本發(fā)明屬于畜產(chǎn)品安全生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測鴨源性成分的rpa引物、試劑盒及檢測方法。

背景技術(shù)：

民以食為天，食以安為先，食品是人類社會賴以生存的第一物質(zhì)基礎(chǔ)。隨著人民生活水平的提高，動物源性食品的消費(fèi)量在逐年增加。食源性疾病和肉食品的潛在危險性不論在發(fā)達(dá)國家還是發(fā)展中國家都沒有得到有效控制，畜禽類肉食品的質(zhì)量與安全問題已經(jīng)成為一個全球性的問題。

從核酸分子水平上對動物進(jìn)行物種鑒定、物種起源和多樣性評估以及對動物源性食品進(jìn)行檢驗(yàn)研究，是目前動物源性成分研究的最有效手段。目前已頒布的標(biāo)準(zhǔn)只有3項(xiàng)地方標(biāo)準(zhǔn)是關(guān)于鴨源性成分的檢測，主要采用的是常規(guī)定性pcr法和實(shí)時熒光pcr法對鴨動物源性的定性檢測。

其中，基于常規(guī)pcr-凝膠電泳法的鴨動物成分定性分析標(biāo)準(zhǔn)有地方標(biāo)準(zhǔn)dbs22/018-2013(畜肉中鴨源性成分)和db22/t2049-2014(鴨源性成分)，基于實(shí)時熒光pcr法的動物成分定性分析標(biāo)準(zhǔn)有地方標(biāo)準(zhǔn)db64/t965-2014(雞、鴨源性成分)，但是，目前常規(guī)pcr和熒光pcr檢測方法存在操作繁瑣、成本高、單一性等問題。

在畜產(chǎn)品動物源性成分檢測中，迫切需要建立快速簡便的核酸檢測方法，用于市場監(jiān)管和例行監(jiān)測。與常規(guī)pcr和熒光實(shí)時pcr定性檢測方法相比，利用聚合酶重組酶擴(kuò)增(recombinasepolymeraseamplification，rpa)對動物源性肉及肉制品進(jìn)行定性高通量檢測，其模仿體內(nèi)復(fù)制機(jī)理，反應(yīng)不需要反復(fù)升降溫的解鏈與退火過程，整個反應(yīng)簡單快速，能夠在15分鐘內(nèi)進(jìn)行常溫下的快速目標(biāo)靶基因的核酸檢測。

rpa方法的關(guān)鍵在于擴(kuò)增引物的設(shè)計。pcr引物多半是不適用的，這是因?yàn)?，rpa引物比一般pcr引物長，通常需要達(dá)到30-38個堿基，引物過短會降低重組率，影響擴(kuò)增速度和檢測靈敏度。因此，rpa的引物設(shè)計難度較大。

目前，已報到的鴨源性成分檢測方法中，主要是利用pcr儀在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行常規(guī)的檢測，這些方法還不能進(jìn)一步滿足畜產(chǎn)品的快速檢測。國內(nèi)外目前還沒有利用rpa技術(shù)對鴨源性成分的物種特異性的鑒定。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種檢測鴨源性成分的rpa引物、試劑盒及檢測方法，能準(zhǔn)確、快速、簡便檢測被檢制品中是否含有鴨源性成分，與現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中常規(guī)pcr和熒光定量pcr方法比較，具有高度專一性，靈敏度高、擴(kuò)增速度快、所需時間短、直觀性強(qiáng)的特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)常溫下對動物源性肉及肉制品進(jìn)行快速簡便檢測，滿足政府對市場監(jiān)管和例行監(jiān)測。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

用于檢測鴨源性成分的rpa引物，包括正向引物rpa-duck-f和反向引物rpa-duck-r，具體序列如下：

rpa-duck-f：5'-tgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatc-3'；

rpa-duck-r：5'-tctatcgcgtattaaatgtataattgcgggac-3'。

一種用于檢測鴨源性成分的rpa檢測試劑盒，其包括所述的rpa引物。

進(jìn)一步，所述rpa檢測試劑盒，其包含rpa反應(yīng)體系，該rpa反應(yīng)體系中各成分的終濃度為：rpa引物的正、反向引物各為0.4-1μmol/l，且，正、反引物的比例為0.5-2：1，dna模板0.4-1.2ng/μl，ph為6.9-7.1的磷酸緩沖液0.10-0.25m，磷酸鎂15-25mmol/l。

