本發(fā)明涉及一種增強果酒芳香的釀造方法，屬于工業(yè)微生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

以新鮮水果和果汁為原料，經(jīng)酵母菌發(fā)酵釀制而成的含酒精飲料稱為果酒。酵母發(fā)酵過程主要產(chǎn)生的物質(zhì)有：乙醇、co2、甘油(g/l)；高級醇、有機酸、短鏈脂肪酸、脂類、醛類、so2(mg/l)；h2s、雙乙酰(μg/l)。各種因素如酵母種類、水果品種、原料成熟度、釀造工藝、陳釀條件等均對果酒最終的風味品質(zhì)產(chǎn)生影響，而釀酒酵母是果酒發(fā)酵產(chǎn)生風味的重要來源，也是影響果酒品質(zhì)的重要因素。

β-苯乙醇是一種具有玫瑰風味的芳香醇，天然存在于茉莉、玫瑰等植物精油中，同時作為一種重要的香精香料成分，在化妝品、煙草及日化用品中也廣泛應用。β-苯乙醇由微生物代謝產(chǎn)生，釀酒酵母在發(fā)酵過程中通過艾利希途徑和其他代謝途徑產(chǎn)生β-苯乙醇，作為發(fā)酵酒產(chǎn)品中特征的風味物質(zhì)，可以提高發(fā)酵產(chǎn)品風味和整體品質(zhì)。雖然在葡萄酒中β-苯乙醇含量可以達到60mg/l左右，但是對于玫瑰芳香性果酒的特征開發(fā)，有待于進一步提高β-苯乙醇含量，所以有必要篩選具有優(yōu)良性能的酵母。

雖然目前已有能夠顯著提高微生物產(chǎn)β-苯乙醇能力的措施，但是絕大多數(shù)都需要外源添加l-苯丙氨酸等前體化合物。目前有多個具有產(chǎn)生一定濃度β-苯乙醇的釀酒酵母應用于釀造食品的報道，但是菌株是否具有較高的酒精生產(chǎn)能力尚不清楚。由于β-苯乙醇對酵母的脅迫能力顯著高于乙醇，高產(chǎn)β-苯乙醇的釀酒酵母產(chǎn)乙醇的能力通常會有降低，所以已有高產(chǎn)β-苯乙醇的釀酒酵母的酒精生產(chǎn)能力較低。因此在不外源添加前體化合物情況下，能夠高產(chǎn)β-苯乙醇和乙醇的釀酒酵母在釀造工業(yè)中具有較高應用價值。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對目前普通釀酒酵母的不足，篩選出的一株高產(chǎn)β-苯乙醇釀酒酵母菌株，于2016年12月16日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為cctccm2016785。該菌株具有高產(chǎn)β-苯乙醇能力和高產(chǎn)風味物質(zhì)乙酸-2-苯乙酯的能力，且發(fā)酵性能良好，能夠明顯提高發(fā)酵產(chǎn)品中β-苯乙醇含量，改善發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)，具有廣泛的應用前景。同時，為了增強果酒中的芳香成分，尤其是玫瑰芳香，本發(fā)明將篩選得到的這株釀酒酵母菌株用于傳統(tǒng)的釀造工藝釀造芳香的果酒。

本發(fā)明的第一個目的是提供一株高產(chǎn)β-苯乙醇的釀酒酵母菌株(saccharomycescerevisiae)，于2016年12月26日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國武漢武漢大學，保藏編號為cctccno:m2016785。

所述釀酒酵母菌株是從黃酒醪液篩選出的釀酒酵母作為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外誘變后進行對氟苯丙氨酸抗性篩選，然后篩選長勢良好的菌株接種在含有10％乙醇的ypd液體培養(yǎng)基中，進行酒精耐受性篩選以及黃酒模擬液發(fā)酵篩選，得到的β-苯乙醇產(chǎn)量相對較高的菌株作為常溫等壓等離子誘變出發(fā)菌株，第二次誘變后菌株進行對氟苯丙氨酸抗性篩選，以及發(fā)酵特性篩選，得到高產(chǎn)β-苯乙醇釀酒酵母。

本發(fā)明的釀酒酵母，具有如下特性：

應用于果酒(葡萄酒、蘋果酒、桑葚酒、山楂酒、楊梅酒、櫻莓酒)發(fā)酵體系，純種發(fā)酵所得果酒中β-苯乙醇含量可達350mg/l，乙酸-2-苯乙酯含量為50μg/l，酒精度12.8度。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種增強果酒芳香的方法，尤其是增強果酒玫瑰芳香的方法，所述方法是利用本發(fā)明的釀酒酵母cctccno:m2016785作為發(fā)酵菌株。

