本發(fā)明屬于基因工程和生物技術領域，涉及一種靶向骨基因編輯系統(tǒng)的開發(fā)，具體涉及一種靶向骨的外泌體載體、crispr/cas9基因編輯系統(tǒng)及應用。

背景技術：

骨是人體的重要組成部分，由骨膜、骨質、骨髓三部分構成。正常骨組織時刻處于成骨細胞骨形成和破骨細胞骨吸收的骨重建動態(tài)平衡過程中，兩者相互協調，共同維持骨的正常生理功能。當這種動態(tài)平衡受到破壞，就會產生各種骨病，如骨質疏松、骨硬化、骨腫瘤、腫瘤骨轉移、骨關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎等。由于骨組織特殊的結構，如硬度大、滲透性差、血流量低等，使得通過全身給藥途徑藥物很難在骨富集，達到有效的治療濃度，治療效果不佳，且增加藥物濃度對其他非骨組織及器官產生較大的毒副作用。因此，尋找一個高效的骨靶向藥物遞送載體是解決這一問題的關鍵。

傳統(tǒng)的藥物遞送載體包括病毒載體、納米材料等。病毒載體如慢病毒載體、腺病毒載體等，首先被作為基因藥物運載工具，已有臨床試驗成功應用腺病毒載體治療雷伯氏先天性黑內障患者，然而由于逆轉錄病毒可整合至基因組中以及突變回野生型病毒的危險性存在，使得病毒載體的應用受到限制。隨著納米技術的發(fā)展，人工納米材料如脂質體、納米顆粒、納米棒、納米線、碳納米管和金納米粒子等越來越多應用于藥物遞送系統(tǒng)中，研究已證明納米材料可有效運載藥物至靶位點并發(fā)揮作用，但由于其人工合成特征，納米材料仍然存在生物相容性低、穩(wěn)定性差等缺點。因此，外泌體作為一種天然的納米囊泡，成為藥物遞送載體的最佳選擇。

外泌體是一種納米膜性囊泡，最初被視為溶酶體降解過程、細胞廢物的回收和排泄的參與者。人體幾乎所有類型細胞均可產生外泌體，包括網織紅細胞、t細胞、b細胞、血小板、樹突細胞、肥大細胞等血細胞及上皮細胞、腫瘤細胞等，且外泌體存在于幾乎所有類型體液，包括血液、尿液、腦脊液、母乳、腹水、羊水、精液等。隨著發(fā)明人研究的深入，發(fā)現外泌體不僅可以攜帶生物活性分子如核酸、蛋白質和脂質，而且是細胞間物質傳遞和信息交流的重要中介，外泌體呈圓形，大小約30～100nm，蔗糖水溶液密度為1.13～1.19g/ml，沉降速度為100000g。由于外泌體的體積很小，使得他們可以逃避體內單核-吞噬細胞系統(tǒng)的吞噬作用，在血液循環(huán)中穩(wěn)定存在，并且可以穿過血管內皮細胞到達靶細胞。此外，研究還發(fā)現外泌體可以通過嚴密的生理屏障，如血腦屏障、胎盤屏障。此外，由于外泌體是生物來源的，其免疫原型低，可以避免抗體、調理素、補體等的激活。假如能在病人體內尋找到一個理想的外泌體來源，提取自體外泌體，攜帶藥物回輸至病人體內，能極大避免免疫排斥反應，這將成為藥物遞送系統(tǒng)的一個重要里程碑。

外泌體主要通過與細胞膜表面受體相互作用及直接膜融合兩種方式進入靶細胞，外泌體通過直接膜融合的方式將藥物釋放至細胞質中，可以逃避溶酶體途徑，減少藥物的降解。此外外泌體膜表面配體與特異性受體間的相互作用，是實現外泌體靶向運輸的重要機制。還可以通過對外泌體表面的膜蛋白進行修飾來實現其靶向運輸。

