本發(fā)明涉及核酸檢測及表面等離子共振傳感領(lǐng)域，特別是涉及一種檢測hiv(人類免疫缺陷病毒)相關(guān)基因的spr(表面等離子共振)傳感器及其制備與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

自1985年中國大陸發(fā)現(xiàn)第1例hiv感染者至今，艾滋病(aids)在全球的流行日益嚴重，形勢嚴峻。據(jù)聯(lián)合國艾滋病規(guī)劃署數(shù)據(jù)，2015年全球共110萬人死于aids，該年新增艾滋病毒感染病例210萬。aids的流行給人類健康和社會經(jīng)濟帶來了極大的損害。人類免疫缺陷病毒(hiv)檢測的主要目的是診斷hiv病原體、指導臨床用藥以及檢出hiv攜帶者，早期的發(fā)現(xiàn)及干預有助于控制病情并及時阻斷傳播途徑。目前我國hiv感染的診斷大多是依賴血清學檢測，多采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(elisa)聯(lián)合免疫印跡法(wb)檢測hiv抗體。雖然血清學檢測特異性好，適合于臨床及血液篩查等大樣本量的檢測，但其需要相應(yīng)的儀器設(shè)備及接受過特殊培訓的技術(shù)人員。且由于技術(shù)原因，不能完全排除相互干擾的可能性，其靈敏度較差。另外，血清學檢測本身存在弊端：在“窗口期”病毒侵入但抗體還沒有產(chǎn)生，免疫學方法不能檢出，即使第四代elisa檢測，仍有2-3周的窗口期，不能滿足早期診斷的需求。

因而，需要更早期的標志物用于hiv感染的診斷。在抗體產(chǎn)生之前，感染者體內(nèi)最早可被檢測到的是病毒核酸，且呈一過性高水平，此后有所下降。核酸檢測不依賴抗體的產(chǎn)生，可明顯縮短窗口期。核酸檢測具有以下特點：①能夠用于常規(guī)不能培養(yǎng)和分離的病毒的檢測(如hbv、hcv、hiv等)；②樣品用量少，并可檢測低豐度含量樣品；③不依賴抗體的產(chǎn)生，在病毒感染的急性期抗體尚未出現(xiàn)之前即可檢測，適用于早期診斷；④可對病毒基因進行基因分型，比血清分型更有價值；⑤通過對病毒耐藥基因的檢測，可預測或發(fā)現(xiàn)病毒的耐藥性；⑥可用于先天性或圍產(chǎn)期獲得性病毒感染的診斷；⑦靈敏度高(可達ng甚至fg水平，理論上能檢出單個病毒基因)，特異性好，快速、簡捷。

目前，核酸檢測主要是通過熒光定量pcr法，它是通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對pcr產(chǎn)物進行標記跟蹤，在線監(jiān)控反應(yīng)過程，從而實現(xiàn)待檢核酸的實時定量檢測。將其運用于hiv病毒核酸檢測可以很好地解決“窗口期”漏診問題，只要病毒侵入就可以檢出，且特異性強、自動化程度高。但是該方法仍存在過程繁瑣，檢測時間長等不足之處。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測hiv相關(guān)基因的spr傳感器及其制備與應(yīng)用，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中對hiv的檢測特異性差、過程繁瑣、檢測時間長等問題。

為實現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明本發(fā)明第一方面提供一種檢測hiv相關(guān)基因的spr傳感器的制備方法，包括制備熵驅(qū)動的鏈置換循環(huán)放大體系，具體包括如下步驟：

(a)探針準備：將dna單鏈p、r、q溶解，混合，變性，制得三鏈復合產(chǎn)物prq，備用；

(b)取步驟(a)所得三鏈復合產(chǎn)物prq，將雜交液、三鏈復合產(chǎn)物prq與單鏈f、靶序列t混合，得混合液，孵育，反應(yīng)，得反應(yīng)產(chǎn)物；

