【技術(shù)領(lǐng)域】

本發(fā)明涉及一種微生物及其應(yīng)用，具體涉及一種少動(dòng)鞘氨醇單胞菌菌株及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

多糖是以單糖為基本組成單位，按一定方式重復(fù)排列而成的聚合物。用于食品加工的多糖俗稱為膠質(zhì)，即胞外多糖。胞外多糖可來源于動(dòng)物、植物、微生物，海藻類胞外多糖主要包括瓊脂和卡拉膠以及海藻酸及其衍生物。植物類胞外多糖包括阿拉伯膠、纖維素膠及其衍生物、魔芋粉等。微生物胞外多糖主要包括黃原膠、結(jié)冷膠、卡拉膠等，具有粘著性、穩(wěn)定性、乳化性和凝膠性等特點(diǎn)，在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域等方面都有著廣泛的應(yīng)用，尤其是近些年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的引入，多糖在抗凝血、延緩衰老、抗癌防癌、疾病免疫等方面的功能也逐漸被揭示出來。按其用途，胞外多糖又可被分類為增稠劑和膠凝劑，可作為食品添加劑、凝結(jié)劑、保鮮劑等。已報(bào)道的可產(chǎn)胞外多糖的微生物菌屬有鞘氨醇單胞菌屬(sphingomonas)、農(nóng)桿菌屬(agrobacterium)、黃單胞菌屬(xanthomonas)等。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種少動(dòng)鞘氨醇單胞菌菌株，該菌株為少動(dòng)鞘氨醇單胞菌菌株fjat-10272(sphingomonaspaucimobilis)，于2016年01月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為cgmccno.11997，并揭露了利用該菌株制備胞外多糖。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題的：

本申請(qǐng)人從福建省南平市順昌縣的黃龍蜜桔葉片中分離并篩選得到能夠高產(chǎn)胞外多糖的菌株，通過對(duì)該菌株進(jìn)行生理生化特性測(cè)定和脂肪酸sherlock-midi系統(tǒng)分析，最終鑒定其為少動(dòng)鞘氨醇單胞菌的一個(gè)菌株。

進(jìn)一步地，利用該菌株制備胞外多糖，其制備方法的具體步驟為：

(1)權(quán)利要求1中所述的少動(dòng)鞘氨醇單胞菌菌株fjat-10272的活化：用接種環(huán)將權(quán)利要求1中所述的少動(dòng)鞘氨醇單胞菌菌株fjat-10272劃線于na平板上，并于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，且培養(yǎng)溫度為30℃；

(2)制備種子液：將步驟(1)所獲得的少動(dòng)鞘氨醇單胞菌菌株fjat-10272的單菌落接種于種子培養(yǎng)基中，并將其置于恒溫振蕩搖床中培養(yǎng)16h，溫度30℃，轉(zhuǎn)速170rpm·min^-1；

(3)制備發(fā)酵液：按體積百分比為2％的接種量將步驟(2)所獲得的種子液轉(zhuǎn)入已消毒滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)72h，溫度30℃，轉(zhuǎn)速190rpm·min^-1，即得發(fā)酵液；

(4)胞外多糖的提?。簩⒉襟E(3)所得的發(fā)酵液進(jìn)行離心分離(室溫下，轉(zhuǎn)速6000rpm·min^-1離心10min)，收集上清液，向上清液中加入冰乙醇，且冰乙醇與上清液的體積比為3：1，之后于4℃下靜置過夜沉降胞外多糖；接著將靜置后的溶液進(jìn)行離心分離(室溫下，轉(zhuǎn)速6000rpm·min^-1離心10min)，收集沉淀物；采用無水乙醇洗滌沉淀物3遍，然后氮?dú)獯蹈?，最后粉碎即得所述胞外多糖產(chǎn)品。

進(jìn)一步地，所述na平板的組分為：牛肉膏3g·l^-1、蛋白胨5g·l^-1、葡萄糖10g·l^-1、酵母膏1g·l^-1、瓊脂粉17g·l^-1、ph7.2。

進(jìn)一步地，所述種子培養(yǎng)基的組分為：蔗糖20g·l^-1、蛋白胨5g·l^-1、酵母膏5g·l^-1、ph7.0。

進(jìn)一步地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組分為：葡萄糖30g·l^-1、蛋白胨3g·l^-1、酵母膏2g·l^-1、kh2po41g·l^-1、mgso40.1g·l^-1、微量元素鹽溶液1ml·l^-1、ph7.0；

其中，微量元素鹽溶液的組分為：mncl2·4h2o1.8g·l^-1、feso4·7h2o2.4g·l^-1、h3bo30.283g·l^-1、cucl20.0027g·l^-1、cocl2·6h2o0.0074g·l^-1。