2011年alvarez等首次成功利用外泌體治療鼠阿爾茨海默病模型，其對外泌體表面膜蛋白lamp2b進行改造獲得表達rvg-lamp2b融合蛋白的外泌體，并通過電穿孔的方法使外源性sirna進入外泌體中，尾靜脈注射至小鼠體內，外泌體表面的rvg通過與乙酰膽堿受體結合將sirna釋放入鼠腦神經元、少突膠質細胞和小膠質細胞中，從而顯著下調了阿爾茨海默病相關蛋白的表達(蛋白下降62％)，減少了β淀粉的沉積。

骨結構包括外層的骨組織及其內的骨髓組織，骨組織與骨髓組織通過豐富的血管網密切聯系。羥基磷灰石是外層骨組織的主要組成成分，因此羥基磷灰石成為研究骨靶向藥物遞送系統(tǒng)的重要靶點。有研究表明，骨形成表面羥基磷灰石以低結晶形式存在，而骨吸收表面的羥基磷灰石以高結晶形式存在。寡肽中重復的氨基酸序列能與羥基磷灰石結合，且氨基酸序列的不同對不同晶型的羥基磷灰石的親和力不同。

骨髓是填充于骨髓腔及骨松質間的海綿狀組織，其不僅是人體主要的造血器官，還是許多骨腫瘤發(fā)生地點及骨轉移瘤的轉移地點。此外，間充質干細胞在骨髓含量豐富，其具有多向分化潛能，可以分化為骨、軟骨、脂肪、肌肉、神經、內皮等多種組織細胞，近年來成為骨組織工程的首選種子細胞。骨髓血供豐富，血竇壁是骨髓組織和血循環(huán)進行物質交換的屏障，即骨髓-血屏障，由于骨髓-血屏障的存在及骨髓復雜的生理結構，使得傳統(tǒng)給藥途徑藥物很難進入骨髓。因此，骨髓靶向成為治療各種骨病的關鍵。

內皮細胞是血竇壁的主要組成細胞，是血循環(huán)中藥物進入骨髓的主要屏障，因此內皮細胞成為骨髓靶向的重要靶位點。此外，骨髓微環(huán)境對骨代謝有重要影響，骨的發(fā)生需要新生血管的參與，通過血液循環(huán)為新骨形成提供必需的營養(yǎng)物質及運走代謝產物，因此通過內皮細胞靶向促進新生血管形成從而促進新骨形成成為治療各種骨病的新方法。

crispr/cas9(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/crispr-associated9)是近年發(fā)展起來的rna向導的基因編輯和調控技術。相比傳統(tǒng)的zfns以及talens技術，crispr/cas9打靶效率更高，操作更為簡便，且可在細胞中實現對多個基因同時操作。crispr/cas9是細菌和古細菌在長期進化過程中形成的一種適應性免疫防御，可用來對抗入侵的病毒及外源dna。crispr/cas系統(tǒng)共有3種類型，其中crispr/casii型系統(tǒng)最為簡單，目前在研究中使用得也最廣泛。野生型crispr/casii系統(tǒng)由含重復序列小rnacrrna(crisprrna，crrna)、輔助小片段tracrrna(trans-activatingcrrna，tracrrna)以及核酸酶cas9蛋白組成。crispr即規(guī)律間隔短回文重復序列，由多個相同的重復序列及穿插其間的間隔序列組成，間隔序列可以特異性地識別外源核酸，轉錄形成crrna。crispr/casii型系統(tǒng)作為細菌體內的免疫機制，其通過以下三個步驟作用：1、間隔序列的獲得，當細菌被病毒或外源dna入侵時，crispr/cas系統(tǒng)能夠識別入侵者攜帶的外源核酸中的原型間隔序列的毗鄰基序，即pam(protospacer-associatedmotif,pam)，并將pam旁的原型間隔序列加工整合入自身基因組中的crispr序列中；2、crrnas的轉錄與加工，crispr轉錄產生pre-crrna，tracrrna(trans-activatingcrrna)與pre-crrna結合形成tracrrna:pre-crrna雙鏈復合物。該復合物在cas9的存在下,被雙鏈rna特異的核糖核酸內切酶rnaseiii進行切割，產生成熟的crrnas；3、crispr系統(tǒng)對入侵核酸的切割，成熟的crrnas與tracrrna及cas9結合形成一個三元的沉默復合物，該復合物在crrna的引導下與入侵的雙鏈dna中目的序列進行結合，由cas9蛋白于原型間隔序列處進行切割，導致入侵病毒或核酸降解。