(c)將步驟(b)所得的反應(yīng)產(chǎn)物進樣至固定有捕獲探針的工作芯片表面，制得所述熵驅(qū)動的鏈置換循環(huán)放大體系。

進一步地，步驟(a)中，所述單鏈p含有的核苷酸序列為：

5'-ttttttttttttttttccctactgctagagatttt-3'(seqidno.2)。

進一步地，步驟(a)中，所述單鏈r的核苷酸序列為：

5'-cctacgtctccaactaacttacgg-3'(seqidno.3)。

進一步地，步驟(a)中，所述單鏈q上至少有3個堿基與捕獲探針互補配對。

進一步地，步驟(a)中，所述單鏈q上至少有4個堿基與捕獲探針互補配對。

進一步地，步驟(a)中，所述單鏈q上有4-8個堿基與捕獲探針互補配對。

進一步地，步驟(a)中，所述單鏈q上有6個堿基與捕獲探針互補配對。

進一步地，步驟(a)中，所述單鏈q上有6個堿基與捕獲探針互補配對時，所述單鏈q的核苷酸序列為q6：

5'-atgtggaaaatctctagcagtagggccgtaagttagttggagacgtaggcggatcc-3'(seqidno.4)。

進一步地，步驟(a)中，所述單鏈q上有4個堿基與捕獲探針互補配對時，所述單鏈q的核苷酸序列為q4：

5'-atgtggaaaatctctagcagtagggccgtaagttagttggagacgtaggcggat-3'(seqidno.5)。

進一步地，步驟(a)中，所述單鏈q上有5個堿基與捕獲探針互補配對時，所述單鏈q的核苷酸序列為q5：

5'-atgtggaaaatctctagcagtagggccgtaagttagttggagacgtaggcggatc-3'(seqidno.6)。

進一步地，步驟(a)中，所述單鏈q上有7個堿基與捕獲探針互補配對時，所述單鏈q的核苷酸序列為q7：

5'-atgtggaaaatctctagcagtagggccgtaagttagttggagacgtaggcggatcct-3'(seqidno.7)。

進一步地，步驟(a)中，所述單鏈q上有8個堿基與捕獲探針互補配對時，所述單鏈q的核苷酸序列為q8：

5'-atgtggaaaatctctagcagtagggccgtaagttagttggagacgtaggcggatccta-3'(seqidno.8)。

進一步地，步驟(a)中，混合液中單鏈p、r、q的摩爾比為1.2:1.2:1。

進一步地，步驟(a)中，先將dna單鏈p、r、q分別溶解于tebuffer中，再進行混合。

進一步地，步驟(a)中，tebuffer包含10mmtrishcl、1mmedta，ph8.0。

進一步地，步驟(b)中，所述單鏈f的核苷酸序列為：

5'-aactgactcctacgtctccaactaacttacggccctactgctagagattttatcagagtggcttc-3'(seqidno.9)。

進一步地，步驟(b)中，所述靶序列t含有如下核苷酸序列：

5'-actgctagagattttccacat-3'(seqidno.10)。

進一步地，步驟(b)中，混合液中靶序列t的濃度≥50fm。

進一步地，步驟(b)中，混合液中靶序列t的濃度≥1.5pm。

進一步地，步驟(b)中，孵育時間≥15min；

進一步地，步驟(b)中，孵育時間為15-75min；

進一步地，步驟(b)中，孵育溫度≥4℃；

進一步地，步驟(b)中，孵育溫度為4-48℃；

進一步地，步驟(b)中，先將dna單鏈f、靶序列t分別溶解于tebuffer，再將雜交液與分別含有三鏈復合產(chǎn)物prq、單鏈f、靶序列t的tebuffer混合，得到熵驅(qū)動的鏈置換循環(huán)放大體系。

進一步地，步驟(b)中，tebuffer包含10mmtrishcl、1mmedta，ph8.0。

進一步地，步驟(b)中，所述雜交液包括10mmtris、480mmnacl、5mmmgcl2，ph為7.0。

進一步地，步驟(b)中，混合液中三鏈復合物prq的終濃度為10nm。

進一步地，步驟(b)中，混合液中單鏈f的終濃度為10nm。

進一步地，步驟(b)中，靶序列t的加入體積為混合液總體積的2.5％。

進一步地，步驟(c)中，所述工作芯片上固定的捕獲探針序列如seqidno.1所示。

需要說明的是，捕獲探針的序列并不限于seqidno.1所示的序列，可以根據(jù)不同的靶序列t而進行適應(yīng)性設(shè)計。

進一步地，步驟(c)中，所述捕獲探針為雙巰基修飾的捕獲探針，其序列如下：

5'-hs-(ch2)6-ggctgttttttaggatccgagtcagttttttttcagcc-(ch2)6-sh-3'。

雙巰基修飾可使芯片具有更好的抗干擾性，與傳統(tǒng)探針制備方法相比，不需要后續(xù)mch封閉過程。

進一步地，步驟(c)中，將捕獲探針與固定液混合，將混合液進樣至工作芯片表面，制得固定有捕獲探針的工作芯片，捕獲探針在混合液中的摩爾濃度為500nm～2000nm。

