本發(fā)明涉及一種中草藥多糖及其制備方法，更具體地說，涉及一種鐵皮石斛β-1,4-異木聚糖、其硫酸化衍生物以及它們的制備方法及所述硫酸化衍生物在抗血管生成方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

道家經(jīng)典《道藏》曾把鐵皮石斛列為“中華九大仙草之首”，主要分布在浙江、安徽、云南等地。它的干燥莖具有滋陰養(yǎng)胃，增強(qiáng)免疫力，調(diào)節(jié)血糖水平等的功效。早期研究表明，多糖是一種重要的活性物質(zhì)，多糖的含量也間接反映藥材品質(zhì)。因此，對石斛多糖的定性研究不僅可以為石斛品種鑒別提供依據(jù)還可以規(guī)范中藥市場。

前期研究主要集中在水提多糖，因?yàn)殍F皮石斛多糖的分離純化及結(jié)構(gòu)解析仍然面臨很多挑戰(zhàn)，迄今為止從鐵皮石斛中只獲得少數(shù)水提均一多糖。然而，對鐵皮石斛堿提多糖知之甚少。作為堿提多糖中重要的組成成分之一的木聚糖是一種重要的復(fù)雜多糖，不同來源的木聚糖之間也存在著很大的區(qū)別。因此，它的結(jié)構(gòu)也可以作為品種鑒定的參考指標(biāo)之一。更重要的是，功能性木聚糖衍生物作為新一代的生物制品具有廣泛的藥理活性。與其它衍生物相比，硫酸化多糖則具有更強(qiáng)的生物活性。硫酸化多糖具有多種生物活性，如抗凝、抗補(bǔ)體、抗腫瘤和抗血管生成等活性。

血管生成在機(jī)體中發(fā)揮著重要的作用。研究表明，血管生成不直接引發(fā)腫瘤，但是可以促進(jìn)惡性腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移。血管生成雖然有益于機(jī)體器官的生長和修復(fù)，但是也可以為腫瘤細(xì)胞的生長提供條件并引起惡性疾病和炎癥。如今，越來越多的證據(jù)表明，抗血管生成的化合物也可以阻止腫瘤的發(fā)展。抗血管生成方面的研究很有可能改變臨床抗腫瘤藥物的現(xiàn)狀，腫瘤患者也將受益于抗血管生成療法。在大量生物活性篩選的基礎(chǔ)上，出現(xiàn)越來越多抗血管生成化合物。研究發(fā)現(xiàn)，硫酸化多糖具有較強(qiáng)的抑制血管生成的活性。雖然一些硫酸化多糖具有良好的生物活性，但同時(shí)也表現(xiàn)出不可忽略的細(xì)胞毒性。因此，具有合適的取代度，無細(xì)胞毒性的抗血管生成硫酸化多糖有望被開發(fā)成為抗血管生成類抗腫瘤藥物的候選藥物，在腫瘤治療候選藥物上方面具有巨大的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種無細(xì)胞毒性并且具有抗血管生成活性的藥物。

一方面，本發(fā)明提供一種β-1,4-異木聚糖(下文中稱為：s32)，其結(jié)構(gòu)式如下：

其中，rx為α-l-araf-(1→4)-α-d-glcp-(1→；β-d-xylp-(1→；α-l-araf-(1→，或β-d-galp-(1→3)-α-l-rhap-(1→，n＝3-42，并且優(yōu)選地，n＝19-21。

其中，所述β-1,4-異木聚糖的尖峰分子量為：3.7×10⁴da。

另一方面，本發(fā)明提供所述β-1,4-異木聚糖的制備方法，該方法包括以下步驟：

a.多糖提?。鸿F皮石斛干燥莖經(jīng)脫脂后，用堿提取，經(jīng)醇沉洗滌后得到粗多糖doa；

b.多糖純化：得到的粗多糖doa經(jīng)陰離子交換柱分離、去除淀粉后，經(jīng)凝膠柱純化得到s32。

具體地，所述方法包括以下步驟：

a.多糖提?。鸿F皮石斛干燥莖經(jīng)95％乙醇浸泡脫脂，風(fēng)干，粉碎后沸水反復(fù)提取10次。過濾后殘?jiān)脻舛葹?.1-2m，優(yōu)選的濃度值為1m的氫氧化鈉溶液提取，濾液用鹽酸中和后濃縮，透析，透析內(nèi)液經(jīng)離心，5倍體積的95％乙醇沉淀，離心后經(jīng)無水乙醇和丙酮交替洗滌3次后干燥得到鐵皮石斛堿提粗多糖doa；