目前該系統(tǒng)已被人工改造為基因定點編輯的工具，研究人員根據crrna和tracrrna的結構特征,設計出模擬二者結合后形成的二聚體結構的單鏈引導rna(singleguiderna，sgrna)，sgrna具備crrna-tracrrna復合物的功能，能夠與cas9核酸內切酶結合并將后者引導至基因組上的靶位點處進行結合與切割。除了基因定點編輯外，crispr/cas9還被改造用于基因調控。將cas92個切割域(ruv和hnh)d10a和h840a位點突變，會使cas9蛋白失去對dna的切割活性，但不影響其與dna結合的能力，這種失去dna切割活性的cas9蛋白命名為dcas9(deadcas9)。sgrna可以介導dcas9于靶位點結合，利用其空間位阻效應，如果dcas9與靶基因的閱讀框結合可以阻斷rna聚合酶的延伸，如果dcas9與靶基因啟動子區(qū)域結合則可以阻斷基因轉錄起始階段，由此形成了crispr/dcas9基因轉錄抑制系統(tǒng)。

除此之外，張鋒等人還將該系統(tǒng)成功改造為基因激活系統(tǒng)，cas9去活化使其失去剪切功能，保留與dna結合功能，再通過ms2適配子改良sgrna，使其從cas9復合體伸出四環(huán)和莖環(huán)2結構作為活化結構域，招募轉錄激活因子，他們用改造后的crispr系統(tǒng)成功激活了十個基因。crispr/cas9作為一種高效的基因編輯和調控工具，已成為治療許多疾病的新方法。

因此，開發(fā)能夠特異性的具有骨靶向的基因編輯系統(tǒng)就成為本領域迫切需要解決的一個技術問題。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的是提供一種靶向骨的外泌體載體、crispr/cas9基因編輯系統(tǒng)及應用，通過對外泌體表面膜蛋白lamp2b進行改造，分別與(aspserser)6、(asp)8、credvw寡肽融合，使外泌體能分別靶向骨形成表面、骨吸收表面及內皮細胞，并攜帶crispr/cas9基因編輯系統(tǒng)，治療各種骨病。

為達此目的，本發(fā)明采用以下技術方案

第一方面，本發(fā)明提供一種靶向骨的外泌體載體，所述外泌體載體包括靶向骨形成表面、骨吸收表面或內皮細胞中的任意一種的靶向肽。

本發(fā)明中，所述骨形成表面覆蓋有成骨細胞系不同階段的細胞，包括前體成骨細胞、成熟成骨細胞。

所述骨吸收表面表面覆蓋有破骨細胞系不同階段的細胞，包括前體破骨細胞、成熟破骨細胞。

本發(fā)明中，隨著研究的深入，發(fā)現外泌體不僅可以攜帶生物活性分子，而且是細胞間物質傳遞和信息交流的重要中介，由于外泌體的體積很小，可以逃避體內單核-吞噬細胞系統(tǒng)的吞噬作用，在血液循環(huán)中穩(wěn)定存在，還可以穿過血管內皮細胞到達靶細胞，不僅如此，研究還發(fā)現外泌體可以通過嚴密的生理屏障，可以避免抗體、調理素、補體等的激活，所以本申請通過改變外泌體的表面膜蛋白lamp2b，從而達到靶向的效果。

根據本發(fā)明，所述骨形成表面靶向的氨基酸序列如seqidno.1所示，所述seqidno.1所述的氨基酸序列如下：(aspserser)6。

根據本發(fā)明，所述骨形成表面靶向的核酸序列如seqidno.2所示，所述seqidno.2所述的核酸序列如下：gactcctcagactcctcagactcctcagactcctcagactcctcagactcctca。

根據本發(fā)明，所述骨吸收表面靶向的氨基酸序列如seqidno.3所示，所述seqidno.3所述的氨基酸序列如下：(asp)8。

根據本發(fā)明，所述骨吸收表面靶向的核酸序列如seqidno.4所示，所述seqidno.4所述的核酸序列如下：gacgacgacgacgacgacgacgac。

