞色素c的粗品溶液的ph至與緩沖液的ph值一致后用濾孔尺寸為0.45μm的第一濾膜過濾得到澄清的上樣液；將上樣液以2ml/min的速度勻速過柱，并用注射用水以2ml/min的速度進(jìn)行洗脫作業(yè)，當(dāng)流穿液變紅時開始收集流穿液直至流穿液變?yōu)闊o色；將收集到的流穿液依次進(jìn)行透析以及過濾，透析是用5kd膜透析至溶液電導(dǎo)率為460μs。過濾是通過濾孔尺寸為0.22μm的第二濾膜進(jìn)行的。實施例5本實施例提供了一種細(xì)胞色素c，與實施例1提供的細(xì)胞色素c的區(qū)別在于，本實施例提供的細(xì)胞色素c通過以下方法精制得到：將溶脹后的sephadexg-200置入層析柱內(nèi)；用0.15m的naoh溶液以3ml/min的流速沖洗放入層析柱內(nèi)的sephadexg-20010h后，再以3ml/min的流速用注射用水洗滌至層析柱內(nèi)的ph為7.5。用tris緩沖液平衡層析柱使得流出液的ph值和電導(dǎo)率與上柱的緩沖液的ph值和電導(dǎo)率一致；用0.1m鹽酸調(diào)節(jié)細(xì)胞色素c的粗品溶液的ph至與緩沖液的ph值一致后用濾孔尺寸為0.45μm的第一濾膜過濾得到澄清的上樣液；將上樣液以2ml/min的速度勻速過柱，并用注射用水以2ml/min的速度進(jìn)行洗脫作業(yè)，當(dāng)流穿液變紅時開始收集流穿液直至流穿液變?yōu)闊o色；將收集到的流穿液依次進(jìn)行透析以及過濾，透析是用5kd膜透析至溶液電導(dǎo)率為455μs。過濾是通過濾孔尺寸為0.22μm的第二濾膜進(jìn)行的。實施例6本實施例提供了一種細(xì)胞色素c，與實施例1提供的細(xì)胞色素c的區(qū)別在于，本實施例提供的細(xì)胞色素c通過以下方法精制得到：將溶脹后的sephadexg-200置入層析柱內(nèi)；用0.2m的naoh溶液以4ml/min的流速沖洗放入層析柱內(nèi)的sephadexg-20024h后，再以4ml/min的流速用注射用水洗滌至層析柱內(nèi)的ph為8。用tris緩沖液平衡層析柱使得流出液的ph值和電導(dǎo)率與上柱的緩沖液的ph值和電導(dǎo)率一致；用0.1m鹽酸調(diào)節(jié)細(xì)胞色素c的粗品溶液的ph至與緩沖液的ph值一致后用濾孔尺寸為0.45μm的第一濾膜過濾得到澄清的上樣液；將上樣液以2ml/min的速度勻速過柱，并用注射用水以2ml/min的速度進(jìn)行洗脫作業(yè)，當(dāng)流穿液變紅時開始收集流穿液直至流穿液變?yōu)闊o色；將收集到的流穿液依次進(jìn)行透析以及過濾，透析是用5kd膜透析至溶液電導(dǎo)率為450μs。過濾是通過濾孔濾孔尺寸為0.22μm的第二濾膜進(jìn)行的。實驗例1將實施例1～6所制備的細(xì)胞色素c提供在相同情況下用高相液相色譜法進(jìn)行純度測試，測試結(jié)果如表1所示。表1.純度測試結(jié)果編號純度(％)實施例197實施例297實施例398實施例499實施例5100實施例6100根據(jù)表1所示的數(shù)據(jù)可知，本發(fā)明的實施例提供的精制后的細(xì)胞色素c的純度均較高。由此可知，通過本發(fā)明實施例提供的精制方法，可以有效地提高細(xì)胞色素c的純度。以上所描述的實施例是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。本發(fā)明的實施例的詳細(xì)描述并非旨在限制要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍，而是僅僅表示本發(fā)明的選定實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。當(dāng)前第1頁12