b.多糖純化：取鐵皮石斛堿提粗多糖，去離子水溶解，離心，上清液經(jīng)deaesepharosefastflow陰離子交換柱分離；采用硫酸-苯酚法檢測，收集0.1m氯化鈉洗脫組分doa1；進(jìn)一步采用α-淀粉酶除去doa1中的淀粉得到doa1a，產(chǎn)物進(jìn)一步用sephacryl^tms-300純化得到s32。

對通過以上方法得到的β-1,4-異木聚糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定：

經(jīng)高效凝膠滲透色譜(highperformancegelpermeationchromatography，hpgpc)法測定，s32多糖相對分子質(zhì)量為3.7×10⁴da。間苯基苯酚法測定結(jié)果顯示s32的糖醛酸含量為15.0％。采用0.05m三氟乙酸(tfa)將s32部分酸水解后得到次級(jí)多糖s3205i。還原前后及水解前后對多糖的單糖組成和甲基化分析。綜合對s32多糖、還原的以及部分酸水解的次級(jí)多糖的單糖組成，甲基化、紅外以及核磁共振數(shù)據(jù)解析，確定s32含有木糖、4-甲氧基-葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、葡萄糖以及痕量的半乳糖和鼠李糖，其對應(yīng)的比例為62.7:12.3:8.9:8.5:3.7:3.9。s32以1,4-β-d-吡喃木糖為主鏈結(jié)構(gòu)，c-2位上有分支。分支主要由末端連接的α-l-呋喃阿拉伯糖、4-甲氧基-α-d-吡喃葡萄糖醛酸、少量β-d-吡喃半乳糖-(1→3)-α-l-吡喃鼠李糖、末端連接的β-d-吡喃木糖以及α-l-呋喃阿拉伯糖-(1→4)-α-d-吡喃葡萄糖組成。

再一方面，本發(fā)明提供所述β-1,4-異木聚糖的硫酸化衍生物(下文中稱為：s32s)的制備方法，該方法包括以下步驟：

1)采用氯磺酸與吡啶制備硫酸化試劑；

2)使制得的硫酸化試劑與s32反應(yīng)，得到s32s。

在上述步驟1)中，氯磺酸與吡啶的體積比可為1:1-1:5，例如可為1:3。在上述步驟2)中，反應(yīng)溫度可為40-80℃，例如可為60℃。

在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述β-1,4-異木聚糖的硫酸化衍生物的制備方法包括以下步驟：向吡啶中逐滴加入氯磺酸制備硫酸化試劑。將s32溶解于甲酰胺中并加入硫酸化試劑使反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后用氫氧化鈉溶液于冰浴中中和，再用飽和碳酸氫鈉透析，接著用去離子水透析。透析內(nèi)液冷凍干燥后得到淡黃色蓬松硫酸化產(chǎn)物s32s。其中，得到的s32s硫酸化的位點(diǎn)主要為1,4-β-d-吡喃木糖的c-2位或者c-3位，無區(qū)域選擇性。1,4-β-d-吡喃葡萄糖的硫酸化位點(diǎn)主要發(fā)生在c-6位。大部分的4-甲氧基-α-d-吡喃葡萄糖醛酸在c-3位發(fā)生了硫酸化取代。少量的1,2,4-β-d-吡喃木糖的c-3位也發(fā)生取代。

進(jìn)一步，本發(fā)明提供一種根據(jù)如上所述的方法制備的β-1,4-異木聚糖的硫酸化衍生物。

更進(jìn)一步，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其包含治療有效量的所述β-1,4-異木聚糖的硫酸化衍生物和藥學(xué)上可接受的載體。