根據本發(fā)明，所述內皮細胞靶向的氨基酸序列如seqidno.5所示，所述seqidno.5所述的氨基酸序列如下：cys-arg-glu-asp-val-trp。

根據本發(fā)明，所述內皮細胞靶向的核酸序列如seqidno.6所示，所述seqidno.6所述的核酸序列如下：tgtagagaggatgtctgg。

本發(fā)明中，(aspserser)6與骨形成表面低結晶羥基磷灰石的親和力強，而(asp)8與骨吸收表面高結晶形式存在的羥基磷灰石親和力強，利用此特點，本專利將(aspserser)6、(asp)8分別與外泌體表面膜蛋白lamp2b融合，成功構建靶向骨形成表面及骨吸收表面的外泌體。

第二方面，本發(fā)明提供一種靶向骨的外泌體載體的制備方法，包括如下步驟：

(1)構建靶向肽修飾的lamp2b重組質粒；

(2)提取骨靶向外泌體。

根據本發(fā)明，所述制備方法包括如下具體步驟：

(1’)設計lamp2b的引物，以小鼠cdna為模板，pcr擴增獲得lamp2b片段，純化；

(2’)將步驟(1’)純化后的lamp2b片段、設計的骨形成表面、骨破壞表面或內皮細胞的靶向序列克隆到載體上，得到靶向肽修飾的lamp2b重組質粒；

(3’)將步驟(2’)的靶向肽修飾的lamp2b重組質粒分別轉染293t細胞，培養(yǎng)，收集細胞培養(yǎng)基，離心去除細胞及細胞碎屑，sbi外泌體提取試劑盒提取外泌體。

本發(fā)明中，所述骨形成表面、骨破壞表面或內皮細胞可根據需要進行選擇，本領域技術人員可以把其中一個作為靶向目標從而選擇對應的骨形成表面、骨破壞表面或內皮細胞的靶向序列進行連接。

根據本發(fā)明，步驟(1’)所述的lamp2b的引物的核酸序列如seqidno.7-8所示，所述seqidno.7-8所示的核酸序列如下：

上游引物(seqidno.7)：ccttaattaaccatgtgcctctctccggttaaagg；

下游引物(seqidno.8)：ccgtttaaacttactaaaattgctcatatccagtat。

根據本發(fā)明，步驟(2’)所述骨形成表面靶向序列如seqidno.2所示，所述seqidno.2所述的核酸序列如下：gactcctcagactcctcagactcctcagactcctcagactcctcagactcctca。

根據本發(fā)明，步驟(2’)所述骨吸收表面靶向序列如seqidno.4所示，所述seqidno.4所述的核酸序列如下：gacgacgacgacgacgacgacgac。

根據本發(fā)明，步驟(2’)所述內皮細胞的核酸序列如seqidno.6所示，所述seqidno.6所述的核酸序列如下：tgtagagaggatgtctgg。

根據本發(fā)明，步驟(2’)所述的載體為pwpi載體。

根據本發(fā)明，步驟(2’)所述基因序列克隆到載體上連接到paci和pmei克隆位點。

根據本發(fā)明，步驟(3’)所述的培養(yǎng)的時間為18-30h，例如可以是18h、19h、20h、21h、22h、23h、24h、25h、26h、27h、28h、29h或30h，優(yōu)選為20-28h，進一步優(yōu)選為24h，以及上述數值之間的具體點值，限于篇幅及出于簡明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點值。

根據本發(fā)明，步驟(3’)所述的培養(yǎng)基為無血清dmem培養(yǎng)基。

根據本發(fā)明，步驟(3’)所述離心的轉速為2000-4000g，例如可以是2000g、2200g、2300g、2500g、2600g、2800g、3000g、3200g、3500g、3600g、3800g或4000g，優(yōu)選為2500-3500g，進一步優(yōu)選為3000g，以及上述數值之間的具體點值，限于篇幅及出于簡明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點值。

根據本發(fā)明，步驟(3’)所述離心的時間為10-20min，例如可以是10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min或20min，優(yōu)選為12-18min，進一步優(yōu)選為15min，以及上述數值之間的具體點值，限于篇幅及出于簡明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點值。

