本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種磁性聯(lián)合交聯(lián)酶聚集體生物催化劑及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

(r)-3-奎寧醇(分子式c7h13no，分子量為127.18，cas號(hào)：25333-42-0)是合成阿地溴銨、索利那新和瑞伐托酯等藥物的關(guān)鍵性手性中間體。目前工業(yè)上主要是利用手性催化劑，如：xylskewphos/pica-ruthenium(ii)復(fù)合物或binap/iphan-ru(ii)復(fù)合物等，不對(duì)稱還原3-奎寧酮合成(r)-3-奎寧醇，但該化學(xué)合成方法需篩選手性配體；所使用的過(guò)渡金屬價(jià)格昂貴、毒性較大、難以從產(chǎn)物中去除；而且制備的產(chǎn)物光學(xué)純度較低，需進(jìn)一步純化。另一種方法是外消旋拆分，該方法的缺陷在于其理論產(chǎn)率最大只有50％。

相對(duì)于化學(xué)合成方法，基于酶的生物合成法具有底物特異性；高度化學(xué)選擇性、區(qū)域選擇性和立體選擇性；反應(yīng)條件溫和；催化活性高；原子經(jīng)濟(jì)性好等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。生物方法合成(r)-3-奎寧醇涉及兩個(gè)過(guò)程：一是借助羰基還原酶利用nadh或nadph將3-奎寧酮還原為(r)-3-奎寧醇；二是借助輔酶再生酶將氧化型nad⁺或nadp⁺轉(zhuǎn)化為還原型nadh或nadph，實(shí)現(xiàn)雙酶偶聯(lián)不對(duì)稱還原合成(r)-3-奎寧醇。具體過(guò)程如下：

生物催化不對(duì)稱還原合成(r)-3-奎寧醇過(guò)程

無(wú)論是用野生型微生物全細(xì)胞還是重組微生物全細(xì)胞作為生物催化劑，由于細(xì)胞本身結(jié)構(gòu)的限制，致使底物/產(chǎn)物、輔酶在細(xì)胞內(nèi)外擴(kuò)散受阻，導(dǎo)致生物轉(zhuǎn)化時(shí)間長(zhǎng)、催化效率低。而游離酶被認(rèn)為是化學(xué)工業(yè)合成中最為有效的手性催化合成工具之一。但在實(shí)際的生產(chǎn)應(yīng)用過(guò)程中，由于酶生物催化劑脫離酶所依賴的自然環(huán)境，致使其穩(wěn)定性降低、催化活性低。盡管通過(guò)定向進(jìn)化、基因重排和定點(diǎn)突變等生物分子工程技術(shù)能改善酶的穩(wěn)定性和催化活性，但技術(shù)難道大、酶純化成本高、回收過(guò)程復(fù)雜、易致產(chǎn)品污染、難以循環(huán)利用等問(wèn)題嚴(yán)重阻礙了酶的商業(yè)化以及在工業(yè)領(lǐng)域的催化應(yīng)用。

酶固定化技術(shù)既能有效克服游離酶生物催化劑的缺陷，又能提高酶的穩(wěn)定性和催化活性，易于從反應(yīng)混合物中分離和循環(huán)再利用，實(shí)現(xiàn)連續(xù)反應(yīng)，降低生產(chǎn)成本(robertdicosimo,josephmcauliffe,ayrookaranj.poulosebandgregorybohlmann,industrialuseofimmobilizedenzymes,chem.soc.rev.,2013,42,6437-6474)。但基于載體的物理吸附、化學(xué)鍵結(jié)合和包埋等酶固定化方法：需使用高純度的酶，致使生產(chǎn)成本增加；需使用無(wú)催化活性的載體，導(dǎo)致酶的體積活性、時(shí)空產(chǎn)率和催化產(chǎn)率降低?；跓o(wú)載體的交聯(lián)酶聚集體(cleas)是一種快速、簡(jiǎn)單和低成本的固定化方法：無(wú)需高純度酶，生產(chǎn)成本降低；能直接從發(fā)酵液中一步實(shí)現(xiàn)純化和固定化單酶(完成一步反應(yīng))或多酶(完成級(jí)聯(lián)反應(yīng))；能提高酶的長(zhǎng)期操作穩(wěn)定性和催化活性；能循環(huán)再利用。但是cleas質(zhì)軟、機(jī)械性能差、易聚集成塊、難以過(guò)濾回收，這些缺陷都阻礙了cleas的工業(yè)化應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的問(wèn)題，根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明的目的在于提供一種磁性聯(lián)合交聯(lián)酶聚集體(combi-cleas)生物催化劑，該生物催化劑能用于催化級(jí)聯(lián)反應(yīng)、長(zhǎng)期操作穩(wěn)定性好、催化活性高、易于磁分離和可循環(huán)再利用。