更進(jìn)一步，本發(fā)明提供所述β-1,4-異木聚糖的硫酸化衍生物在制備抗血管生成藥物中的用途。

再進(jìn)一步，本發(fā)明提供所述β-1,4-異木聚糖的硫酸化衍生物在制備用于抑制惡性腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移的藥物中的用途。

本發(fā)明通過以下附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步闡述，但并不限制本發(fā)明的內(nèi)容。

附圖說明

圖1為s32的特征高效液相色譜圖；

圖2為s32的特征紅外光譜圖；

圖3為s32s的特征紅外光譜圖；

圖4為s32的特征¹³cnmr圖譜；

圖5為s32的特征hmbc圖譜；

圖6為s32s與s32的特征dept135nmr圖譜，其中，a為s32s的特征dept135nmr圖譜，b為s32的特征dept135nmr圖譜；

圖7為s32及s32s在不同濃度下對人表皮血管內(nèi)皮細(xì)胞hmec-1在基質(zhì)膠管腔形成抑制作用的示意圖；

圖8為s32s在不同濃度下對人表皮血管內(nèi)皮細(xì)胞hmec-1遷移抑制作用的示意圖；

圖9為s32s在不同濃度以及不同處理時(shí)間下對lo2細(xì)胞(圖9a)和hmec-1細(xì)胞(圖9b)生長的影響。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，但這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。

在下文中，術(shù)語“原糖”指的是未經(jīng)衍生化的多糖。

實(shí)施例1：用堿提取鐵皮石斛制備s32

1、多糖提取

鐵皮石斛干燥莖1.5kg，用95％的乙醇脫脂2周后風(fēng)干。鐵皮石斛干燥莖經(jīng)粉碎后用沸水提取10次(20l/次)，每次提取4h，至硫酸-苯酚法檢測無明顯反應(yīng)。濾渣用1mnaoh于冰浴中提取(12.5l×2)，不時(shí)攪拌。3h后用2mhcl中和，合并濾液并濃縮至10l，用流水透析2天。透析內(nèi)液濃縮至4l，離心。向上清液中邊攪拌邊加入5倍體積的95％乙醇，靜置過夜。離心后沉淀用無水乙醇和丙酮交替洗滌3次后，得鐵皮石斛粗多糖14.0g。

2、多糖純化

將上述制備的鐵皮石斛粗多糖5.0g溶解于80ml去離子水中，以4000r/min離心10min除去不溶物，上清液上樣于deaesepharosefastflow弱陰離子交換柱，依次用水，0.1m、0.2mnacl溶液洗脫，收集器收集洗脫液。硫酸-苯酚法檢測并繪制洗脫曲線，根據(jù)洗脫曲線收集0.1mnacl溶液洗脫部分。洗脫液經(jīng)濃縮、透析、冷凍干燥后得到初步純化的多糖doa1。取doa1溶解于磷酸鹽緩沖液中(0.05m，ph＝6.0)于37℃加入淀粉酶(底物和酶的濃度均為10mg/ml)，反應(yīng)1h后，100℃、5min滅活，離心后取上清液濃縮、透析、冷凍干燥后得doa1a。取200mgdoa1a溶解于3ml去離子水中，4000r/min離心10min。取上清液上樣于sephacryl^tms-300凝膠柱，以0.2mnacl洗脫并控制流速0.3ml/min。硫酸-苯酚法檢測并繪制洗脫曲線，根據(jù)洗脫曲線收集洗脫液，將洗脫液濃縮、透析、冷凍干燥后得到純化的多糖s32。

s32在串連ultrahydrogel^tm2000和ultrahydrogel^tm500多糖分析凝膠柱上的特征圖譜如圖1所示(使用agilent1260液相色譜儀，色譜條件為：流動(dòng)相：0.1mnano3；流速：0.5ml/min；柱溫：25℃。檢測器：示差檢測器和紫外檢測器)。