第三方面，本發(fā)明提供一種靶向骨的基因編輯系統(tǒng)，所述基因編輯系統(tǒng)包括第一方面所述的外泌體載體和基因編輯器。

根據本發(fā)明，所述基因編輯器為crisp/cas9基因編輯器、talens基因編輯器、zens基因編輯器，優(yōu)選為crisp/cas9基因編輯器。

根據本發(fā)明，所述crisp/cas9基因編輯器的sgrna為runx2基因的sgrna。

第四方面，本發(fā)明提供一種如第三方面所述的基因編輯系統(tǒng)的制備方法，包括如下步驟：所述crisp/cas9基因編輯器通過脂質體融合法裝載到外泌體載體中。

本發(fā)明中，傳統(tǒng)關于外泌體裝載藥物的研究多是一些小分子藥物，如小分子核酸、化合物等，通過電穿孔法將藥物裝載進外泌體中，但由于crispr/cas9基因編輯器中的cas9質粒及蛋白的分子量大，實驗發(fā)現無法使用電穿孔法裝載進外泌體，此外還嘗試用內源性募集法，即將質粒直接轉染細胞，收集該細胞產生的外泌體，實驗發(fā)現cas9質粒只有部分片段進入外泌體中，全長無法進入，cas9蛋白雖能進入外泌體，卻無法發(fā)揮功能。經過多次嘗試，發(fā)明人發(fā)現，采用脂質體融合法可以將crispr/cas9基因編輯器中的的cas9質粒成功轉載到外泌體載體中。

根據本發(fā)明，所述脂質體融合法具體包括如下步驟：

將runx2基因的sgrna電穿孔進入外泌體載體，將cas9質粒與lipo2000混合孵育20min后與電穿孔外泌體混合孵育6h，加入msc細胞培養(yǎng)基中，制備得到基因編輯系統(tǒng)。

與現有技術相比，本發(fā)明具有的有益效果：

(1)本發(fā)明通過對外泌體表面膜蛋白lamp2b進行改造，分別與(aspserser)6、(asp)8、credvw寡肽融合，使外泌體能分別靶向骨形成表面、骨吸收表面及內皮細胞；

(2)本發(fā)明開發(fā)骨靶向外泌體作為載體，crispr/cas9系統(tǒng)作為基因編輯和調控工具，二者結合將為各種骨病的治療有著重要意義；

(3)本發(fā)明通過脂質體融合法將crispr/cas9系統(tǒng)成功裝載進外泌體中，使其能到達靶細胞并發(fā)揮基因編輯和調控功能。

附圖說明

圖1為上為sgrna載體示意圖，下為dcas9載體示意圖；

圖2為(aspserser)6-lamp2b-pwpi載體的測序圖譜；

圖3為(asp)8-lamp2b-pwpi載體的測序圖譜；

圖4為cys-arg-glu-asp-val-trp-lamp2b-pwpi載體的測序圖譜；

圖5為實時熒光定量pcr檢測對照組與lamp2b-pwpi轉染組lamp2bmrna表達水平差異倍數圖；

圖6為蛋白免疫印跡法分別檢測細胞對照組、細胞flag-lamp2b轉染組和外泌體對照組、外泌體flag-lamp2b轉染組flag蛋白、gapdh蛋白的表達條帶圖；

圖7為crispr/dcas9runx2基因抑制系統(tǒng)示意圖；

圖8為流式細胞術檢測圖，其中，圖8(a)為lipo2000轉染組，圖8(b)為exosome轉染組；

圖9為實時熒光定量pcr分別檢測細胞對照組、細胞crispr/dcas9runx2基因抑制系統(tǒng)轉染組和外泌體對照組、外泌體crispr/dcas9runx2基因抑制系統(tǒng)轉染組runx2mrna表達水平差異倍數圖。

具體實施方式

實施例中描述到的各種生物材料的取得途徑僅是提供一種實驗獲取的途徑以達到具體公開的目的，不應成為對本發(fā)明生物材料來源的限制。事實上，所用到的生物材料的來源是廣泛的，任何不違反法律和道德倫理能夠獲取的生物材料都可以按照實施例中的提示替換使用。