進一步地，步驟(c)中，固定捕獲探針時，固定液選自kh2po4水溶液。

進一步地，步驟(c)中，進樣體積≥10μl。

進一步地，步驟(c)中，進樣體積為10-50μl，包括邊界值。

進一步地，步驟(c)中，將工作芯片置入表面等離子共振儀中，以含450mmnacl、30mmna3po4·12h2o、3mmedta-2na、0.25％tritonx-100的緩沖液為運行液。

進一步地，步驟(c)中，在工作芯片上固定捕獲探針的方法包括：

(1)表面處理：對工作芯片進行表面處理，使其表面光潔；

(2)固定捕獲探針：將工作芯片置于表面等離子共振儀內(nèi)，將捕獲探針溶解于固定液之后，進樣捕獲探針，使得捕獲探針固定在工作芯片的表面，得到固定有捕獲探針的工作芯片。

進一步地，步驟(2)中，捕獲探針的摩爾濃度為500nm～2000nm。

進一步地，步驟(2)中，捕獲探針的摩爾濃度為1000nm。

上述捕獲探針的摩爾濃度是指捕獲探針溶解于固定液之后，捕獲探針在混合液中的終濃度。

進一步地，步驟(2)中，固定液選自kh2po4水溶液。

進一步地，步驟(2)中，固定液為ph＝3.8、摩爾濃度為1m的kh2po4水溶液。

進一步地，還包括制備dna四面體納米分子的方法，包括至少制備一層dna四面體，并將雜交液、dna四面體混合反應(yīng)，將得到的反應(yīng)液進樣至固定有捕獲探針的工作芯片表面，得到dna四面體納米分子放大檢測體系。

進一步地，所述雜交液包括20mmtris、50mmmgcl2。

進一步地，第一層dna四面體納米分子(t0)的制備方法具體包括：將dna單鏈a0、b0、c0、d0混合，變性，得到第一層dna四面體納米分子(t0)。

優(yōu)選地，所述單鏈a0的核苷酸序列為：

5'-gaagccactctgatacattcctaagtctgaaacattacagcttgctacacgagaagagccgccatagta-3'(seqidno.11)。

優(yōu)選地，所述單鏈b0的核苷酸序列為：

5'-ctgtcatcggtcactatcaccaggcagttgacagtgtagcaagctgtaatagatgcgagggtccaatac-3'(seqidno.12)。

優(yōu)選地，所述單鏈c0的核苷酸序列為：

5'-ctgtcatcggtcactcaactgcctggtgataaaacgacactacgtgggaatctactatggcggctcttc-3'(seqidno.13)。

優(yōu)選地，所述單鏈d0的核苷酸序列為：

5'-ctgtcatcggtcacttcagacttaggaatgtgcttcccacgtagtgtcgtttgtattggaccctcgcat-3'(seqidno.14)。

進一步地，所述單鏈dnaa0、b0、c0、d0等摩爾混合。

進一步地，先將dna單鏈a0、b0、c0、d0分別溶解于tebuffer，再將四種單鏈的tebuffer溶液混合，進行后續(xù)的變性處理。

進一步地，還包括第二層dna四面體納米分子(t1)的制備，具體包括：將單鏈dnaa1、b1、c1、d1等摩爾濃度混合，變性，快速降溫；再將第一層dna四面體納米分子(t0)與第二層dna四面體納米分子(t1)混合，孵育得到含有雙層dna四面體納米分子的混合液，將該混合液加到工作芯片表面，得到雙層dna四面體納米分子放大檢測體系。

進一步地，所述單鏈a1的核苷酸序列為：

5'-gtgaccgatgacagacattcctaagtctgaaacattacagcttgctacacgagaagagccgccatagta-3'(seqidno.15)。