實(shí)施例2：s32的結(jié)構(gòu)鑒定

1、多糖的部分酸水解

取s32400mg溶解于0.05m的三氟乙酸中，密封后于100℃水解1h。反應(yīng)完畢后，去離子水透析(1l×5)，透析內(nèi)液濃縮、冷凍干燥得到部分酸水解產(chǎn)物s32-05i。

2、糖醛酸含量測定(間苯基苯酚法)

a.試劑

試劑a：取硼砂(nab4o7·10h2o)1.1925g，加入濃硫酸40ml，攪拌溶解(可稍加熱)，冷卻后，用濃硫酸定容至250ml。

試劑b：取0.25gnaoh，加適量水溶解，定容至50ml，加入間苯基苯酚75mg，攪拌溶解。

糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(150μg/ml)：取葡萄糖醛酸7.5mg，溶于水中，加去離子水定容至50ml。

樣品溶液(150μg/ml)：取樣品按上述標(biāo)準(zhǔn)溶液方法配制。

b.方法

表1

注：以上表1中，1-5號(hào)管中為標(biāo)準(zhǔn)液，6號(hào)管中為樣液。

取10ml試管，按表1中的量加入標(biāo)準(zhǔn)溶液/樣液以及水，冰浴下加入試劑a，搖勻，100℃水浴5min，然后在冰水中冷卻，加入試劑b，混合均勻，室溫放置15min，測定od520。

檢測結(jié)果：由上述方法測得s32中的糖醛酸含量為15.0％。由此推測，該多糖含有糖醛酸，其含量約為15.0％。

3、紅外光譜分析

取s32多糖樣品約2mg，采用溴化鉀壓片法測定原糖s32及其硫酸化衍生物s32s的紅外光譜，結(jié)果如圖2和圖3。

4、糖醛酸還原(conrad法)

a)多糖樣品40mg溶于40ml去離子水中，攪拌狀態(tài)下加入cmc600mg，ph計(jì)監(jiān)控下滴加0.01mhcl維持ph值在4.75，反應(yīng)2.5小時(shí)。

b)滴加硼氫化鈉溶液(2m)16ml，其間用4m鹽酸控制ph值在7.0左右。硼氫化鈉于45min內(nèi)加完。硼氫化鈉加完后，室溫繼續(xù)反應(yīng)2小時(shí)(ph＝7.0)。

c)反應(yīng)液用去離子水透析2天，2l×6。透析袋內(nèi)液減壓濃縮，凍干。

5、nmr分析

取多糖s3230mg，加d2o0.45ml溶解，加2.5μl丙酮為內(nèi)標(biāo)(δh＝2.23ppm，δc＝31.5ppm)，于brukeravanceiii500m核磁共振儀上，25℃分別測定一維和二維核磁共振譜，并參考核磁圖譜對s32以及s32s進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證，結(jié)果如圖4，圖5、圖6a和圖6b所示。

6、s32結(jié)構(gòu)綜合解析

hpgpc法分析表明s32為均一多糖，分子量為3.7×10⁴da。

對s32還原前后糖組成、糖醛酸含量測定以及¹³cnmr圖譜的綜合分析表明s32含有木糖、4-甲氧基-葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、葡萄糖以及痕量的半乳糖和鼠李糖，其對應(yīng)的比例為62.7:12.3:8.9:8.5:3.7:3.9。對s32原糖以及水解和還原后的多糖進(jìn)行甲基化分析，綜合分析結(jié)果可知s32的連接方式主要有含有1,4-木糖(42.8％)、1,2,4-木糖(21.4％)、1,4-葡萄糖(5.4％)、末端連接的4-甲氧基-葡萄糖醛酸(15.1％)、末端連接的阿拉伯糖(6.2％)，極少量的末端半乳糖(1.6％)，1,3-鼠李糖(2.0％)和末端連接的木糖(5.5％)。