為更進一步闡述本發(fā)明所采取的技術手段及其效果，以下結合本發(fā)明的優(yōu)選實施例來進一步說明本發(fā)明的技術方案，但本發(fā)明并非局限在實施例范圍內。

實施例中未注明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件，或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可通過正規(guī)渠道商購獲得的常規(guī)產品。

材料：

pmd19t載體(日本takara公司)

pwpi載體(美國addgene公司)

pcr引物(上海生工生物工程股份有限公司)

pcrmastermix(美國thermo公司)

paci限制酶(美國newenglandbiolabs公司)

pmei限制酶(美國newenglandbiolabs公司)

瓊脂糖凝膠回收試劑盒(美國omega公司)

trizolreagent(瑞士roche公司)

greenmaster(瑞士roche公司)

transfectionreagent(美國lifetechnology公司)

flag抗體(美國sigma-aldrich公司)

gapdh抗體(美國abcam公司)

exoquick-tctm外泌體提取試劑盒(美國systembiosciences公司)

pcr儀(美國appliedbiosystems公司)

qrt-pcr儀(美國bio-rad公司)

流式細胞儀(美國beckman-coulter公司)

透射電鏡(日本jeol公司)

實施例1：構建靶向骨形成表面的外泌體載體

所述外泌體載體如圖1所示，其包括sgrna和dcas9載體：

1)構建靶向肽修飾的lamp2b重組質粒

(1)設計lamp2b的引物，以小鼠cdna為模板，pcr擴增獲得lamp2b片段，純化；

上游引物(seqidno.7)：ccttaattaaccatgtgcctctctccggttaaagg；

下游引物(seqidno.8)：ccgtttaaacttactaaaattgctcatatccagtat。

pcr擴增反應體系如下：

反應條件如下：

所獲得pcr產物進行1％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定并用膠回收試劑盒回收純化，得到的lamp2b片段，將lamp2b片段連接到pmd19t載體中，得到lamp2b-t載體。

(2)nsi1限制內切酶切割lamp2b-t載體，采用1％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定并用膠回收試劑盒回收純化，并與下述的骨形成表面靶向的核酸序列連接并進行轉化，得到(aspserser)6-lamp2b-t載體；

所述骨形成表面靶向的核酸序列如seqidno.2所示，所述seqidno.2所述的核酸序列如下：gactcctcagactcctcagactcctcagactcctcagactcctcagactcctca；

(3)paci和pmei分別限制酶切(aspserser)6-lamp2b-t載體、pwpi載體，采用1％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定并用膠回收試劑盒回收純化，再將(aspserser)6-lamp2b片段與pwpi載體連接，轉化；

將(aspserser)6-lamp2b-pwpi載體進行基因檢測，所得的結果如圖2所示，驗證(aspserser)6-lamp2b-pwpi載體構建成功。

(4)將(aspserser)6-lamp2b-pwpi質粒通過lipo2000轉染293t細胞,24h后提取293t細胞總rna，通過反轉錄得到cdna，實時熒光定量pcr檢測對照組與轉染組lamp2bmrna表達水平，所得的結果如圖5所示，驗證(aspserser)6-lamp2b-pwpi載體構建成功。

2)提取骨靶向外泌體

(5)將步驟(3)的靶向肽修飾的lamp2b重組質粒分別轉染293t細胞，無血清dmem培養(yǎng)24h，收集細胞培養(yǎng)基，3000g離心15min后去除細胞和細胞碎屑，采用外泌體提取試劑盒提取外泌體。

將提取的外泌體在透射電鏡下觀察，提取外泌體呈圓形，直徑檢測大小約30-120nm。nsi1限制核酸內切酶酶切l(wèi)amp2b-t載體，將flag標簽連入得到flag-lamp2b-t載體，再通過paci和pmei分別限制酶切flag-lamp2b-t載體和pwpi載體，得到flag-lamp2b再與pwpi載體連接得到flag-lamp2b-pwpi載體。將flag-lamp2b-pwpi轉染293t細胞，收集細胞培養(yǎng)基外泌體，蛋白免疫印跡法分別檢測細胞對照組、細胞flag-lamp2b轉染組和外泌體對照組、外泌體flag-lamp2b轉染組flag蛋白、gapdh蛋白的表達，結果如圖6所示，說明lamp2b-pwpi載體構建成功。