本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：

一種磁性聯(lián)合交聯(lián)酶聚集體生物催化劑，包含nadh依賴的3-奎寧酮還原酶(qnr)、葡萄糖脫氫酶(gdh)、氨基功能化的磁性納米粒，其特征在于：在衍射角度2θ為30.5±0.2°、35.4±0.2°、44.7±0.2°、57.3±0.2°、63.4±0.2°處有衍射峰。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，上述磁性聯(lián)合交聯(lián)酶聚集體生物催化劑在波數(shù)為3316±4、2946±4、1659±4、1540±4、1092±4、799±4、583±4、463±4處有紅外特征吸收峰。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，上述磁性聯(lián)合交聯(lián)酶聚集體生物催化劑為球形顆粒，粒徑為1.5±0.5μm。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，上述磁性聯(lián)合交聯(lián)酶聚集體生物催化劑的酶負(fù)載量為5-15％。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，上述氨基功能化的磁性納米粒為氨基功能化的磁性fe3o4納米顆粒，由以下方法制得：將磁性fe3o4納米顆粒用乙醇/水混合溶液分散，在20-80℃以400-1000r/min攪拌1.0-3.0小時(shí)。加濃氨水?dāng)嚢?.5-1.5小時(shí)，再加入適量四乙氧基硅烷，控制轉(zhuǎn)速1000-2000r/min攪拌8-16小時(shí)，最后加入適量氨丙基三乙氧基硅烷，ph值8-11，轉(zhuǎn)速1000-2000r/min攪拌8-16小時(shí)，然后磁性分離得到氨基功能化的磁性fe3o4納米顆粒。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，上述磁性fe3o4納米粒由以下方法制得：將fecl3·6h2o和fecl2·4h2o以物質(zhì)的量之比為2:1的比例溶于去離子水中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下以轉(zhuǎn)速500-1500r/min機(jī)械攪拌0.5-1.0小時(shí)，再加入濃度為8-12m的naoh溶液，以轉(zhuǎn)速1000-2000r/min機(jī)械攪拌1-1.5小時(shí)，溫度升至70-100℃，熟化0.5-2.0小時(shí)；降至室溫，磁性分離得到磁性fe3o4納米顆粒。

根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明的另一目的在于提供上述磁性聯(lián)合交聯(lián)酶聚集體生物催化劑的制備方法。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，上述磁性聯(lián)合交聯(lián)酶聚集體生物催化劑的制備方法，包括磁性fe3o4納米顆粒的制備、磁性fe3o4納米顆粒氨基功能化、磁性聯(lián)合交聯(lián)酶聚集體步驟，其特征在于：所述磁性fe3o4納米顆粒的制備為將fecl3·6h2o和fecl2·4h2o以物質(zhì)的量之比為2:1的比例溶于去離子水中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)以轉(zhuǎn)速500-1500r/min機(jī)械攪拌0.5-1.0小時(shí)，再加入濃度為8-12m的naoh溶液，轉(zhuǎn)速1000-2000r/min機(jī)械攪拌1-1.5小時(shí)，溫度升至70-100℃，熟化0.5-2.0小時(shí)，降至室溫，磁性分離得到磁性fe3o4納米顆粒；所述磁性fe3o4納米顆粒氨基功能化為將磁性fe3o4納米顆粒用乙醇/水混合溶液分散，在20-80℃以轉(zhuǎn)速400-1000r/min攪拌1.0-3.0小時(shí)。加濃氨水?dāng)嚢?.5-1.5小時(shí)后，再加入適量四乙氧基硅烷，控制轉(zhuǎn)速1000-2000r/min攪拌8-16小時(shí)，最后加入適量氨丙基三乙氧基硅烷，ph8-11，以轉(zhuǎn)速1000-2000r/min攪拌8-16小時(shí)，然后磁性分離得到氨基功能化的磁性fe3o4納米顆粒；所述磁性聯(lián)合交聯(lián)酶聚集體為將氨基功能化的磁性fe3o4納米顆粒分散在含有qnr和gdh的磷酸鹽緩沖溶液中，在4-25℃，轉(zhuǎn)速400-800r/min攪拌0.5-1.0小時(shí)，然后加入沉淀劑，攪拌0.5-1.5小時(shí)，再加入戊二醛，以轉(zhuǎn)速200-600r/min攪拌交聯(lián)1-12h，分離即得。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，上述沉淀劑選自乙醇、異丙醇、飽和硫酸銨、丙酮、乙腈中的一種或幾種組合；優(yōu)選飽和硫酸銨。上述戊二醛的濃度為10-120mm，優(yōu)選40mm。上述交聯(lián)時(shí)間為1-12小時(shí)，優(yōu)選8小時(shí)。