紅外圖譜(圖2)顯示，3429.24cm^-1為o-h伸縮振動(dòng)吸收峰，2930cm^-1為c-h伸縮振動(dòng)吸收峰，1464.93–1044.89cm^-1附近為c-o和糖環(huán)振動(dòng)信號(hào)，1734.25cm^-1為羧基c＝o伸縮振動(dòng)，表明該多糖含有糖醛酸。

¹³cnmr譜中(圖4)，位于109.63ppm的端基碳信號(hào)，可歸屬為末端α-l-呋喃阿拉伯糖的c-1信號(hào)。位于103.03ppm和102.88ppm的碳信號(hào)均屬于不同化學(xué)環(huán)境下的1,4-β-d-吡喃木糖的c-1信號(hào)。102.59ppm處的端基碳信號(hào)歸屬于1,2,4-β-d-吡喃木糖的c-1信號(hào)。1,4-α-d-吡喃葡萄糖的c-1信號(hào)則可歸屬到101.26ppm處的端基碳信號(hào)。105.00ppm處的端基碳信號(hào)則可歸屬為末端的β-d-半乳糖的c-1信號(hào)，99.79ppm處的信號(hào)峰則歸屬為1,3-α-l-吡喃鼠李糖的c-1信號(hào)，其甲基碳的信號(hào)峰則出現(xiàn)在18.05ppm處。而末端的木糖的c-1信號(hào)則被102.4ppm處的信號(hào)峰掩蓋。末端連接的4-甲氧基-α-d-葡萄糖醛酸的c-1信號(hào)則可在98.78ppm處觀察到，而位于61.10ppm的甲氧基碳信號(hào)以及177.74ppm的羧酸c＝o信號(hào)則進(jìn)一步證實(shí)了甲氧基和糖醛酸的存在。

在hmbc圖譜中(圖5)，以a，b、c、d、e、f、g和h分別代表1,4-β-d-吡喃木糖，1,2,4-β-d-吡喃木糖、末端連接的4-甲氧基-α-d-吡喃葡萄糖醛酸、1,4-β-d-吡喃葡萄糖、末端連接的α-l-呋喃阿拉伯糖、β-d-吡喃半乳糖、末端連接的β-d-吡喃木糖和1,3-連接的-α-l-吡喃鼠李糖。遠(yuǎn)程相關(guān)峰109.63/3.43ppm、102.40/3.43ppm、101.26/3.43ppm、99.79/3.43ppm和98.78/3.43ppm，分別表示e的c-1和b的h-2遠(yuǎn)程相關(guān)，g的c-1和b的h-2遠(yuǎn)程相關(guān)，d的c-1和b的h-2遠(yuǎn)程相關(guān)，h的c-1和b的h-2遠(yuǎn)程相關(guān)，c的c-1和b的h-2遠(yuǎn)程相關(guān)，說明e、g、d、h、c通過糖苷鍵與b的c-2相連，而d的c-4(79.16ppm)與e的h-1(5.27ppm)遠(yuǎn)程相關(guān)，說明部分e也通過糖苷鍵與d的c-4相連。相關(guān)峰61.10/3.23ppm和83.59/3.45ppm為-och3的c和4-甲氧基-α-d-吡喃葡萄糖醛酸的h-4遠(yuǎn)程相關(guān)，4-甲氧基-α-d-吡喃葡萄糖醛酸的c-4和-och3的h遠(yuǎn)程相關(guān)信號(hào)。進(jìn)一步證實(shí)了甲氧基連接于葡萄糖醛酸的c-4位。綜上所述，該多糖是以1,4-β-d-吡喃木糖為主鏈，其它糖殘基為支鏈直接或者間接連接在主鏈糖殘基的c-2位。

以上結(jié)果表明s32的結(jié)構(gòu)為：

rx為α-l-araf-(1→4)-α-d-glcp-(1→；β-d-xylp-(1→；α-l-araf-(1→，或β-d-galp-(1→3)-α-l-rhap-(1→。