實施例2：構建靶向骨吸收表面的外泌體載體

1)構建靶向肽修飾的lamp2b重組質粒

(1)設計lamp2b的引物，以小鼠cdna為模板，pcr擴增獲得lamp2b片段，純化；

上游引物(seqidno.7)：ccttaattaaccatgtgcctctctccggttaaagg；

下游引物(seqidno.8)：ccgtttaaacttactaaaattgctcatatccagtat。

pcr擴增反應體系如下：

反應條件如下：

所獲得pcr產物進行1％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定并用膠回收試劑盒回收純化，得到的lamp2b片段，將lamp2b片段連接到pmd19t載體中，得到lamp2b-t載體。

(2)nsi1限制內切酶切割lamp2b-t載體，采用1％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定并用膠回收試劑盒回收純化，并與下述的骨吸收表面靶向核酸序列連接并進行轉化，得到(asp)8-lamp2b-t載體；

所述骨吸收表面靶向核酸序列如seqidno.4所示，所述seqidno.4所述的核酸序列如下：gacgacgacgacgacgacgacgac；

(3)paci和pmei分別限制酶切(asp)8-lamp2b-t載體、pwpi載體，采用1％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定并用膠回收試劑盒回收純化，再將(asp)8-lamp2b片段與pwpi載體連接，轉化；

將(asp)8-lamp2b-pwpi載體進行基因檢測，所得的結果如圖3所示，驗證(asp)8-lamp2b-pwpi載體構建成功。

(4)將(asp)8-lamp2b-pwpi質粒通過lipo2000轉染293t細胞,24h后提取293t細胞總rna，通過反轉錄得到cdna，實時熒光定量pcr檢測對照組與轉染組lamp2bmrna表達水平，所得的結果如圖5所示，驗證(asp)8-lamp2b-pwpi載體構建成功。

2)提取骨靶向外泌體

(5)將步驟(3)的靶向肽修飾的lamp2b重組質粒分別轉染293t細胞，無血清dmem培養(yǎng)24h，收集細胞培養(yǎng)基，3000g離心15min后去除細胞和細胞碎屑，采用外泌體提取試劑盒提取外泌體。

將將提取的外泌體在透射電鏡下觀察，提取外泌體呈圓形，直徑檢測大小約30-120nm。nsi1限制核酸內切酶酶切l(wèi)amp2b-t載體，將flag標簽連入得到flag-lamp2b-t載體，再通過paci和pmei分別限制酶切flag-lamp2b-t載體和pwpi載體，得到flag-lamp2b再與pwpi載體連接得到flag-lamp2b-pwpi載體。將flag-lamp2b-pwpi轉染293t細胞，收集細胞培養(yǎng)基外泌體，蛋白免疫印跡法分別檢測細胞對照組、細胞flag-lamp2b轉染組和外泌體對照組、外泌體flag-lamp2b轉染組flag蛋白、gapdh蛋白的表達，結果如圖6所示，說明lamp2b-pwpi載體構建成功。

實施例3：構建靶向內皮細胞的外泌體載體

1)構建靶向肽修飾的lamp2b重組質粒

(1)設計lamp2b的引物，以小鼠cdna為模板，pcr擴增獲得lamp2b片段，純化；

上游引物(seqidno.7)：ccttaattaaccatgtgcctctctccggttaaagg；

下游引物(seqidno.8)：ccgtttaaacttactaaaattgctcatatccagtat。

pcr擴增反應體系如下：

反應條件如下：

所獲得pcr產物進行1％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定并用膠回收試劑盒回收純化，得到的lamp2b片段，將lamp2b片段連接到pmd19t載體中，得到lamp2b-t載體。

(2)nsi1限制內切酶切割lamp2b-t載體，采用1％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定并用膠回收試劑盒回收純化，并與下述的內皮細胞靶向的核酸序列連接并進行轉化，得到cys-arg-glu-asp-val-trp-lamp2b-t載體；