本發(fā)明的有益效果在于：

提供一種新的少動(dòng)鞘氨醇單胞菌菌株fjat-10272(sphingomonaspaucimobilis)，并利用該少動(dòng)鞘氨醇單胞菌菌株fjat-10272制備胞外多糖，且制備獲得胞外多糖的產(chǎn)量較高，即該少動(dòng)鞘氨醇單胞菌菌株fjat-10272能夠高產(chǎn)胞外多糖，從而增加了胞外多糖生產(chǎn)菌株的來源；且采用本發(fā)明少動(dòng)鞘氨醇單胞菌菌株fjat-10272(sphingomonaspaucimobilis)制備胞外多糖的過程簡單、易于操作。

【附圖說明】

下面參照附圖結(jié)合實(shí)施例對(duì)本實(shí)用新型作進(jìn)一步的描述。

圖1是本發(fā)明中菌株fjat-10272的脂肪酸圖譜。

【具體實(shí)施方式】

本發(fā)明一種少動(dòng)鞘氨醇單胞菌菌株即少動(dòng)鞘氨醇單胞菌菌株fjat-10272(sphingomonaspaucimobilis)是從福建省南平市順昌縣的黃龍蜜桔葉片中分離并篩選得到能夠高產(chǎn)胞外多糖的菌株，并揭露了利用該少動(dòng)鞘氨醇單胞菌菌株fjat-10272制備胞外多糖的方法。

為了能夠清楚的闡述本發(fā)明，本申請(qǐng)人給出了如下幾個(gè)具體實(shí)施例。

實(shí)施例1、該菌株fjat-10272的分離：

(1)分別稱取福建省南平市順昌縣的黃龍病蜜桔葉片5g，并將葉片用自來水沖洗干凈，吸干葉片表面的水，之后在75％酒精里浸泡30s，接著用10％次氯酸鈉浸泡5min，再用無菌水漂洗葉片3次；

(2)為了檢驗(yàn)表面滅菌的效果，用滅過菌的鑷子夾著經(jīng)步驟(1)處理后的葉片，并使葉片表面與na平板接觸2min，然后把na平板放在30℃下培養(yǎng)2d，若發(fā)現(xiàn)na平板上沒有菌落出現(xiàn)，證明該葉片表面滅菌徹底，能夠作為后續(xù)操作使用，否則舍棄不能使用。

(3)取經(jīng)步驟(2)檢驗(yàn)后滅菌徹底的葉片，在無菌操作下，將葉片剪碎至研缽里并加入45ml無菌水，充分研磨勻漿制成10^-1樣品原液，靜置30min；之后依次將樣品原液進(jìn)行梯度稀釋，選用稀釋度為10^-2，10^-3的稀釋液；

(4)取200μl步驟(3)選用的稀釋液并分別加到na平板上，涂布至平板干燥，試驗(yàn)重復(fù)3次；將涂布后的na平板置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后觀察na平板上長出的菌落的形態(tài)，挑取表面致密、顏色為金黃色的單菌落，；并將所挑取的單菌落接種于種子液培養(yǎng)基中，30℃下培養(yǎng)16h后得種子液；將所得種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)中，發(fā)酵培養(yǎng)72h，溫度30℃；發(fā)酵所得發(fā)酵液進(jìn)行離心分離(室溫下，轉(zhuǎn)速6000rpm·min^-1離心10min)，收集上清液，向上清液中加入冰乙醇，且冰乙醇與上清液的體積比為3：1，之后于4℃下靜置過夜沉降胞外多糖；接著將靜置后的溶液進(jìn)行離心分離(室溫下，轉(zhuǎn)速6000rpm·min^-1離心10min)，收集沉淀物；采用無水乙醇洗滌沉淀物3遍，然后氮?dú)獯蹈桑詈蠓鬯榧吹冒舛嗵钱a(chǎn)品，稱干重；比較不同菌株的胞外多糖產(chǎn)品產(chǎn)量，篩選出胞外多糖產(chǎn)品產(chǎn)量最高的菌株，并將該菌株命名為菌株fjat-10272。實(shí)施例2、該菌株fjat-10272的鑒定

(1)生理生化特性鑒定：

將篩選獲得的菌株fjat-10272進(jìn)行生理生化特性的測(cè)定，得到該菌株的主要形態(tài)學(xué)特征如下：菌落較小、圓形、黃色、表面光滑且濕潤、微隆、邊緣整齊、不透明、具有遷移性。

(2)sherlock-midi系統(tǒng)鑒定：采用美國midi公司生產(chǎn)的微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)(sherlockmicrobialidentificationsystem)對(duì)菌株fjat-10272的脂肪酸進(jìn)行分析，分析結(jié)果表明，該菌株fjat-10272的脂肪酸與sherlock-midi系統(tǒng)中標(biāo)準(zhǔn)少動(dòng)鞘氨醇單胞菌菌株的脂肪酸的相似系數(shù)達(dá)0.609；該菌株fjat-10272的脂肪酸圖如圖1所示。