具體的說(shuō)，一種磁性聯(lián)合交聯(lián)酶聚集體生物催化劑的制備方法，其特征在于，采用如下步驟：

步驟(1)

將物質(zhì)的量比為2:1的fecl3·6h2o(10.8116g)和fecl2·4h2o(3.9762g)溶于100-200ml去離子水，氮?dú)獗Ｗo(hù)，轉(zhuǎn)速500-1500r/min機(jī)械攪拌0.5-1.0小時(shí)；滴加10-30ml濃度為8-12m的naoh溶液，轉(zhuǎn)速1000-2000r/min機(jī)械攪拌1-1.5小時(shí)；升溫至70-100℃，熟化0.5-2.0小時(shí)；降至室溫，磁性分離并用去離子水洗滌3-5次，干燥，得磁性fe3o4納米顆粒；

步驟(2)

取步驟(1)制備的磁性fe3o4納米顆粒100-200mg，分散到體積比為5:2的140-280ml的乙醇/水溶液中，氮?dú)獗Ｗo(hù)，在20-80℃，轉(zhuǎn)速400-1000r/min攪拌1.0-3.0小時(shí)；加入2-4ml濃氨水，攪拌0.5-1.5小時(shí)后，加入0.4-0.8ml的四乙氧基硅烷，轉(zhuǎn)速1000-2000r/min攪拌8-16小時(shí)；滴加0.8-1.6ml氨丙基三乙氧基硅烷，ph8-11，轉(zhuǎn)速1000-2000r/min攪拌8-16小時(shí)；磁鐵分離，去離子水洗滌3-5次，得氨基功能化的磁性fe3o4納米顆粒；

步驟(3)

取步驟(2)制備的氨基功能化的磁性fe3o4納米顆粒4-6mg，分散在1.6-2.4ml含有qnr(4.0mg/ml)和gdh(2.0mg/ml)的磷酸鹽緩沖溶液(pbs，10mm,ph7.2-7.5)中，在4-25℃，轉(zhuǎn)速400-800r/min攪拌0.5-1.0小時(shí)。加入7-12倍體積的冰冷的沉淀劑，攪拌0.5-1.5h；加入0.8-1.2ml的戊二醛，轉(zhuǎn)速200-600r/min攪拌交聯(lián)1-12h；磁分離，pbs洗3次，得磁性combi-cleas。

本發(fā)明磁性fe3o4納米顆粒的制備中去離子水及氫氧化鈉溶液的用量由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)實(shí)際情況確定；磁性fe3o4納米顆粒氨基功能化步驟中乙醇與水的比例、乙醇與水的用量、四乙氧基硅烷用量以及氨丙基三乙氧基硅烷用量均由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)反應(yīng)實(shí)際情況確定；磁性聯(lián)合交聯(lián)酶聚集體步驟中磷酸鹽緩沖溶液的用量根據(jù)實(shí)際情況確定，同時(shí)qnr和gdh的用量根據(jù)實(shí)際情況確定。

根據(jù)本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明的再一目的在于提供上述磁性聯(lián)合交聯(lián)酶聚集體生物催化劑在合成(r)-3-奎寧醇中的應(yīng)用。

根據(jù)本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明的再一目的在于提供一種(r)-3-奎寧醇的合成方法，該方法使用上述磁性聯(lián)合交聯(lián)酶聚集體生物催化劑進(jìn)行酶催化反應(yīng)，合成(r)-3-奎寧醇。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，一種(r)-3-奎寧醇的合成方法，其特征在于：

