本發(fā)明屬于木質(zhì)纖維素酶解技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及利用ph響應(yīng)型木質(zhì)素兩性表面活性劑回收溶液中纖維素酶的方法。

背景技術(shù)：

木質(zhì)纖維素生物煉制燃料乙醇是替代汽油有效可行的技術(shù)之一。在這一煉制過程中，纖維素酶能否高效水解木質(zhì)纖維素底物是關(guān)鍵的技術(shù)瓶頸。同時，纖維素酶因其具有活力低、耗量大和價格貴等特點，直接阻礙了纖維素乙醇的工業(yè)化。實現(xiàn)纖維素酶的高效回收利用是降低生物乙醇成本的重要途徑。由于酶解結(jié)束后酶解液中的纖維素酶蛋白的濃度一般低于1g/l，且纖維素酶的組分較多，不同組分的酶有不同的等電點(pi)，所以常見的鹽析法和等電點沉降法不適合回收酶解液中的纖維素酶。目前，纖維素酶回收利用技術(shù)主要有超濾膜回收、纖維素酶的固定化回收和新鮮底物重吸附法回收。

超濾膜回收可以同時回收纖維素酶中的各種組分，且可以得到較高纖維素酶回收效率，但是超濾膜回收存在著設(shè)備貴、超濾膜易堵塞、操作費時、成本高等問題(bioresourcetechnology,2013.144:186-193.)。纖維素酶的固定化可以保持纖維素酶的穩(wěn)定且利于纖維素酶的回收利用，但是固定化酶與纖維素之間存在很大的傳質(zhì)障礙，且固定化過程會嚴(yán)重影響酶活，因此目前僅限于纖維二糖酶的固定化回收再用(nano,2015.10:2153-2157.)。纖維素酶具有高穩(wěn)定性和對纖維素的強吸附的特性，使得酶通過新鮮底物吸附回收成為降低纖維素酶成本比例的潛在途徑，但是添加新鮮底物回收纖維素酶效率較低，操作過程中容易感染雜菌，且該方法無法回收纖維二糖酶(biotechnolbiofuels,2015.8(1):5.)。

木質(zhì)素是自然界中在數(shù)量上僅次于纖維素的第二大天然高分子材料，制漿造紙工業(yè)每年都會得到5000萬噸左右的木質(zhì)素副產(chǎn)品，但超過95％的木質(zhì)素仍然主要作為工業(yè)制漿的廢棄物，造紙黑液的排放不僅造成資源的浪費，同時又污染環(huán)境，對其進行綜合開發(fā)利用對經(jīng)濟的發(fā)展和環(huán)境保護都具有現(xiàn)實意義。纖維素乙醇工業(yè)本身也會產(chǎn)生大量的酶解木質(zhì)素，若能將其應(yīng)用于回收纖維素酶將會有巨大的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服回收溶液中纖維素酶現(xiàn)有技術(shù)所存在的成本高和回收效率低等缺點和不足，本發(fā)明的目的在于提供一種只需要簡單的調(diào)節(jié)ph就可以快速地回收纖維素酶，有利于生物質(zhì)資源的綜合利用的利用ph響應(yīng)型木質(zhì)素兩性表面活性劑回收溶液中纖維素酶的方法。

本發(fā)明的目的通過下述方案實現(xiàn)：

一種回收溶液中纖維素酶的方法，其特征在于包括以下步驟：將ph響應(yīng)型木質(zhì)素兩性表面活性劑加入到纖維素酶溶液中溶解，再調(diào)節(jié)溶液的ph2.5-10，使ph響應(yīng)型木質(zhì)素兩性表面活性劑和纖維素酶同時沉淀析出，通過固液分離回收纖維素酶。

為進一步實現(xiàn)本發(fā)明目的，優(yōu)選地，所述ph響應(yīng)型木質(zhì)素兩性表面活性劑為工業(yè)木質(zhì)素或木質(zhì)素的衍生物為原料經(jīng)過化學(xué)反應(yīng)引入陽離子基團和/或陰離子基團得到的具有ph響應(yīng)的木質(zhì)素兩性表面活性劑，其中陰離子基團為羧基、磺酸基、硫酸基或磷酸基，陽離子基團為季銨基或胺基。

優(yōu)選地，所述工業(yè)木質(zhì)素為堿木質(zhì)素、有機溶劑木質(zhì)素或生物質(zhì)煉制木質(zhì)素，木質(zhì)素的衍生物為木質(zhì)素磺酸鹽、木質(zhì)素羧酸鹽、木質(zhì)素磷酸鹽、木質(zhì)素季銨鹽或木質(zhì)素胺鹽。