一種檢測鴨源性成分的rpa方法，包括：

1)提取待測樣品的dna作為模板；

2)將所述的rpa引物對加入到rpa擴(kuò)增反應(yīng)體系中，進(jìn)行rpa擴(kuò)增反應(yīng)；

3)然后通過瓊脂糖凝膠電泳，若得到片段大小為220bp的條帶，則證明所檢樣品中含有鴨源性成分。

進(jìn)一步，進(jìn)行rpa擴(kuò)增反應(yīng)時，所述rpa反應(yīng)體系中各成分的終濃度為：rpa引物的正、反向引物各為0.4-1μmol/l，且，正、反引物的比例為0.5-2：1，dna模板0.4-1.2ng/μl，ph為7.05的磷酸緩沖液0.12m，磷酸鎂15-25mmol/l。

優(yōu)選地，所述rpa反應(yīng)體系總體積為50μl，其中，濃度為10μmol/l的rpa引物的正、反向引物各加入2-5μl，濃度為20ng/μl的dna模板加入1-3μl，濃度為0.2m、ph7.05的磷酸緩沖液29.5μl，濃度為250mmol/l磷酸鎂溶液3-5μl，ddh2o補(bǔ)足至50μl。

優(yōu)選地，所述rpa反應(yīng)體系中，總體積為50μl，其中，濃度為10μmol/l的rpa引物的正、反向引物各加入2.4μl，濃度為20ng/μl的dna模板加入2μl，濃度為0.2m、ph為7.05的磷酸緩沖液29.5μl，濃度為250mmol/l的磷酸鎂溶液4μl，ddh2o補(bǔ)足至50μl。

進(jìn)一步，所述rpa擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋汉銣?5-40℃，15～25分鐘。

優(yōu)選地，所述步驟2)中，rpa擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?7℃恒溫反應(yīng)18分鐘。

通過查閱文獻(xiàn)和用blast軟件分析，以鴨總dna作為模板進(jìn)行篩選，篩選出鴨線粒體上的基因核酸序列(mtdna)，相比于核dna的線性結(jié)構(gòu)，mtdna的環(huán)形結(jié)構(gòu)具有不隨著時間降解的穩(wěn)定性，這使得線粒體能在極端的食品加工條件中保存下來。此外，每個細(xì)胞的細(xì)胞核中只有一份ndna存在，而某一細(xì)胞線粒體dna存在多個復(fù)制體，這使mtdna試驗(yàn)比ndna檢測更敏感。從另一個角度來看，mtdna長度短，并且不同生物間的mtdna差異很大，高等動物的線粒體dna的典型尺寸約16000個堿基對(bp)。同時，不同于ndna，線粒體dna屬于完全的母系遺傳，沒有組蛋白的結(jié)合保護(hù)，又缺少dna損傷的修復(fù)系統(tǒng)，所以極易發(fā)生突變，且突變結(jié)果容易保存下來，因此，mtdna的突變率為核dna的10倍以上。本發(fā)明利用mtdna良好的特異性，將其作為物種檢測中的目標(biāo)序列來源。

本發(fā)明根據(jù)鴨物種的線粒體特異性序列區(qū)域(accession:kj833587.1，gi:675023238)設(shè)計大量的rpa特異性引物，引物中個別堿基的增減都會對特異性擴(kuò)增的效果產(chǎn)生影響，從中篩選出一套可快速有效地檢測出鴨源性成分的rpa引物，本發(fā)明篩選出的基于鴨線粒體上細(xì)胞色素c氧化酶iii基因片段上的rpa引物，擴(kuò)增時間短，電泳條帶明顯，靈敏度高。

本發(fā)明的rpa引物具有如下特點(diǎn)：(1)rpa引物的長度符合30至35個核苷酸的要求；(2)rpa引物5'端的3-5個核苷酸避免聚鳥嘌呤，gc含量在40％～60％之間，堿基隨機(jī)分布，并避免重復(fù)序列；(3)盡量避免引物內(nèi)部出現(xiàn)引物間互作、二級結(jié)構(gòu)、發(fā)夾結(jié)構(gòu)，減少引物二聚體的形成；(4)鴨源性成分特異性片段為220bp。

基于本發(fā)明的rpa引物建立鴨源性成分物種特應(yīng)性的rpa檢測方法,不需要特殊的儀器，無需像常規(guī)pcr或熒光pcr方法那樣循環(huán)變溫，適適用范圍廣，檢測時間短，約需15～25分鐘，就能快速檢測被檢制品中是否含有鴨源性成分，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，靈敏度高，大大縮短了實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，簡化了實(shí)驗(yàn)步驟，在肉類產(chǎn)品動物源性成分鑒定中的準(zhǔn)確性及快速檢測方面得到了顯著的提高。

與現(xiàn)有技術(shù)對比，本發(fā)明具有如下有益效果：

1)利用本發(fā)明的rpa引物對進(jìn)行快速檢測，以鴨物種基因組dna為模板時，可以得到明顯的特異性片段為220bp的電泳條帶，而其他物種(羊、牛、雞和豬等)的基因組dna為模板沒有得到電泳條帶，證明其具有高度專一性。