將磁性combi-cleas分散在pbs中，加入3-奎寧酮，葡萄糖、nad⁺和nadh，在室溫條件下，ph為7.2-8.0，以50～150rpm轉(zhuǎn)速攪拌，生物轉(zhuǎn)化時(shí)間為1-3h。

具體的，一種(r)-3-奎寧醇的生物催化合成方法，包括如下步驟：

步驟(1)

將物質(zhì)的量比為2:1的fecl3·6h2o(10.8116g)和fecl2·4h2o(3.9762g)溶于100-200ml去離子水，氮?dú)獗Ｗo(hù)，轉(zhuǎn)速500-1500r/min機(jī)械攪拌0.5-1.0小時(shí)。滴加10-30ml濃度為8-12m的naoh溶液，轉(zhuǎn)速1000-2000r/min機(jī)械攪拌1-1.5小時(shí)。升溫至70-100℃，熟化0.5-2.0小時(shí)；降至室溫，磁性分離并用去離子水洗滌3-5次，干燥，得磁性fe3o4納米顆粒；

步驟(2)

取步驟(1)制備的磁性fe3o4納米顆粒100-200mg，分散到體積比為5:2的140-280ml的乙醇/水溶液中，氮?dú)獗Ｗo(hù)，在20-80℃，轉(zhuǎn)速400-1000r/min攪拌1.0-3.0小時(shí)。加入2-4ml濃氨水，攪拌0.5-1.5小時(shí)后，加入0.4-0.8ml的四乙氧基硅烷，轉(zhuǎn)速1000-2000r/min攪拌8-16小時(shí)；滴加0.8-1.6ml氨丙基三乙氧基硅烷，ph8-11，轉(zhuǎn)速1000-2000r/min攪拌8-16小時(shí)；磁鐵分離，去離子水洗滌3-5次，得氨基功能化的磁性fe3o4納米顆粒；

步驟(3)

取步驟(2)制備的氨基功能化的磁性fe3o4納米顆粒4-6mg，分散在1.6-2.4ml含有qnr(4.0mg/ml)和gdh(2.0mg/ml)的磷酸鹽緩沖溶液(pbs，10mm,ph7.2-7.5)中，在4-25℃，轉(zhuǎn)速400-800r/min攪拌0.5-1.0小時(shí)。加入7-12倍體積的冰冷的沉淀劑，攪拌0.5-1.5小時(shí)；加入0.8-1.2ml的戊二醛，轉(zhuǎn)速200-600r/min攪拌1-12小時(shí)。磁分離，pbs洗3次，得磁性combi-cleas。

步驟(4)

取步驟(3)制備的combi-cleas生物催化劑40-60mg分散在含有：4-6mm3-奎寧酮、7.2-10.8mm葡萄糖、0.04-0.06mmnad⁺和0.04-0.06mmnadh的pbs中，總體積8-12ml；在4-25℃，ph7.5-8.0，以轉(zhuǎn)速50-200r/min攪拌，生物轉(zhuǎn)化時(shí)間為1-3小時(shí)。

有益效果：

1、本發(fā)明提供一種磁性聯(lián)合交聯(lián)酶聚集體生物催化劑，該催化劑在衍射角度2θ為30.5±0.2°、35.4±0.2°、44.7±0.2°、57.3±0.2°、63.4±0.2°處有衍射峰；同時(shí)在波數(shù)3316±4、2946±4、1659±4、1540±4、1092±4、799±4、583±4、463±4處有紅外特征吸收峰。經(jīng)電鏡掃描顯示，本發(fā)明磁性聯(lián)合交聯(lián)酶聚集體生物催化劑具有凹凸不平的球形表面結(jié)構(gòu)，粒徑為1.5±0.5μm；熱重分析顯示，本發(fā)明磁性聯(lián)合交聯(lián)酶聚集體生物催化劑酶負(fù)載量高達(dá)5-15％。

2、本發(fā)明使用氨基功能化的磁性納米粒聯(lián)合交聯(lián)酶聚集體固定化技術(shù)，從細(xì)胞裂解上清液中直接固定qnr和gdh，形成磁性combi-cleas生物催化劑，不需要高純度的qnr和gdh，能一步完成靶酶的純化和固定化；同時(shí)可通過(guò)磁性回收，制備與分離均不需要特殊設(shè)備，工藝條件溫和，操作方便，成本低，適合工業(yè)化。

