本發(fā)明涉及細菌鑒定技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種新型的大腸桿菌k99菌毛抗原pcr鑒定試劑盒，以及該試劑盒的鑒定方法。
背景技術(shù)：
腸道產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(etec)是引起犢牛腹瀉病的最主要細菌病原，其毒素能提高宿主腸道上皮細胞內(nèi)環(huán)狀amp或gmp，使電解質(zhì)液分泌增多，從而導(dǎo)致腹瀉發(fā)生。新生犢牛在出生后的最初4d內(nèi)對etec高度敏感，如果感染就會發(fā)展為水樣腹瀉。迄今為止，從犢牛分離到的腸致病性大腸桿菌已發(fā)現(xiàn)的纖毛抗原有k88、k99、987p、f41等，其中以k99和f41最為常見。針對不同菌毛抗原類型的大腸桿菌，需要采用不同的預(yù)防和治療方法。傳統(tǒng)大腸桿菌菌毛類型的鑒定方法主要采用快速凝集方法，需要將菌毛抗原提取，再與特定菌毛抗體凝集，根據(jù)凝集結(jié)果進行判定。該方法操作步驟多，過程繁瑣，且菌毛抗體來源不便。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種新型大腸桿菌k99菌毛抗原pcr鑒定試劑盒，當所鑒定的大腸桿菌樣品的菌毛抗原類型為k99時，通過pcr擴增后，在電泳結(jié)果中可得到特異性陽性條帶；當所鑒定的大腸桿菌樣品的菌毛抗原類型不為k99時，通過pcr擴增后，在電泳結(jié)果中無法得到特異性陽性條帶，從而起到鑒定大腸桿菌k99菌毛抗原的目的。
本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
一種大腸桿菌k99菌毛抗原pcr鑒定試劑盒，所述試劑盒包括特異性擴增大腸桿菌k99菌毛抗原的引物對，所述引物對包括上游引物5’-ccaatgcttctgcgaatacagg(seqidno.1)-3’，以及下游引物5’-ccgggcgctggttttagttt(seqidno.2)-3’。所述試劑盒還包括pcr預(yù)混液、雙蒸水、陽性對照模板和陰性對照模板。所述的pcr預(yù)混液(premix)為商售的試劑產(chǎn)品，內(nèi)含dnapolymerase、buffer、dntpmixture等，使用時參照使用說明書進行；所述陽性對照模板為大腸桿菌k99標準菌株的dna模板；所述陰性對照模板僅含有雙蒸水；所述的使用說明書為指導(dǎo)實驗者用所述試劑盒進行大腸桿菌k99菌毛抗原pcr鑒定的操作指南。
一種大腸桿菌k99菌毛抗原pcr鑒定方法，包括以下步驟：
a)挑取大腸桿菌樣品的單菌落，置入裝有雙蒸水的離心管中，在95～100℃水中熱變性10min，然后在8000rpm條件下離心5min，取上清液作為dna模板；
b)分別往樣品反應(yīng)管中加入dna模板、上游引物、下游引物、pcr預(yù)混液、雙蒸水；
c)將反應(yīng)管置于pcr儀器進行擴增反應(yīng)，反應(yīng)條件設(shè)置為：95℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共34個循環(huán)，最后72℃延伸10min，在12～25℃時終止反應(yīng)；
d)將上述反應(yīng)后pcr產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳條件為130v，18min，根據(jù)凝膠上的條帶進行結(jié)果判定。
其中，步驟c前還包括步驟：b’)向陽性對照反應(yīng)管中加入陽性對照模板、上游引物、下游引物、pcr預(yù)混液、雙蒸水；向陰性對照反應(yīng)管中加入陰性對照模板、上游引物、下游引物、pcr預(yù)混液、雙蒸水。
本發(fā)明的有益效果是：提供一種新的大腸桿菌k99菌毛抗原pcr鑒定試劑盒，用于大腸桿菌k99菌毛抗原的鑒定，操作簡單，鑒定時間快，試驗材料易于獲取。
具體實施方式
實施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻所描述的技術(shù)或條件(例如參考j.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
一種大腸桿菌k99菌毛抗原pcr鑒定試劑盒，所述試劑盒包括特異性擴增大腸桿菌k99菌毛抗原的引物對，所述引物對包括上游引物5’-ccaatgcttctgcgaatacagg(seqidno.1)-3’，以及下游引物5’-ccgggcgctggttttagttt(seqidno.2)-3’。所述試劑盒還包括pcr預(yù)混液、雙蒸水、陽性對照模板和陰性對照模板。所述的pcr預(yù)混液(premix)為商售的試劑產(chǎn)品，內(nèi)含dnapolymerase、buffer、dntpmixture等，使用時參照使用說明書進行；所述陽性對照模板為大腸桿菌k99標準菌株的dna模板；所述陰性對照模板僅含有雙蒸水
本發(fā)明試劑盒的具體使用方法：
a)用滅菌器具挑取大腸桿菌單菌落，置裝有20μlddh2o的離心管中，在95～100℃水中熱變性10min，然后在8000rpm條件下離心5min，取1～2μl上清液作為dna模板進行pcr反應(yīng)；
b)以20μl的pcr反應(yīng)體系為例，分別往pcr反應(yīng)管中加入上述dna模板1μl，上下游引物各1μl，pcr預(yù)混液(premix)10μl，ddh2o7μl；
b’)pcr反應(yīng)體系須同時設(shè)陽性對照管和陰性對照管，陽性對照管為陽性對照1μl，上下游引物各1μl，pcr預(yù)混液(premix)10μl，ddh2o7μl；陰性對照管為陰性對照1μl，上下游引物各1μl，pcr預(yù)混液(premix)10μl，ddh2o7μl；
c)將上述pcr反應(yīng)混合液置pcr儀器進行擴增反應(yīng)，反應(yīng)條件設(shè)置為：95℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共34個循環(huán)，最后72℃延伸10min，在12～25℃時終止反應(yīng)；
d)將上述反應(yīng)后pcr產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖凝膠進行電泳，加樣量為5μl，電泳條件為130v，18min，根據(jù)凝膠上的條帶進行結(jié)果判定。
結(jié)果判定：當陽性對照模板的凝膠在172bp處出現(xiàn)特異性條帶，陰性對照模板沒有出現(xiàn)特異性條帶時，試驗成立。如樣品在172bp處出現(xiàn)特異性條帶則為k99陽性，判為該大腸桿菌菌毛類型為k99，否則判為陰性，判該大腸桿菌菌毛類型不是k99。
sequencelisting
<110>佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院
<120>一種大腸桿菌k99菌毛抗原pcr鑒定試劑盒及鑒定方法
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