優(yōu)選地，所述ph響應(yīng)型木質(zhì)素兩性表面活性劑為磺化季銨化木質(zhì)素、磺化胺化木質(zhì)素、硫酸化季銨化木質(zhì)素、硫酸化胺化木質(zhì)素、磷酸化季銨化木質(zhì)素、磷酸化胺化木質(zhì)素、羧化季銨化木質(zhì)素或羧化胺化木質(zhì)素。

優(yōu)選地，所述ph響應(yīng)型木質(zhì)素兩性表面活性劑中的陰離子或陽離子基團的含量均大于0.3mmol/g木質(zhì)素。

優(yōu)選地，所述纖維素酶溶液的ph為3.5～7.0，離子強度為0～200mmol/l。

優(yōu)選地，所述纖維素酶為celluclast1.5l或cellicctec2。本發(fā)明對纖維素酶沒有特定要求，對于目前普遍使用的celluclast1.5l和cellicctec2都可以進行回收。所述纖維素酶溶液中纖維素酶蛋白濃度為50-2000mg/l。

優(yōu)選地，所述的固液分離的方法為自然沉降法、傾析法、過濾法、離心法或這些方法的聯(lián)合使用。

優(yōu)選地，所述的ph響應(yīng)型木質(zhì)素兩性表面活性劑與纖維素酶溶液的質(zhì)量比為0.05-2:100。

優(yōu)選地，回收得到的纖維素酶用于制備纖維素酶溶液。所述的回收的纖維素酶能夠也能應(yīng)用于纖維素或木質(zhì)素纖維素的水解。

本發(fā)明ph響應(yīng)型木質(zhì)素兩性表面活性劑可以根據(jù)纖維素酶溶液的具體情況進行優(yōu)選，使其可以溶解在纖維素酶溶液中并通過調(diào)節(jié)溶液的ph與纖維素酶一起沉淀出來。本發(fā)明調(diào)節(jié)溶液的ph值最低不超過2.5，最高不超過10.0。過高和過低的ph值都會導(dǎo)致纖維素酶的失活。調(diào)節(jié)酶解液體中可能用到的酸為有機酸或無機酸(如鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸、醋酸、乙酸、甲酸、馬來酸等)；可能用到的堿為常規(guī)的堿(如氫氧化鈉，氫氧化鉀，氧化鈣，氫氧化鈣等)。

本發(fā)明的機理為：本發(fā)明以制漿造紙副產(chǎn)物木質(zhì)素或酶解木質(zhì)素為原料，經(jīng)過化學(xué)反應(yīng)改性成ph響應(yīng)型木質(zhì)素兩性表面活性劑，使其用于溶液中纖維素酶的回收。由于ph響應(yīng)型木質(zhì)素兩性表面活性劑的溶解度可以隨ph調(diào)節(jié)，選擇合適的ph響應(yīng)型木質(zhì)素兩性表面活性劑完全溶解于纖維素酶溶液中，當(dāng)升高或降低溶液的ph時，ph響應(yīng)型木質(zhì)素兩性表面活性劑析出，由于其與纖維素酶存在一定的相互作用(靜電作用、疏水作用、氫鍵作用)，所以在ph響應(yīng)型兩性表面活性劑析出時會將溶液中的纖維素酶一起沉淀下來。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點及有益效果：

(1)本發(fā)明用ph響應(yīng)型木質(zhì)素兩性表面活性劑回收纖維素酶，回收的纖維素酶對微晶纖維素底物的活性可以達到初始纖維素酶活性的41.5-91.6％。

(2)本發(fā)明中回收纖維素酶的操作簡單、耗時短、不需要額外的設(shè)備，只需要簡單的調(diào)節(jié)ph就可以快速地回收纖維素酶。

(3)本發(fā)明以工業(yè)木質(zhì)素和木質(zhì)素衍生物為原料，將其應(yīng)用于纖維素酶的回收，有利于生物質(zhì)資源的綜合利用。

附圖說明

圖1(a)是tcsl-n28在純水中的ph響應(yīng)情況；(b)是kl-n40在純水中的ph響應(yīng)情況。

圖2是利用ph響應(yīng)型木質(zhì)素兩性表面活性劑(ph-las)回收纖維素酶的操作示意圖，實施例均按此操作完成。

具體實施方式

為更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。下列實施例中所用試劑均可從市場購買得到。實施例中的微晶纖維素型號為ph101(購自西格瑪奧德里奇)，纖維素酶是目前被廣泛使用的cellicctec2。實施例水解液中葡萄糖濃度是通過生物傳感分析儀(sba-40e，山東省生物科學(xué)研究院)測定的，實施例中微晶纖維素在50℃下水解24h的糖化率代表纖維素酶的活性。