3、本發(fā)明磁性聯(lián)合交聯(lián)酶聚集體生物催化劑(combi-cleas)硬度適中，機(jī)械性能較好；易于磁分離，可循環(huán)利用；循環(huán)過(guò)程中無(wú)qnr和gdh泄露，長(zhǎng)期操作穩(wěn)定性好，適合工業(yè)化。

4、使用本發(fā)明的磁性combi-cleas生物催化劑，用于不對(duì)稱合成(r)-3-奎寧醇，可實(shí)現(xiàn)羰基還原和輔酶nadh/nad⁺原位再生同時(shí)進(jìn)行；同時(shí)能有效克服底物、輔酶和產(chǎn)物的擴(kuò)散限制，催化活性好，催化效率高。

5、使用本發(fā)明的磁性combi-cleas催化劑不對(duì)稱合成(r)-3-奎寧醇，轉(zhuǎn)化率為100％，收率高達(dá)70-85％，對(duì)映體值為100％，同時(shí)轉(zhuǎn)化時(shí)間大大降低(1-3h)，經(jīng)濟(jì)價(jià)值明顯。本發(fā)明生物催化不對(duì)稱合成(r)-3-奎寧醇所用介質(zhì)為水，有利于節(jié)約資源，環(huán)境友好，符合綠色化學(xué)和可持續(xù)發(fā)展要求。

附圖說(shuō)明

圖1是磁性combi-cleas的掃描電鏡分析；

圖2是磁性combi-cleas的紅外光譜分析；

圖3是磁性combi-cleas的粉末x衍射分析；

圖4是磁性combi-cleas的熱重分析；

圖5是磁性combi-cleas的循環(huán)再利用；

圖2-4中的磁性催化劑為本發(fā)明磁性聯(lián)合交聯(lián)酶聚集體生物催化劑。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，在此指出以下實(shí)施例只用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員可以根據(jù)上述發(fā)明內(nèi)容對(duì)本發(fā)明作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。除特殊說(shuō)明外，本發(fā)明所述份數(shù)均為重量份，所述百分比均為質(zhì)量百分比。本發(fā)明所有原料及試劑均為市售產(chǎn)品，其中緩沖溶液pbs購(gòu)至北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，ph值為7.4。本發(fā)明濃氨水，濃度22-25％。本發(fā)明所用羰基還原酶為nadh依賴的特異性的3-奎寧酮還原酶(qnr,accessionno:ab733448)，輔酶再生酶為葡萄糖脫氫酶(gdh,accessionno:ay930464)。

實(shí)施例1

酶活性測(cè)定

qnr酶活性測(cè)定：

標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)混合體系：緩沖溶液b(pbs，ph7.2-7.4)，3μmol3-奎寧酮，0.3μmolnadh，適量的酶qnr，總體積1ml。在λ＝340nm處測(cè)定吸光度值變化。酶活性單位定義：25℃，1min內(nèi)轉(zhuǎn)化1μmolnadh所需的酶量。

gdh酶活性測(cè)定：

標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)混合體系：緩沖溶液b(pbs，ph7.2-7.4)，10μmol葡萄糖，1μmolnad⁺，適量的酶gdh，總體積1ml。在λ＝340nm處測(cè)定吸光度值變化。酶活性單位定義：25℃，1min內(nèi)轉(zhuǎn)化1μmolnad⁺所需的酶量。

實(shí)施例2

磁性fe3o4納米顆粒的制備：

將物質(zhì)的量比為2:1的fecl3·6h2o(10.8116g)和fecl2·4h2o(3.9762g)溶于100-200ml去離子水，氮?dú)獗Ｗo(hù)，轉(zhuǎn)速500-1500r/min機(jī)械攪拌0.5-1.0小時(shí)。滴加10-30ml濃度為8-12m的naoh溶液，轉(zhuǎn)速1000-2000r/min機(jī)械攪拌1-1.5小時(shí)。升溫至70-100℃，熟化0.5-2.0小時(shí)；降至室溫，磁性分離并用去離子水洗滌3-5次，干燥，得磁性fe3o4納米顆粒；