綜合上述2種方法的鑒定結(jié)果，則判定菌株fjat-10272為少動(dòng)鞘氨醇單胞菌(sphingomonaspaucimobilis)。

實(shí)施例3、利用該菌株fjat-10272制備胞外多糖

該菌株fjat-10272的活化：用接種環(huán)將權(quán)利要求1中所述的少動(dòng)鞘氨醇單胞菌菌株fjat-10272劃線于na平板上，并于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，且培養(yǎng)溫度為30℃；

制備種子液：將菌株fjat-10272活化所獲得的少動(dòng)鞘氨醇單胞菌菌株fjat-10272的單菌落接種于種子培養(yǎng)基中，并將其置于恒溫振蕩搖床中培養(yǎng)16h，溫度30℃，轉(zhuǎn)速170rpm·min^-1，得種子液；

制備發(fā)酵液：按體積百分比為2％的接種量將所獲得的種子液轉(zhuǎn)入已消毒滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)72h，溫度30℃，轉(zhuǎn)速190rpm·min^-1，即得發(fā)酵液；

胞外多糖的提取：將所得的發(fā)酵液進(jìn)行離心分離(室溫下，轉(zhuǎn)速6000rpm·min^-1離心10min)，收集上清液，向上清液中加入冰乙醇，且冰乙醇與上清液的體積比為3：1，之后于4℃下靜置過夜沉降胞外多糖；接著將靜置后的溶液進(jìn)行離心分離(室溫下，轉(zhuǎn)速6000rpm·min^-1離心10min)，收集沉淀物；采用無水乙醇洗滌沉淀物3遍，然后氮?dú)獯蹈桑詈蠓鬯榧吹盟霭舛嗵钱a(chǎn)品。

實(shí)施例4、本發(fā)明制得的胞外多糖測(cè)定

采用苯酚-硫酸法測(cè)定實(shí)施例3制得的胞外多糖產(chǎn)品中中性多糖的含量：取實(shí)施例3制得的胞外多糖產(chǎn)品精確配置2g·l^-1的胞外多糖溶液，量取0.4ml所配制的胞外多糖溶液，并采用超純水補(bǔ)足至1ml，接著加入0.5ml6％苯酚溶液和3ml濃硫酸，振蕩混勻后沸水浴20min，然后冷卻至室溫，最后于490nm波長處測(cè)定吸光度，以葡萄糖為對(duì)照，測(cè)定的結(jié)果如下表1。

表1胞外多糖產(chǎn)品中中性糖的含量

由表1可知，本發(fā)明制得的胞外多糖產(chǎn)品中中性多糖的含量高達(dá)0.5817g/l，因此，表明了利用本發(fā)明菌株fjat-10272能夠高產(chǎn)胞外多糖。

需要說明的是，在本發(fā)明中，na平板的組分為：牛肉膏3g·l^-1、蛋白胨5g·l^-1、葡萄糖10g·l^-1、酵母膏1g·l^-1、瓊脂粉17g·l^-1、ph7.2；種子培養(yǎng)基的組分為：蔗糖20g·l^-1、蛋白胨5g·l^-1、酵母膏5g·l^-1、ph7.0；發(fā)酵培養(yǎng)基的組分為：葡萄糖30g·l^-1、蛋白胨3g·l^-1、酵母膏2g·l^-1、kh2po41g·l^-1、mgso40.1g·l^-1、微量元素鹽溶液1ml·l^-1、ph7.0；發(fā)酵培養(yǎng)基中微量元素鹽溶液的組分為：mncl2·4h2o1.8g·l^-1、feso4·7h2o2.4g·l^-1、h3bo30.283g·l^-1、cucl20.0027g·l^-1、cocl2·6h2o0.0074g·l^-1。且在無特殊說明的情況下，本發(fā)明中的百分?jǐn)?shù)均為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。

綜上，本發(fā)明提供一種新的少動(dòng)鞘氨醇單胞菌菌株fjat-10272(sphingomonaspaucimobilis)，并利用該少動(dòng)鞘氨醇單胞菌菌株fjat-10272制備胞外多糖，且制備獲得胞外多糖的產(chǎn)量較高，即該少動(dòng)鞘氨醇單胞菌菌株fjat-10272能夠高產(chǎn)胞外多糖，從而增加了胞外多糖生產(chǎn)菌株的來源；且采用本發(fā)明少動(dòng)鞘氨醇單胞菌菌株fjat-10272(sphingomonaspaucimobilis)制備胞外多糖的過程簡單、易于操作。