所述內皮細胞靶向的核酸序列如seqidno.6所示，所述seqidno.6所述的核酸序列如下：tgtagagaggatgtctgg；

(3)paci和pmei分別限制酶切cys-arg-glu-asp-val-trp-lamp2b-t載體、pwpi載體，采用1％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定并用膠回收試劑盒回收純化，再將cys-arg-glu-asp-val-trp-lamp2b片段與pwpi載體連接，轉化；

將cys-arg-glu-asp-val-trp-lamp2b-pwpi載體進行基因檢測，所得的結果如圖4所示，驗證cys-arg-glu-asp-val-trp-lamp2b-pwpi載體構建成功。

(4)將cys-arg-glu-asp-val-trp-lamp2b-pwpi質粒通過lipo2000轉染293t細胞,24h后提取293t細胞總rna，通過反轉錄得到cdna，實時熒光定量pcr檢測對照組與轉染組lamp2bmrna表達水平，所得的結果如圖5所示，驗證(asp)8-lamp2b-pwpi載體構建成功。

2)提取骨靶向外泌體

(5)將步驟(3)的靶向肽修飾的lamp2b重組質粒分別轉染293t細胞，無血清dmem培養(yǎng)24h，收集細胞培養(yǎng)基，3000g離心15min后去除細胞和細胞碎屑，采用外泌體提取試劑盒提取外泌體。

將提取的外泌體在透射電鏡下觀察，提取外泌體呈圓形，直徑檢測大小約30-120nm。nsi1限制核酸內切酶酶切l(wèi)amp2b-t載體，將flag標簽連入得到flag-lamp2b-t載體，再通過paci和pmei分別限制酶切flag-lamp2b-t載體和pwpi載體，得到flag-lamp2b再與pwpi載體連接得到flag-lamp2b-pwpi載體。將flag-lamp2b-pwpi轉染293t細胞，收集細胞培養(yǎng)基外泌體，蛋白免疫印跡法分別檢測細胞對照組、細胞flag-lamp2b轉染組和外泌體對照組、外泌體flag-lamp2b轉染組flag蛋白、gapdh蛋白的表達，結果如圖6所示，說明lamp2b-pwpi載體構建成功。

實施例4：構建crispr/cas9基因編輯器

以構建crispr/dcas9runx2基因抑制系統(tǒng)為例，crispr/dcas9基因抑制系統(tǒng)如圖7所示，共包含2個質粒：一個是dcas9質粒，編碼去活化的cas9核酸酶，一個是sgrna質粒，編碼sgrna，可引導dcas9核酸酶結合到runx2基因上，利用空間位阻效應抑制runx2基因的表達。

(1)設計runx2基因的sgrna(http://sam.genome-engineering.org/database/)；

runx2sgrna：

f:5’caccgagagagagagagaaagagca3’

r:5’aaactgctctttctctctctctct3’；

(2)bsmb1限制酶切sgrna(ms2)-zeo質粒，分別與runx2sgrna退火序列連接。

實施例5：基因編輯系統(tǒng)的組裝

通過脂質體融合法將質粒裝載進外泌體，首先選取與cas9質粒大小相近的egfp質粒，將egfp質粒與lipo2000混合孵育20min后與外泌體混合孵育6h，加入msc細胞培養(yǎng)基中，將lipo2000直接轉染組作為對照，48h后流式細胞術檢測egfp的表達，結果如圖8(a)-8(b)所示，可見綠色熒光，說明脂質體融合法可將egfp質粒裝載至外泌體中。

同樣的，通過脂質體融合法將cas9質粒裝載進外泌體中，首先runx2sgrna通過電穿孔法進入exosome中，再將cas9質粒與lipo2000混合混合孵育20min后與外泌體混合孵育6h，加入msc細胞培養(yǎng)基中，將lipo2000直接轉染組作為對照，48h后qrt-pcr檢測runx2基因表達，檢測結果如圖9所示，可見runx2表達下降，說明脂質體融合法能將cas9質粒裝載入外泌體中并發(fā)揮作用。

申請人聲明，本發(fā)明通過上述實施例來說明本發(fā)明的詳細方法，但本發(fā)明并不局限于上述詳細方法，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細方法才能實施。所屬技術領域的技術人員應該明了，對本發(fā)明的任何改進，對本發(fā)明產品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護范圍和公開范圍之內。