在一種實施方式中，所述釀酒酵母為cctccno:m2016785菌株凍干粉。

在一種實施方式中，所述方法，是將冷凍干燥得到的釀酒酵母cctccno:m2016785干菌體按2‰添加量添加到果汁中。

在一種實施方式中，所述果酒是以葡萄汁、蘋果汁、桑葚汁、山楂酒、楊梅汁、櫻莓汁中的一種或者兩種以上按一定比例混合發(fā)酵得到的。

在一種實施方式中，所述果酒為葡萄酒、蘋果酒、桑葚酒、山楂酒、楊梅酒、櫻莓酒等。

在一種實施方式中，所述方法包括如下步驟：

(1)清洗果實原料，進行破碎與壓榨，分離得到果汁；

(2)補加白砂糖，攪拌均勻；

(3)流加焦亞硫酸鉀160mg/l，果膠酶100mg/l，入罐攪拌均勻；

(4)將釀酒酵母cctccm2016785進行種子液活化，50g/l白砂糖水的作為活化液，在38℃下活化30min-60min；或者取2‰cctccno:m2016785凍干粉，在38℃下攪拌30min-60min讓干菌體充分吸水，得到菌液；

(5)將上一步活化好的種子液或者凍干粉的菌液接種入發(fā)酵罐中，進行前發(fā)酵；接種后，控溫23-25℃，12-24h后啟酵，啟酵后控溫20℃-23℃；

(6)在發(fā)酵過程中，根據(jù)發(fā)酵情況確定是否需要補加白砂糖及補加量；前發(fā)酵時間8-12d；

(7)前發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液中的酵母分離，在發(fā)酵液中添加一定濃度二氧化硫轉(zhuǎn)入后發(fā)酵；

(8)后發(fā)酵溫度控制20℃以下，添加澄清劑，充分混合，發(fā)酵時間為16～24d；

(9)過濾：將發(fā)酵罐底部酒腳放掉，上部液體進行過濾。

本發(fā)明的優(yōu)點和效果：

(1)本發(fā)明的高產(chǎn)β-苯乙醇的釀酒酵母菌株cctccno:m2016785，可以在不添加外源氨基酸的情況下高產(chǎn)β-苯乙醇，并且產(chǎn)酒精特性良好。

(2)利用cctccno:m2016785制備果酒，成品果酒中β-苯乙醇的含量達350mg/l，比普通葡萄酒酵母菌種釀造的果酒提高571％左右，顯著增強果酒芳香，并且產(chǎn)酒精特性良好，酒精度12.8度。

(3)本發(fā)明還提供了所述釀酒酵母cctccno:m2016785菌株凍干粉的應用。

生物材料保藏

一株釀酒酵母菌株，分類學命名為釀酒酵母byc3saccharomycescerevisiaebyc3，于2016年12月26日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國武漢武漢大學，保藏編號為cctccno:m2016785。

附圖說明

圖1是酵母菌株在ypd中β-苯乙醇產(chǎn)量。

具體實施方式

實施例1：一種增強櫻莓酒芳香的釀造方法

(1)清洗野櫻莓果實，進行破碎與壓榨，碟片分離得到櫻莓果汁。

(2)根據(jù)櫻莓果汁含糖量補糖，按按17g/l糖轉(zhuǎn)化為1度酒精的換算關(guān)系，根據(jù)發(fā)酵情況確定補加白砂糖量，攪拌均勻。

(3)流加焦亞硫酸鉀160mg/l，果膠酶100mg/l，入罐攪拌均勻。

(4)種子液活化：50g/l白砂糖水的作為活化液，接種釀酒酵母cctccno:m2016785(對照組為安琪葡萄酒釀酒干酵母)，種子液體積為總發(fā)酵體系的5％，在38℃下活化30min-60min。

(5)將活化好的種子液接種入發(fā)酵罐中，進行前發(fā)酵。接種后，控溫23-25℃，12-24h后啟酵，啟酵后控溫20℃-23℃。每隔24h測定酒精度、殘?zhí)?、酸度、ph。

(6)待殘?zhí)切∮?0g/l時，為使果汁發(fā)酵酒精度達到要求，按17g/l糖轉(zhuǎn)化為1度酒精的換算關(guān)系，根據(jù)發(fā)酵情況確定是否需要補加白砂糖及補加量；待殘?zhí)橇繛?g/l左右，酒體表面平靜，氣泡較少，上層酒液清澈時，前酵結(jié)束，前發(fā)酵時間10d左右。