進一步地，四個單鏈包括單鏈b1，所述單鏈b1的核苷酸序列為：

5'-tatcaccaggcagttgacagtgtagcaagctgtaatagatgcgagggtccaatac-3'(seqidno.16)。

進一步地，四個單鏈包括單鏈c1，所述單鏈c1的核苷酸序列為：

5'-tcaactgcctggtgataaaacgacactacgtgggaatctactatggcggctcttc-3'(seqidno.17)。

進一步地，四個單鏈包括單鏈d1，所述單鏈d1的核苷酸序列為：

5'-ttcagacttaggaatgtgcttcccacgtagtgtcgtttgtattggaccctcgcat-3'(seqidno.18)。

進一步地，所述單鏈dnaa1、b1、c1、d1等摩爾混合。

進一步地，先將單鏈dnaa1、b1、c1、d1分別溶解于tebuffer，再將四種單鏈的tebuffer溶液混合，進行后續(xù)的變性處理。

進一步地，第一層dna四面體納米分子(t0)與第二層dna四面體納米分子(t1)以1:3的摩爾比混合。

進一步地，所述混合液中雙層dna四面體納米分子的濃度為1μm；

進一步地，所述混合液的進樣體積≥10μl；

進一步地，所述混合液的進樣體積為10-50μl，包括邊界值。

進一步地，進樣流速為2μl·min^-1。

本發(fā)明第二方面提供上述方法制得的spr傳感器。

本發(fā)明第三方面提供上述spr傳感器在檢測hiv相關(guān)基因中的用途。

如上所述，本發(fā)明的一種檢測hiv相關(guān)基因的spr傳感器及其制備與應(yīng)用，具有以下有益效果：本發(fā)明成功構(gòu)建了可用于hiv相關(guān)基因的表面等離子共振傳感器及檢測體系，應(yīng)用本發(fā)明的傳感器，對hiv相關(guān)基因的測定顯示了靈敏度高、穩(wěn)定、重現(xiàn)性好的能力。與現(xiàn)有技術(shù)比較，本發(fā)明的傳感器無酶、可實時監(jiān)測，并且成本低，操作簡單方便，檢測周期短，靈敏度高，特異性好，有望成為具有實際應(yīng)用價值的傳感器。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的典型spr流程傳感圖，分別為進樣熵驅(qū)動的鏈置換循環(huán)放大體系、進樣雙層dna四面體納米分子和再生液(naoh)。

圖2為空白、不加prq復合物、不加f鏈、不加dna四面體納米分子、僅加單層dna四面體納米分子和加雙層dna四面體納米分子的spr傳感信號對比圖。

圖3為單層dna四面體t0，t1能夠形成雙層dna四面體納米分子的電泳驗證圖。

圖4為不同堿基數(shù)目結(jié)合位點的q鏈所構(gòu)建的表面等離子共振hiv相關(guān)基因傳感器響應(yīng)信號結(jié)果圖。

圖5為不同反應(yīng)時間下熵驅(qū)動的鏈置換循環(huán)放大體系所構(gòu)建的表面等離子共振hiv相關(guān)基因傳感器響應(yīng)信號結(jié)果圖。

圖6為不同反應(yīng)溫度下熵驅(qū)動的鏈置換循環(huán)放大體系所構(gòu)建的表面等離子共振hiv相關(guān)基因傳感器響應(yīng)信號結(jié)果圖。

圖7為不同進樣量的雙層dna四面體納米分子所構(gòu)建的表面等離子共振hiv相關(guān)基因傳感器響應(yīng)信號結(jié)果圖。

圖8-a為本發(fā)明實施例的檢測6個不同濃度(150nm，15nm，1.5nm，150pm，15pm，1.5pm)hiv相關(guān)基因標準品溶液所得spr響應(yīng)信號圖。

圖8-b為本發(fā)明實施例的四參數(shù)擬合校準s曲線圖。

圖9為本發(fā)明實施例制備的表面等離子共振hiv相關(guān)基因檢測傳感器的特異性分析結(jié)果圖。

圖10為本發(fā)明的原理圖。

具體實施方式

以下通過特定的具體實例說明本發(fā)明的實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實施方式加以實施或應(yīng)用，本說明書中的各項細節(jié)也可以基于不同觀點與應(yīng)用，在沒有背離本發(fā)明的精神下進行各種修飾或改變。