磁性fe3o4納米顆粒氨基功能化：

取磁性fe3o4納米顆粒100-200mg，分散到體積比為5:2的140-280ml的乙醇/水溶液中，氮?dú)獗Ｗo(hù)，在20-80℃，轉(zhuǎn)速400-1000r/min攪拌1.0-3.0小時(shí)。加入2-4ml濃氨水，攪拌0.5-1.5小時(shí)后，加入0.4-0.8ml的四乙氧基硅烷，轉(zhuǎn)速1000-2000r/min攪拌8-16小時(shí)；滴加0.8-1.6ml氨丙基三乙氧基硅烷，ph8-11，轉(zhuǎn)速1000-2000r/min攪拌8-16小時(shí)；磁鐵分離，去離子水洗滌3-5次，得氨基功能化的磁性fe3o4納米顆粒；

實(shí)施例3

聯(lián)合交聯(lián)固定qnr和gdh：

取實(shí)施例2制備的氨基功能化的磁性fe3o4納米顆粒5mg，分散在1.0ml含有qnr(4.0mg/ml)和gdh(2.0mg/ml)的磷酸鹽緩沖溶液(pbs，10mm,ph7.2-7.5)中，在4℃，轉(zhuǎn)速600r/min攪拌0.5小時(shí)。加入9倍體積的冰冷的沉淀劑(飽和硫酸銨)，攪拌1.5小時(shí)。加入1.0ml濃度為40mm的戊二醛，轉(zhuǎn)速400r/min攪拌8.0h。磁分離，pbs洗3次，得磁性combi-cleas。

對(duì)實(shí)施例3制備的磁性combi-cleas進(jìn)行掃描電鏡分析

將樣品溶液滴加于潔凈的蓋玻片上，40℃真空干燥，噴金覆蓋樣品，用掃描電鏡(sem,s-3000n型)成像，分析結(jié)果見(jiàn)附圖1。附圖1為combi-cleas微球，呈現(xiàn)表面凹凸不平的球形。

對(duì)實(shí)施例3制備的磁性combi-cleas進(jìn)行紅外光譜分析

紅外光譜分析：采用kbr壓片法制備樣品，范掃波長(zhǎng)描圍4000～400cm^-1，底物和產(chǎn)品的紅外光譜圖見(jiàn)附圖2，在波數(shù)為3316±4,、2946±4、1659±4、1540±4、1092±4、799±4、583±4、463±4處有紅外特征吸收峰。

對(duì)實(shí)施例3制備的磁性combi-cleas進(jìn)行粉末x衍射(xrd)分析

使用普析xd-2x-ray衍射儀測(cè)定樣品晶體衍射峰，測(cè)試條件：cu靶電壓30kv，電流15ma，掃描速度2°/min，步長(zhǎng)0.02°，掃描范圍5°to50°，分析結(jié)果見(jiàn)附圖3。從圖3中可見(jiàn)：combi-cleas的xrd譜中，2θ在30.5±0.2°、35.4±0.2°、44.7±0.2°、57.3±0.2°、63.4±0.2°處出現(xiàn)特征峰。

對(duì)實(shí)施例3制備的磁性combi-cleas進(jìn)行熱重分析(tga)

使用mettler1100sf系統(tǒng)測(cè)定生物催化劑的酶負(fù)載量。將約2mg樣品置于鋁鍋中，按20ml/min通入氮?dú)?，加熱速度?5℃/min，掃描范圍為30-600℃。tga分析結(jié)果見(jiàn)附圖4。根據(jù)失重計(jì)算，生物催化劑酶負(fù)載量為8.77％。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，沉淀劑的種類、戊二醛濃度及聯(lián)合交聯(lián)固定qnr和gdh的時(shí)間對(duì)combi-cleas酶活性均有不同程度的影響。

參照實(shí)施例3的制備方法，考察不同種類沉淀劑(乙醇、異丙醇、丙酮、飽和硫酸銨、乙腈)對(duì)combi-cleas酶活性的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1不同沉淀劑對(duì)combi-cleas酶活性的影響

使用有機(jī)溶劑做沉淀劑，酶活性回收率低。當(dāng)用飽和硫酸銨為沉淀劑時(shí)，qnr和gdh的活性回收率分別為104.0±0.7％和98.1±1.9％，對(duì)酶活性影響最小，活性回收率最高。本發(fā)明優(yōu)選的沉淀劑為飽和硫酸銨。