(7)前發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液硅藻土過濾，在發(fā)酵液中添加0.04g/l的二氧化硫轉(zhuǎn)入后發(fā)酵。

(8)后發(fā)酵溫度控制20℃以下，添加2‰皂土澄清劑，充分混合，20d左右。

(9)過濾：靜置澄清結(jié)束后，將發(fā)酵罐底部酒腳放掉，上部液體進行硅藻土過濾，在硅藻土過濾后用膜過濾器進行微濾。

發(fā)酵完畢后采用液相色譜法測定β-苯乙醇含量，其中安琪釀酒酵母發(fā)酵β-苯乙醇含量為61mg/l，而利用釀酒酵母cctccm2016785發(fā)酵的櫻莓酒β-苯乙醇含量平均在350mg/l左右。

實施例2：一種增強蘋果酒芳香的釀造方法

因蘋果酒加工和貯藏過程中易發(fā)生褐變，導致酒體色澤、酒質(zhì)和風味受到影響，使酒體氧化感增強，感官特性降低，部分營養(yǎng)物質(zhì)的流失，蘋果酒成品易出現(xiàn)渾濁、沉淀、霧濁等問題，因此在生產(chǎn)過程中可以添加40mg/l的還原型谷胱甘肽，對蘋果酒褐變值及風味物質(zhì)含量有積極影響。

與實施例1相比，僅僅是在步驟(1)分離的果汁中額外添加了40mg/l的還原型谷胱甘肽，且原料換成了蘋果，其他步驟同實施例1。所得蘋果酒β-苯乙醇含量為345mg/l。

實施例3：一種增強山楂酒芳香的釀造方法

山楂果實果膠含量高達3％～7％，果實破碎后呈膠著狀態(tài)，因此在實施1中步驟(1)破碎時可加入40～50℃溫水，水量控制在山楂量的1倍以內(nèi)；加熱使品溫達到沸騰，浸提取汁，在煮沸過程中可按照成品酒的酒精度要求調(diào)整果漿糖度、酸度。浸提取汁結(jié)束后使果漿溫度降到40℃左右，加入果膠酶和so2，攪拌均勻裝置。

原料換成了山楂，其他步驟同實施例1。所得山楂酒β-苯乙醇含量為343mg/l。

實施例4：一種增強混合果汁發(fā)酵果酒芳香的釀造方法

方法一：將櫻莓汁與蘋果汁按1:1比例混合可中和純櫻莓酒中的澀味。以混合后的混合果汁代替實施例1中的櫻莓果汁進行發(fā)酵，所用菌株為釀酒酵母cctccno:m2016785，其他步驟與參數(shù)同實施例1。所得混合果酒發(fā)酵體系β-苯乙醇含量為356mg/l。

方法二：將櫻莓汁、蘋果汁、葡萄汁按1:1:1比例混合，以混合后的混合果汁代替實施例1中的櫻莓果汁進行發(fā)酵，所用菌株為釀酒酵母cctccno:m2016785，其他步驟同實施例1。所得混合果酒發(fā)酵體系β-苯乙醇含量為370mg/l。

實施例5：一種使用釀酒酵母cctccno:m2016785凍干粉增強果酒芳香的釀造方法

在實施例1中是采用活化的cctccno:m2016785種子液；本實施例中為添加2‰cctccno:m2016785凍干粉，在38℃下攪拌30min-60min讓干菌體充分吸水，同時達到消泡目的，其他步驟同實施例1。所得果酒β-苯乙醇含量為325mg/l。

其中，實施例1和實施例5采用不同菌株發(fā)酵的櫻莓果酒的結(jié)果，如表1所示。

實施例1至實施例4，以cctccno:m2016785為發(fā)酵菌株，采用不同果汁原料進行發(fā)酵得到的果酒的結(jié)果如表2所示。

表1不同菌株發(fā)酵的櫻莓果酒的結(jié)果對比

表2不同果汁原料的發(fā)酵結(jié)果對比

實施例6：菌株的篩選

一、紫外誘變

(1)從甘油保藏管中取由本實驗室從黃酒醪液篩選的釀酒酵母菌液，活化培養(yǎng)，確定出發(fā)菌株指數(shù)增長中期時間即是紫外誘變開始時間；

(2)紫外誘變時間的確定

取出發(fā)酵母菌株菌液，洗滌多次后得到菌懸液，采用紫外線照射；具體是：先將紫外燈打開預熱20min，以穩(wěn)定光波。用5ml無菌移液管移取上述菌懸液4.5ml于無菌的直徑為9cm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中加入無菌大頭針。將裝有菌懸液的培養(yǎng)皿放置于磁力攪拌器上，垂直放置于紫外燈下，照射20s，黑暗條件下打開皿蓋(確保紫外燈照射均勻)，暴露紫外光下照射(15w紫外燈，距離30cm)，時間為40s、60s、80s、100s、120s。