須知，下列實施例中未具體注明的工藝設(shè)備或裝置均采用本領(lǐng)域內(nèi)的常規(guī)設(shè)備或裝置；所有壓力值和范圍都是指絕對壓力。

此外應(yīng)理解，本發(fā)明中提到的一個或多個方法步驟并不排斥在所述組合步驟前后還可以存在其他方法步驟或在這些明確提到的步驟之間還可以插入其他方法步驟，除非另有說明；還應(yīng)理解，本發(fā)明中提到的一個或多個設(shè)備/裝置之間的組合連接關(guān)系并不排斥在所述組合設(shè)備/裝置前后還可以存在其他設(shè)備/裝置或在這些明確提到的兩個設(shè)備/裝置之間還可以插入其他設(shè)備/裝置，除非另有說明。而且，除非另有說明，各方法步驟的編號僅為鑒別各方法步驟的便利工具，而非為限制各方法步驟的排列次序或限定本發(fā)明可實施的范圍，其相對關(guān)系的改變或調(diào)整，在無實質(zhì)變更技術(shù)內(nèi)容的情況下，當亦視為本發(fā)明可實施的范疇。

實施例1制備表面等離子共振hiv相關(guān)基因檢測傳感器

1.材料與方法

1.1材料

hplc純化的dna序列由上海生工生物工程有限公司合成。tebuffer(10mmtrishcl，1mmedta，ph8.0)購自上海生工生物工程有限公司，dnamarker購自大連takara公司，kh2po4、nacl、mgcl2、na3po4·12h2o、edta-2na等其他試劑均購自重慶茂業(yè)化學試劑有限公司。

1.2檢測儀器

biocorex型表面等離子共振儀為瑞典biocoreab公司產(chǎn)品。

1.3檢測原理

如圖10所示，在均相反應(yīng)體系中，靶序列t通過位于q鏈的立足點觸發(fā)熵驅(qū)動的鏈置換循環(huán)放大反應(yīng)，游離出三鏈復合物prq中的p單鏈，形成trq三鏈復合物，同時暴露出位于q鏈中間的新的立足點。當f鏈存在時，與新的立足點結(jié)合，生成雙鏈產(chǎn)物f-q，同時釋放出r單鏈及靶序列t，靶序列t可進入下一輪循環(huán)反應(yīng)，進行信號放大。所述雙鏈產(chǎn)物f-q中，f鏈和q鏈上分別存在一段單鏈dna片段，可與芯片表面固定的莖環(huán)型捕獲探針(captureprobe)通過堿基互補配對結(jié)合。將上述均相反應(yīng)體系進樣至表面等離子共振儀中后，f-q與捕獲探針(captureprobe)特異性結(jié)合，同時暴露出位于f鏈上的雙層dna四面體納米分子的結(jié)合位點。將預先制備好的雙層dna四面體納米分子進樣至表面等離子共振儀中后，其可與f鏈特異性結(jié)合，從而產(chǎn)生明顯放大的spr信號響應(yīng)。根據(jù)標準hiv相關(guān)基因反應(yīng)產(chǎn)生的spr響應(yīng)信號繪制校準曲線并得到實測樣品中hiv相關(guān)基因的水平。

2.工作芯片的制備

(1)裸金芯片表面處理：以金膜厚度為50nm的裸金芯片作為工作芯片，將裸金芯片表面用食人魚溶液(95％～98％濃硫酸與30％h2o2水溶液的體積比為3:1)處理3次，每次3min，去離子水沖洗干凈后室溫晾干。

(2)固定捕獲探針：將工作芯片置于表面等離子共振儀內(nèi)，進樣捕獲探針，捕獲探針通過通道流過工作芯片表面，通過金-硫鍵固定于芯片表面，即得含有捕獲探針的工作芯片。在使用之前，于4℃低溫保存，該工作芯片可重復多次使用。

工作芯片上捕獲探針的摩爾濃度可以為500nm～2000nm，本實施例為1000nm。將捕獲探針與固定液混合后，再進樣，固定液為ph3.8、摩爾濃度為1m的kh2po4水溶液。

捕獲探針的摩爾濃度是指：捕獲探針與固定液混合后，捕獲探針在混合液中的終濃度。

3.表面等離子共振hiv相關(guān)基因檢測傳感器的使用

(1)將工作芯片置入表面等離子共振儀中，以含450mmnacl、30mmna3po4·12h2o、3mmedta-2na、0.25％tritonx-100，ph＝7.4的緩沖液為運行液，設(shè)置流速為5μl/min，待基線穩(wěn)定。