參照實(shí)施例3的制備方法，考察戊二醛濃度對(duì)combi-cleas酶活性的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2不同戊二醛濃度對(duì)combi-cleas酶活性的影響

隨戊二醛濃度增大，酶活性回收率增加。當(dāng)濃度達(dá)到40mm時(shí)，qnr和gdh的活性回收率最高，超過(guò)40mm時(shí)，活性回收率有減小趨勢(shì)。本發(fā)明優(yōu)選的交聯(lián)劑濃度為40mm。

參照實(shí)施例3的制備方法，考察交聯(lián)時(shí)間(加入戊二醛后的反應(yīng)時(shí)間)對(duì)combi-cleas酶活性的影響，考察結(jié)果見(jiàn)表3。

表3不同交聯(lián)時(shí)間對(duì)combi-cleas酶活性的影響

戊二醛濃度為40mm，qnr和gdh的活性回收率隨交聯(lián)時(shí)間延長(zhǎng)而增大，交聯(lián)時(shí)間為8小時(shí)，qnr和gdh的活性回收率最高。本發(fā)明優(yōu)選的交聯(lián)時(shí)間為8小時(shí)。

實(shí)施例4

磁性combi-cleas催化不對(duì)稱合成(r)-3-奎寧醇：

取50mg磁性combi-cleas分散在含有：5mm3-奎寧酮、9mm葡萄糖、0.05mmnad⁺和0.05mmnadh的pbs中，總體積10ml。在20℃，ph7.5-8.0，以轉(zhuǎn)速150r/min攪拌。選用流動(dòng)相為v二氯甲烷/v甲醇＝9/1，通過(guò)tlc監(jiān)控反應(yīng)，生物轉(zhuǎn)化時(shí)間為2h。反應(yīng)完成后，磁性分離回收催化劑。上清液用高濃度naoh調(diào)節(jié)至ph值大于12，然后在80℃減壓濃縮至總體積的1/4。加入等體積的正丁醇抽提3次，收集有機(jī)相，減壓濃縮蒸干。在90℃，用甲苯溶解固體，難溶物趁熱過(guò)濾，濾液冷卻，有白色針狀晶體出現(xiàn)，過(guò)濾，得白色固體。

對(duì)實(shí)施例4制備的白色固體進(jìn)行紅外光譜、¹hnmr和質(zhì)譜分析

紅外光譜：1747cm^-1左右的羰基特征峰消失，在3103cm^-1出現(xiàn)羥基特征峰，表明3-奎寧酮被還原成3-奎寧醇；

¹h-nmr(400mhz，dmso)分析：δ4.946(s，1h)，δ3.879(q，1h)，δ2.531-3.164(m，6h)，δ1.392-2.014(m，5h)；

mr分析：產(chǎn)物的理論分子量為：127.18，質(zhì)譜測(cè)定為：127)。

對(duì)實(shí)施例4制備的白色固體進(jìn)構(gòu)型分析

用clarus580gc系統(tǒng)(perkinelmer,usa)測(cè)定對(duì)映體值，手性柱為(hydrodex-β-6-tbdm,25m×0.25mm×0.25μm,macherey-nagel)，使用火焰離子檢測(cè)器。從60℃程序升溫至180℃，升溫速度為5℃/min，保持3min.進(jìn)樣器和檢查器的溫度分別為220℃和250℃。以標(biāo)準(zhǔn)品(r)和(s)-奎寧醇做對(duì)照，測(cè)得產(chǎn)品的對(duì)映體值為100％，其構(gòu)型r型。

實(shí)施例5

磁性combi-cleas的回收和循環(huán)再利用。

取50mg磁性combi-cleas分散在含有：5mm3-奎寧酮、9mm葡萄糖、0.05mmnad⁺和0.05mmnadh的pbs中，總體積10ml。在20℃，ph7.5-8.0，以轉(zhuǎn)速150r/min攪拌。tlc監(jiān)控反應(yīng)，反應(yīng)完成后，磁性分離回收催化劑。直接用于下一次轉(zhuǎn)化。發(fā)現(xiàn)本發(fā)明提供的生物催化劑可循環(huán)8次，單次循環(huán)的轉(zhuǎn)化率和對(duì)映體值均為100％，結(jié)果見(jiàn)附圖5。循環(huán)8次以后，催化效率明顯降低。但在循環(huán)過(guò)程中，無(wú)qnr和gdh泄露。