然后計算致死率，繪制致死率曲線。分別確定紫外致死率為70-80％、80-90％、90-100％時紫外照射時間。致死率＝(對照組菌落數(shù)一誘變組菌落數(shù))/對照組菌落數(shù)。根據(jù)致死率曲線圖，致死率70-80％、80-90％、90-100％時照射時間分別為110s、130s、150s。

二、對氟苯丙氨酸篩選

(1)先確定對氟苯丙氨酸的最低全部致死濃度，結(jié)果顯示對氟苯丙氨酸濃度增加到0.09g/l時酵母全部致死，因此對氟苯丙氨酸最低全部致死濃度確定為0.09g/l。

(2)取紫外誘變得到的菌株進行對氟苯丙氨酸抗性篩選和酒精耐受性篩選，計算od60012h、od60024h以及od60024h-od60012h值，挑選數(shù)值相對較高的誘變酵母菌共計22株。

(3)進行黃酒模擬液發(fā)酵篩選；黃酒模擬液的制備：1kg蒸熟米飯(含水率為70％)中加入水1l、麥曲0.05kg，攪拌均勻，60℃保溫8h，4500r/min離心5min，取上清液115℃滅菌15min。

將22株突變菌株活化培養(yǎng)后移取5％菌液，接種到黃酒模擬液的中，30℃，靜止發(fā)酵7d，采用高效液相色譜法測定黃酒模擬液中β-苯乙醇含量，篩選β-苯乙醇含量相對較高的菌株。

結(jié)果得到1-e4突變菌株的β-苯乙醇平均含量相對較高為185.032mg/l，產(chǎn)酒精能力優(yōu)良，因此將此菌株作為下一輪常溫等壓等離子誘變的出發(fā)菌株。

三、常溫等壓等離子誘變與篩選

(1)將上一步篩選得到的1-e4作為常溫等壓等離子誘變出發(fā)菌株。1-e4菌株ypd搖瓶30℃培養(yǎng)24h，用生理鹽水制成od600為0.6-0.8的菌懸液，進行常溫等壓等離子誘變，誘變時間為60s，功率為100w，將誘變后菌株重懸成菌液，稀釋涂布于ypd平板，30℃培養(yǎng)48h，將單菌落劃線到y(tǒng)nbp平板(對氟苯丙氨酸濃度為0.5g/l)，ynbp平板長勢良好菌株進行黃酒模擬液發(fā)酵篩選。高效液相色譜法測定黃酒模擬液中β-苯乙醇含量，篩選β-苯乙醇含量相對較高的菌株。

高效液相色譜法測定黃酒模擬發(fā)酵液中β-苯乙醇含量。3-c10、4-c7、5-f5突變菌株β-苯乙醇平均含量相對較高，分別為217.192mg/l、257.388mg/l、337.168mg/l，將該三株菌株分別命名為byc1、byc2、byc3。釀酒酵母β-苯乙醇產(chǎn)量增加，且釀酒酵母byc3仍可良好進行酒精發(fā)酵，黃酒模擬發(fā)酵液的酒精含量可達8.3(v/v)。將byc-3菌株于保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為cctccno:m2016785。將cctccno:m2016785菌株接種于黃酒發(fā)酵體系，酒精發(fā)酵性能良好，所得黃酒中β-苯乙醇含量為365.70mg/l。

實施例7：高產(chǎn)β-苯乙醇酵母菌株驗證性實驗

用byc3(即cctccno:m2016785)菌株、商業(yè)酵母菌株、實施例6的野生酵母菌株(誘變出發(fā)菌株)進行對比發(fā)酵實驗。三株菌株用ypd平板活化后接入ypd搖瓶，再分別按5％依次接入ypd搖瓶、ypd搖瓶(加入1g/l苯丙氨酸的)。

實驗結(jié)果如圖1，釀酒酵母菌株byc3的β-苯乙醇產(chǎn)量明顯高于商業(yè)酵母菌株和野生酵母菌株，cctccno:m2016785酵母在ypd培養(yǎng)基中β-苯乙醇產(chǎn)量達31.6mg/l，是添加1g/l苯丙氨酸的ypd培養(yǎng)基的50.9％(而商業(yè)酵母為27％、野生酵母為22％左右)，酵母byc3高產(chǎn)β-苯乙醇性能得到驗證。

雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應該以權(quán)利要求書所界定的為準。