實(shí)施例3：s32s的制備及結(jié)構(gòu)鑒定

1、s32s的制備

向6ml吡啶中逐滴加入2ml氯磺酸制備成硫酸化試劑。將104mgs32溶于5ml甲酰胺中，攪拌溶解，將上述硫酸化試劑于60℃加入s32多糖溶液中反應(yīng)3h。反應(yīng)結(jié)束后，于冰浴中加入5m氫氧化鈉中和后用飽和碳酸氫鈉溶液透析24h后并用去離子水繼續(xù)透析72h。透析內(nèi)液濃縮，冷凍干燥后得224mg淡黃色蓬松硫酸化多糖s32s。

2、s32s結(jié)構(gòu)鑒定及解析

1)硫酸基含量測定(氯化鋇-明膠法)。

試劑配制：

(1)1mol/lhcl溶液：8.3ml濃鹽酸(12n)加水定容至100ml。

(2)氯化鋇-明膠試劑：1.25g明膠溶于50ml水中，加熱溶解，定容至250ml；取250ml該溶液，加入2.5g氯化鋇，溶解后4℃下放置。

(3)3％三氯乙酸溶液(w/v)：取三氯乙酸(ar)30.0g溶于水中，加水定容至1000ml。

(4)標(biāo)準(zhǔn)硫酸基溶液：精確稱取無水硫酸鈉86.7mg，置于100ml容量瓶中，加入1mol/lhcl溶液至刻度。

測定方法：

(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線測定：精確量取0～0.2ml標(biāo)準(zhǔn)溶液(每管按0.04ml遞增)于具塞試管中，補(bǔ)加1mol/lhcl至體積為0.2ml，分別加入3.8ml3％三氯乙酸和1ml氯化鋇-明膠試液，混合后在室溫下靜置15～20min，以0號(hào)(不含標(biāo)準(zhǔn)液)作參比測定在360nm的吸光度od360。

(2)樣品測定：精確稱取樣品4.5mg左右，置于試管中，加入1mol/lhcl4.5ml，封管后，振蕩器混勻，加熱輔助溶解若干分鐘，于100℃烘箱中加熱水解2.5h，冷卻至室溫后取0.2ml進(jìn)行測定，其余操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線各管。

檢測結(jié)果：由上述方法測得s32s硫酸基的取代度為0.90。由此推算平均每個(gè)糖殘基單元上連有一個(gè)硫酸基團(tuán)。

2)s32s的結(jié)構(gòu)綜合解析

經(jīng)hpgpc分析s32s的尖峰分子量為5.4×10⁴da。氯化鋇-明膠比濁法測得多糖硫酸基取代度約為0.90。s32s紅外圖譜(圖3)與原糖s32紅外圖譜(圖2)對比，1267.26cm^-1出現(xiàn)的較強(qiáng)的吸收峰可歸屬為s＝o的特征伸縮振動(dòng)吸收峰，表明硫酸化成功。圖6a為s32s的dept135nmr圖譜，對比原糖圖譜(圖6b)，硫酸化的位點(diǎn)主要無區(qū)域選擇性地發(fā)生在1,4-β-d-吡喃木糖的c-2位或者c-3位，1,4-β-d-吡喃葡萄糖的硫酸化位點(diǎn)主要發(fā)生在c-6，大部分的4-甲氧基-α-d-吡喃葡萄糖醛酸在c-3位發(fā)生了硫酸化取代，少量的1,2,4-β-d-吡喃木糖的c-3位也發(fā)生取代。

藥理學(xué)實(shí)施例：

1、s32及s32s抑制hmec-1細(xì)胞管腔形成實(shí)驗(yàn)

將在含有15％胎牛血清(fbs)，2mml-谷氨酰胺，10ng/ml表皮生長因子(egf)的mcdb131培養(yǎng)基中培養(yǎng)的hmec-1細(xì)胞置于5％co2培養(yǎng)箱37℃孵育，2-3天換培養(yǎng)液1次。

將基質(zhì)膠(50μl)均勻涂布于96孔板中并置于37℃培養(yǎng)箱中固化。半個(gè)小時(shí)后，將50μlhmec-1細(xì)胞以5×10⁴/孔的密度接種在96孔板內(nèi)并加入50μl不同濃度的s32s(調(diào)整終濃度為0.14，0.29，0.58μm)，以空白組作為對照。12h后采用顯微鏡在20×物鏡下隨機(jī)挑選3個(gè)視野并記錄(olympusix51digitalcamera(tokyo,japan))。