(2)將dna單鏈p、r、q分別溶解于tebuffer，以單鏈p、r、q的摩爾比為1.2:1.2:1進行混合，變性，恢復至室溫待用；將dna單鏈f、t分別溶解于tebuffer待用。本步驟的tebuffer包含10mmtris-hcl、1mmedta，ph8.0。

以含10mmtris、480mmnacl、5mmmgcl2，ph＝7.0的緩沖液為雜交液，構(gòu)建熵驅(qū)動的鏈置換循環(huán)放大體系，混合液的組成如下：

將所述熵驅(qū)動的鏈置換循環(huán)放大體系在37℃下反應(yīng)30min后，進樣至表面等離子共振儀內(nèi)(通過進樣通道進樣至工作芯片表面)，進樣量為30μl，流速為2μl/min。

本實驗采用的靶序列t為人工合成，具體序列為5'-actgctagagattttccacat-3'(seqidno.10)。

(3)將dna單鏈a0、b0、c0、d0分別溶解于tebuffer，得到四份溶液，各溶液中單鏈的摩爾濃度相等，將前述四份單鏈溶液等體積混合，使得四種單鏈等摩爾混合，混合后，變性，快速降溫(在1min內(nèi)使溶液從95℃降溫至4℃)，制得第一層dna四面體納米分子(t0)；將dna單鏈a1、b1、c1、d1分別溶解于tebuffer，以同樣的方式使四種單鏈等摩爾混合，變性，快速降溫(在1min內(nèi)使溶液從95℃降溫至4℃)，制得第二層dna四面體納米分子(t1)；將制備好的第一層dna四面體納米分子(t0)、第二層dna四面體納米分子(t1)以1:3的摩爾比混合，加入雜交液，37℃下反應(yīng)60min，制得雙層dna四面體納米分子，備用。本步驟的雜交液包含20mmtris、50mmmgcl2，ph8.0。單鏈a0的序列如seqidno.11所示，單鏈b0的序列如seqidno.12所示，單鏈c0的序列如seqidno.13所示，單鏈d0的序列如seqidno.14所示，單鏈a1的序列如seqidno.15所示，單鏈b1的序列如seqidno.16所示，單鏈c1的序列如seqidno.17所示，單鏈d1的序列如seqidno.18所示。

(4)將制備好的雙層dna四面體納米分子進樣至表面等離子共振儀內(nèi)(通過進樣通道進樣至工作芯片表面)，進樣量為30μl，流速為2μl/min。

(5)用50mm的naoh水溶液作為再生液，進樣5μl，流速為2μl/min。

(6)以兩次進樣的spr響應(yīng)信號總和作為對應(yīng)樣品的響應(yīng)信號。

(7)工作芯片可重復多次使用，因而可重復操作(1)～(5)進行多個樣品檢測。

實施例2驗證表面等離子共振hiv相關(guān)基因檢測傳感器的可行性

1.先后加入熵驅(qū)動的鏈置換循環(huán)放大體系、雙層dna四面體納米分子和再生液naoh的表征。

捕獲探針的進樣量為100μl，摩爾濃度為1μm。

q/c堿基互補配對個數(shù)為6，q鏈序列為q6：

5'-atgtggaaaatctctagcagtagggccgtaagttagttggagacgtaggcggatcc-3'(seqidno.4)。雜交液、三鏈復合物prq、單鏈f、靶序列t混合得到混合液后，混合液中三鏈復合物prq、單鏈f的濃度均為250nm，靶序列t的濃度為100nm，熵驅(qū)動的鏈置換循環(huán)放大反應(yīng)溫度為37℃，反應(yīng)時間為30min，進樣量為30μl。雙層dna四面體納米分子的濃度為1μm，進樣量為30μl。再生液naoh水溶液的濃度為50mm，進樣量為5μl。流速均為2μl·min^-1。其他操作與實施例1相同。