實施例涉及到三種ph響應(yīng)型木質(zhì)素兩性表面活性劑，一種是由磺化木質(zhì)素(tcsl，湖南通道神華林木有限公司生產(chǎn))季銨化得到，等電點小于4.0；一種是由堿木質(zhì)素(kl，湖南湘江紙業(yè)有限公司生產(chǎn))季銨化得到，等電點大于7.0；一種是由木質(zhì)素磺酸鈉(sl，來源于楊木酸性亞硫酸鈉造紙廢液，由吉林石峴紙業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn))胺化得到，等電點小于4.0。三種ph響應(yīng)型木質(zhì)素兩性表面活性劑的具體合成方法如下：

季銨化磺化木質(zhì)素(tcsl-nx)：配制ph＝12的350gtcsl水溶液(tcsl占溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20％)，倒入500ml的三口燒瓶，控制攪拌速度為350rpm，用水浴鍋將溫度升到80℃后，用蠕動泵將1.0769xg質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65wt％(3-氯-2-羥丙基)三甲基氯化銨溶液往燒瓶中緩慢滴加，控制滴加速度為1ml/min，滴加5min時加入0.3721xg質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20％的naoh水溶液，再繼續(xù)滴加完(3-氯-2-羥丙基)三甲基氯化銨溶液后，在80℃下反應(yīng)3個小時，將得到的反應(yīng)液用純水稀釋50倍后調(diào)節(jié)到ph＝3，使產(chǎn)品析出；x為(3-氯-2-羥丙基)三甲基氯化銨占tcsl的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，x的取值范圍為10～80。

季銨化堿木質(zhì)素(kl-n40)：配制ph＝12的350gkl水溶液(kl占溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20％)，倒入500ml的三口燒瓶，控制攪拌速度為350rpm，用水浴鍋將溫度升到80℃后，用蠕動泵將43.08g質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65wt％(3-氯-2-羥丙基)三甲基氯化銨溶液往燒瓶中緩慢滴加，控制滴加速度為1ml/min，滴加5min時加入22.91g質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20％的naoh水溶液，再繼續(xù)滴加完(3-氯-2-羥丙基)三甲基氯化銨溶液后，在80℃下反應(yīng)3個小時，將得到的反應(yīng)液用純水稀釋50倍后調(diào)節(jié)到ph＝7，使產(chǎn)品析出。

胺化木質(zhì)素磺酸鈉(asl)：配制ph＝12的50gsl水溶液(sl占溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20％)，倒入100ml的三口燒瓶，控制攪拌速度為350rpm，設(shè)定水浴鍋的溫度為80℃，當(dāng)溫度升到50℃-55℃，加入1.5g甲醛溶液(甲醛沸點低，溫度低加入)，待溫度上升到80℃后，加入對應(yīng)的3.657g二乙胺，在80℃下反應(yīng)4h，將得到的反應(yīng)液用純水稀釋50倍后調(diào)節(jié)到ph＝3，使產(chǎn)品析出。

實施例1

將5質(zhì)量分的tcsl-n25加入到纖維素酶蛋白濃度為200mg/l的5000質(zhì)量分的溶液中(純水配置，ph＝7.0)，用鹽酸調(diào)節(jié)溶液的ph至3.0使tcsl-n25和纖維素酶沉淀析出，通過固液分離回收纖維素酶。將回收的纖維素酶加入到5000質(zhì)量分50mm的醋酸-醋酸鈉緩沖液中，添加100質(zhì)量分的微晶纖維素，在50℃下酶解24h，通過生物傳感分析儀測定酶解液中的葡萄糖含量，統(tǒng)計結(jié)果如表1所示。

實施例2

將25質(zhì)量分的asl加入到纖維素酶蛋白濃度為400mg/l的5000質(zhì)量分的溶液中(純水配置，ph＝7.0)，用鹽酸調(diào)節(jié)溶液的ph至3.2使asl和纖維素酶沉淀析出，通過離心分離回收纖維素酶。將回收的纖維素酶加入到5000質(zhì)量分50mm的醋酸-醋酸鈉緩沖液中，添加100質(zhì)量分的微晶纖維素，在50℃下酶解24h，通過生物傳感分析儀測定酶解液中的葡萄糖含量，統(tǒng)計結(jié)果如表1所示。

實施例3

將5質(zhì)量分的tcsl-n25加入到纖維素酶蛋白濃度為1000mg/l的5000質(zhì)量分的溶液中(醋酸-醋酸鈉緩沖液配置，ph＝4.8,25mm)，用鹽酸調(diào)節(jié)溶液的ph至2.8使tcsl-n25和纖維素酶沉淀析出，通過離心分離回收纖維素酶。將回收的纖維素酶加入到5000質(zhì)量分50mm的醋酸-醋酸鈉緩沖液中，添加100質(zhì)量分的微晶纖維素，在50℃下酶解24h，通過生物傳感分析儀測定酶解液中的葡萄糖含量，統(tǒng)計結(jié)果如表1所示。