由圖7可觀察到，空白組在單獨(dú)孵育12h后，細(xì)胞變成長梭形并向基質(zhì)中延伸生長，線形排列形成管狀結(jié)構(gòu)，多個(gè)管狀結(jié)構(gòu)相互連接形成完整三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。s32對hmec-1細(xì)胞管腔形成并無明顯抑制作用，而與低濃度(0.14μm)的硫酸化多糖s32s共孵育12h后，管腔形成受到抑制，在濃度0.29μm時(shí)，hmec-1細(xì)胞基本不形成完整的管腔，管腔形成受到明顯抑制。證明硫酸化多糖s32s具有抑制血管生成的活性。

2、s32s抑制hmec-1細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

將hmec-1細(xì)胞(5×10⁵細(xì)胞/孔)培養(yǎng)于六孔板中。24h后，用100μl的槍頭末端在六孔板的中央作劃痕。磷酸緩沖溶液(pbs)輕輕吹洗3遍以除去劃落的細(xì)胞碎片，分別加入含s32s新的mcdb131培養(yǎng)液(調(diào)整終濃度依次為0，0.14，0.29，0.58μm)，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h后，采用顯微鏡在20×物鏡下記錄在不同時(shí)間段不同濃度s32s對劃痕愈合影響情況。應(yīng)用image-j軟件定量計(jì)算細(xì)胞遷移的面積。圖8可觀察到，空白組在培養(yǎng)12h后基本愈合，而s32s實(shí)驗(yàn)組可以在不同濃度下均抑制hmec-1細(xì)胞的遷移。與空白組細(xì)胞遷移率(73.6±2.5％)相比，在濃度為0.14μm時(shí)，hmec-1細(xì)胞遷移率僅為21.8±2.4％，隨著濃度升高到0.29μm和0.58μm，對應(yīng)的hmec-1的細(xì)胞遷移率分別為44.8％(±2.2)及37.2％(±1.5)。綜上所述，s32s能在低濃度下抑制hmec-1細(xì)胞遷移，但不呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。

3、s32s對正常hmec-1細(xì)胞/lo2細(xì)胞的細(xì)胞毒性

將hmec-1細(xì)胞/lo2細(xì)胞50μl(5×10³細(xì)胞/孔)種入96孔板內(nèi)，置于5％co2的培養(yǎng)箱中37℃孵育過夜后加入50μl含有s32s的mcdb131/rpmi1640(含10％fbs，100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素)培養(yǎng)液，使之終濃度為0-18.52μm，每個(gè)濃度設(shè)置三個(gè)副孔。繼續(xù)于37℃、5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于24h，48h，72h后，每孔加入10μl5mg/mlmtt，繼續(xù)孵育4h后小心棄去培養(yǎng)液上清。加入150μldmso溶解甲瓚晶體。置于搖床快速搖20分鐘使其充分溶解，之后于490nm處測定其吸光度值。記錄結(jié)果并計(jì)算細(xì)胞的存活率。

如圖9所示，s32s即使在較高濃度(1mg/ml)時(shí)，對正常hmec-1細(xì)胞和lo2細(xì)胞于72h內(nèi)無明顯細(xì)胞毒性。

以上藥理實(shí)驗(yàn)表明s32s在0.29μm的濃度下，在體外可完全抑制血管生成，并在細(xì)胞水平上可抑制hmec-1細(xì)胞的遷移。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明s32s對正常hmec-1和lo2細(xì)胞幾乎無毒性。因此，s32s有望被開發(fā)成為一種抗血管生成類抗腫瘤藥物。

最后有必要說明的是，以上實(shí)施例僅用于進(jìn)一步詳細(xì)地說明本發(fā)明的技術(shù)方案，不能理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，任何根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容作出的一些非本質(zhì)的調(diào)整和改進(jìn)均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。