2)利用本發(fā)明的rpa引物及檢測方法，將鴨物種基因組dna模板用ddh2o稀釋后，可以檢測到50個拷貝的靶基因，證明該方法具有較高的靈敏度，這是現(xiàn)有技術(shù)不能達(dá)到的靈敏水平。

3)利用本發(fā)明的rpa檢測方法，使被檢制品中鴨源性成分鑒定過程中，提高了準(zhǔn)確性，簡化了檢測步驟，所需檢測時間短，使用更加便捷。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例中鴨動物源性成分特異性檢測電泳圖譜；其中，m：dl2000marker；1-3：ntc；4-6：鴨；7-9：牛；10-12：羊；12-15：雞；16-18：豬。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例中鴨動物源性成分檢測的靈敏度擴(kuò)增電泳圖譜；其中，m：dl2000marker；dna采用鴨基因組dna不同梯度稀釋為：1-3：5000copies；4-6：500copies；7-9：50copies。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1獲得用于檢測鴨源性成分的rpa引物

通過查閱文獻(xiàn)和用blast軟件分析，以50ng/μl的鴨總dna作為模板進(jìn)行優(yōu)化篩選，篩選出鴨線粒體上的基因核酸序列，并進(jìn)行引物的設(shè)計和篩選。

在rpa引物設(shè)計時考慮到以下幾個要點(diǎn)：(1)rpa引物的長度一般為30至35個核苷酸；(2)rpa引物5'端的3-5個核苷酸應(yīng)當(dāng)避免聚鳥嘌呤，gc含量在40％～60％之間，堿基隨機(jī)分布，并避免重復(fù)序列；(3)rpa引物設(shè)計時盡量避免引物內(nèi)部出現(xiàn)引物間互作、二級結(jié)構(gòu)、發(fā)夾結(jié)構(gòu)，減少引物二聚體的形成。

篩選出的rpa引物具體序列如下：

rpa-duck-f：5'-tgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatc-3'；

rpa-duck-r：5'-tctatcgcgtattaaatgtataattgcgggac-3'。

實(shí)施例2一種檢測鴨源性成分的物種特應(yīng)性的rpa檢測方法驗(yàn)證

以常見的豬、牛、羊、雞和鴨等作為對象，進(jìn)行了擴(kuò)增反應(yīng)，并利用試紙條進(jìn)行了檢測，以電泳法為對比進(jìn)行驗(yàn)證。

1)分別提取待測樣品dna(豬、牛、羊、雞和鴨)；

rpa擴(kuò)增

將實(shí)施例1中的rpa引物利用twistdx公司開發(fā)的rpa試劑盒進(jìn)行聚合酶重組酶等溫擴(kuò)增。

擴(kuò)增反應(yīng)體系：總體積為50μl，濃度為10μmol/l的rpa引物的正、反向引物各加入2.4μl，濃度為20ng/μl的dna模板加入2.0μl，煮沸再冷卻的純水配制磷酸緩沖液(0.2m，ph7.05)29.5μl，250mmol/l磷酸鎂溶液4μl，ddh2o補(bǔ)足至50μl。

擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋悍湃雙cr儀器或恒溫擴(kuò)增儀37℃反應(yīng)18分鐘。

3)產(chǎn)物檢測

將步驟2)的等溫擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，利用本發(fā)明rpa引物，對豬、牛、羊、雞和鴨進(jìn)行rpa檢測，通過瓊脂糖凝膠電泳，如果得到明顯的特異性條帶，片段長度為220bp，則證明所檢樣品中含有鴨源性成分。

檢測鴨動物源性成分的特異性擴(kuò)增電泳圖譜如圖1所示，由圖1可以看出，本發(fā)明的rpa引物能夠快速準(zhǔn)確地鑒定出鴨動物源性成分，其中在含有鴨動物源性成分的樣品中有明顯的擴(kuò)增條帶，而牛、羊、雞和豬等其他物種的樣品均沒有擴(kuò)增條帶。

利用本發(fā)明rpa引物進(jìn)行鴨動物源性成分的靈敏度擴(kuò)增驗(yàn)證，將樣品用ddh2o分別稀釋至50、500、5000個拷貝，進(jìn)行靈敏度擴(kuò)增，擴(kuò)增電泳圖譜如圖2所示，由圖2可以看出，利用該方法可以檢測到50個拷貝的鴨動物源性成分特異性分子序列，說明用本發(fā)明設(shè)計的引物鑒定鴨動物源性成分具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性，且操作簡單。