實施例4

將10質(zhì)量分的tcsl-n30加入到纖維素酶蛋白濃度為100mg/l的5000質(zhì)量分的溶液中(醋酸-醋酸鈉緩沖液配置，ph＝5.5，5mm)，用鹽酸調(diào)節(jié)溶液的ph至3.5使tcsl-n30和纖維素酶沉淀析出，通過離心分離回收纖維素酶。將回收的纖維素酶加入到5000質(zhì)量分50mm的醋酸-醋酸鈉緩沖液中，添加100質(zhì)量分的微晶纖維素，在50℃下酶解24h，通過生物傳感分析儀測定酶解液中的葡萄糖含量，統(tǒng)計結(jié)果如表1所示。

實施例5

將10質(zhì)量分的kl-n40加入到纖維素酶蛋白濃度為100mg/l的5000質(zhì)量分的溶液中(醋酸-醋酸鈉緩沖液配置，ph＝4.0，5mm)，用鹽酸調(diào)節(jié)溶液的ph至7.0使kl-n40和纖維素酶沉淀析出，通過離心分離回收纖維素酶。將回收的纖維素酶加入到5000質(zhì)量分50mm的醋酸-醋酸鈉緩沖液中，添加100質(zhì)量分的微晶纖維素，在50℃下酶解24h，通過生物傳感分析儀測定酶解液中的葡萄糖含量，統(tǒng)計結(jié)果如表1所示。

實施例6

將50質(zhì)量分的tcsl-n25加入到纖維素酶蛋白濃度為200mg/l的5000質(zhì)量分的溶液中(醋酸-醋酸鈉緩沖液配置，ph＝6.0，100mm)，用鹽酸調(diào)節(jié)溶液的ph至3.5使tcsl-n30和纖維素酶沉淀析出，通過離心分離回收纖維素酶。將回收的纖維素酶加入到5000質(zhì)量分50mm的醋酸-醋酸鈉緩沖液中，添加100質(zhì)量分的微晶纖維素，在50℃下酶解24h，通過生物傳感分析儀測定酶解液中的葡萄糖含量，統(tǒng)計結(jié)果如表1所示。

實施例7

將25質(zhì)量分的tcsl-n28加入到纖維素酶蛋白濃度為400mg/l的5000質(zhì)量分的葡萄糖溶液中(葡萄糖為100質(zhì)量分，ph＝7.0)，用鹽酸調(diào)節(jié)溶液的ph至3.2使tcsl-n25和纖維素酶沉淀析出，通過離心分離回收纖維素酶。將回收的纖維素酶加入到5000質(zhì)量分50mm的醋酸-醋酸鈉緩沖液中，添加100質(zhì)量分的微晶纖維素，在50℃下酶解24h，通過生物傳感分析儀測定酶解液中的葡萄糖含量，統(tǒng)計結(jié)果如表1所示。

以上實施例同時做了空白對比例(向與實施例纖維素酶濃度相同的5000質(zhì)量分50mm的醋酸-醋酸鈉緩沖液(ph＝4.8)中添加100質(zhì)量分的微晶纖維素，相同條件下酶解24h)，與采用本發(fā)明方法的實施例進行纖維素酶活性(微晶纖維素24h酶解糖化率)的比較。

根據(jù)表1中可以看出，木質(zhì)素兩性表面活性劑可以有效地回收溶液中的纖維素酶，回收的纖維素酶對微晶纖維素的酶解保持了較高的活性。實施例7與實施例2相比溶液中含有2％質(zhì)量分?jǐn)?shù)的葡萄糖，但是纖維素酶的回收沒有受到明顯的影響，說明該方法在木質(zhì)纖維素酶解糖化后的溶液中進行纖維素酶回收具有重要的意義。

圖1(a)是1g/ltcsl-n28在純水中的ph響應(yīng)情況；圖1(b)是1g/lkl-n40在純水中的ph響應(yīng)情況。說明了tcsl-n28和kl-n40具有靈敏的ph響應(yīng)性，可用于回收溶液中的纖維素酶。

圖2是利用ph響應(yīng)型木質(zhì)素兩性表面活性劑回收纖維素酶的操作示意圖，過程操作簡單，不需要額外的設(shè)備，能耗低，綠色環(huán)保。

表1木質(zhì)素兩性表面活性劑回收纖維素酶的情況

本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。