實(shí)施例6

取實(shí)施例2制備的氨基功能化的磁性fe3o4納米顆粒4-6mg，分散在1.6-2.4ml含有qnr(4.0mg/ml)和gdh(2.0mg/ml)的磷酸鹽緩沖溶液(pbs，10mm,ph7.2-7.5)中，在4-25℃，轉(zhuǎn)速400-800r/min攪拌0.5-1.0小時(shí)。加入7-12倍體積的冰冷的沉淀劑，攪拌0.5-1.5h；加入0.8-1.2ml的戊二醛，轉(zhuǎn)速200-600r/min攪拌交聯(lián)2.0-12.0h。磁分離，pbs洗3次，得磁性combi-cleas。

使用實(shí)施例3的方法進(jìn)行粉末x衍射(xrd)分析、紅外光譜分析、掃描電鏡分析及熱重分析(tga)，結(jié)果顯示實(shí)施例6制備的磁性聯(lián)合交聯(lián)酶聚集體生物催化劑，在衍射角度2θ為30.5±0.2°、35.4±0.2°、44.7±0.2°、57.3±0.2°、63.4±0.2°處有衍射峰；同時(shí)在波數(shù)為3316±4,、2946±4、1659±4、1540±4、1092±4、799±4、583±4、463±4處有紅外特征吸收峰。經(jīng)電鏡掃描顯示，本發(fā)明磁性聯(lián)合交聯(lián)酶聚集體生物催化劑具有凹凸不平的球形表面結(jié)構(gòu)，粒徑為1.5±0.5μm；熱重分析顯示，磁性聯(lián)合交聯(lián)酶聚集體生物催化劑酶負(fù)載量高達(dá)5-15％。

實(shí)施例7

取實(shí)施例6制備的combi-cleas生物催化劑40-60mg分散在含有：4-6mm3-奎寧酮、7.2-10.8mm葡萄糖、0.04-0.06mmnad⁺和0.04-0.06mmnadh的pbs中，總體積8-12ml；在4-25℃，ph7.5-8.0，以轉(zhuǎn)速50-200r/min攪拌，生物轉(zhuǎn)化時(shí)間為1-3h。

使用實(shí)施例4或5的方法檢測(cè)實(shí)施例7不對(duì)稱合成(r)-3-奎寧醇的轉(zhuǎn)化效果，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化率為100％，收率高達(dá)70-85％，對(duì)映體值為100％。磁性combi-cleas的回收和循環(huán)再利用過(guò)程中，無(wú)qnr和gdh泄露。

實(shí)施例8

在不經(jīng)過(guò)本發(fā)明生物催化劑處理，直接用表達(dá)qnr和表達(dá)gdh的重組大腸桿菌處理實(shí)驗(yàn)，以作對(duì)比。反應(yīng)體系：0.1g混合濕細(xì)胞作生物催化劑，5mm3-奎寧酮，9mm葡萄糖,0.05mmnad⁺和0.05mmnadh，緩沖溶液b(pbs，ph7.2-7.4)，總體積10ml。反應(yīng)溫度25℃，以100rpm連續(xù)攪拌，反應(yīng)過(guò)程中控制ph在7.5-8.0.用tlc監(jiān)控反應(yīng)，流動(dòng)相為v二氯甲烷/v甲醇＝9/1。轉(zhuǎn)化時(shí)間明顯延長(zhǎng)(5.5h)，轉(zhuǎn)化率為95％，對(duì)映體值100％，不能回收和循環(huán)利用。

本發(fā)明磁性聯(lián)合交聯(lián)酶聚集體生物催化劑用于不對(duì)稱合成(r)-3-奎寧醇，與實(shí)施例8相比，不僅能回收和循環(huán)利用，還明顯縮短反應(yīng)時(shí)間，經(jīng)濟(jì)價(jià)值明顯。同時(shí)本發(fā)明生物催化不對(duì)稱合成(r)-3-奎寧醇所用介質(zhì)為水，有利于節(jié)約資源，環(huán)境友好，符合綠色化學(xué)和可持續(xù)發(fā)展要求。