如圖1所示為每一步(包括加入熵驅(qū)動的鏈置換循環(huán)放大體系、加入雙層dna四面體納米分子、加入再生液naoh)的spr響應(yīng)信號：

△ru1為熵驅(qū)動的鏈置換循環(huán)放大體系的spr響應(yīng)信號水平。

△ru2為雙層dna四面體納米分子的spr響應(yīng)信號水平。

并可見再生液naoh能夠把結(jié)合上的物質(zhì)完全再生下來。

2.兩步放大檢測體系可行性分析。

捕獲探針的進樣量為100μl，濃度為1μm。

q/c堿基互補配對個數(shù)為6，q鏈序列為q6：

5'-atgtggaaaatctctagcagtagggccgtaagttagttggagacgtaggcggatcc-3'(seqidno.4)?；旌弦褐袕秃衔飌rq、單鏈f的濃度為250nm，靶序列t的濃度為100nm。熵驅(qū)動的鏈置換循環(huán)放大反應(yīng)溫度為37℃，反應(yīng)時間為30min，進樣量為30μl。單層dna四面體納米分子的濃度為1μm，進樣量為30μl。雙層dna四面體納米分子的濃度為1μm，進樣量為30μl。再生液naoh水溶液的濃度為50mm，進樣量為5μl。流速均為2μl·min^-1。其他操作與實施例1相同。

如圖2所示，從上向下依次為a-f曲線：

a為加雙層dna四面體納米分子時獲得的spr響應(yīng)信號；

b為僅加單層dna四面體納米分子t0時獲得的spr響應(yīng)信號；

c為不加dna四面體納米分子時獲得的spr響應(yīng)信號；

d為不加f鏈時獲得的spr響應(yīng)信號；

e為不加prq復合物時獲得的spr響應(yīng)信號；

f為空白組(加有除靶序列t以外的兩步放大體系)的spr響應(yīng)信號；

實驗結(jié)果表明兩步放大檢測體系是可行的。

3.對雙層dna四面體納米分子的驗證

對實施例1中所得的dna四面體納米分子用page電泳進行驗證。

如圖3：

條帶1為500bp的marker；

條帶2為1μm單鏈a0；

條帶3為1μm單鏈a0+b0；

條帶4為1μm單鏈c0+d0；

條帶5為1μm單鏈a0+b0+c0；

條帶6為1μm單鏈b0+c0+d0；

條帶7為1μmt0；

條帶8為1μmt0+t1；

條帶9為1000bp的marker。

電泳結(jié)果說明雙層dna四面體納米分子組裝成功。

圖3中，條帶2-7中樣品為相應(yīng)濃度的各個序列，混合，變性，快速降溫(從95℃于1min內(nèi)降溫至4℃)制得，條帶8中樣品為t0與t1以1:3的摩爾比混合，37℃下孵育1h制得。

實施例3表面等離子共振hiv相關(guān)基因檢測傳感器及其使用條件影響實驗

我們還對本發(fā)明中幾個重要的條件(即q/c堿基互補配對個數(shù)、熵驅(qū)動的鏈置換循環(huán)放大反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、雙層dna四面體納米分子進樣量這四個測定條件)對檢測結(jié)果的影響進行了進一步的實驗。對每一個條件都由低濃度到高濃度分別選取五個點進行一系列實驗。

1.為考察q/c堿基互補配對個數(shù)對表面等離子共振hiv相關(guān)基因檢測傳感器的影響，本實驗采用了不同的堿基配對個數(shù)構(gòu)建表面等離子共振傳感器。如圖4可見，信噪比隨著堿基配對個數(shù)的不同而不同，當q/c堿基配對個數(shù)為6時，信噪比為最大值，說明這個堿基配對個數(shù)為最佳。

圖4中，捕獲探針的進樣量為100μl，濃度為1μm?；旌弦褐袕秃衔飌rq、單鏈f的濃度均為250nm，靶序列t的濃度為100nm。熵驅(qū)動的鏈置換循環(huán)放大反應(yīng)溫度為37℃，反應(yīng)時間為60min，進樣量為30μl。雙層dna四面體納米分子的濃度為1μm，進樣量為60μl。再生液naoh水溶液的濃度為50mm，進樣量為5μl。流速均為2μl·min^-1。其他操作與實施例1相同。

當q/c堿基配對個數(shù)為6時，q鏈的核苷酸序列為：

5'-atgtggaaaatctctagcagtagggccgtaagttagttggagacgtaggcggatcc-3'(seqidno.4)。

當q/c堿基配對個數(shù)為4時，q鏈的核苷酸序列為：

5'-atgtggaaaatctctagcagtagggccgtaagttagttggagacgtaggcggat-3'(seqidno.5)。

當q/c堿基配對個數(shù)為5時，q鏈的核苷酸序列為：

5'-atgtggaaaatctctagcagtagggccgtaagttagttggagacgtaggcggatc-3'(seqidno.6)。

當q/c堿基配對個數(shù)為7時，q鏈的核苷酸序列為：

5'-atgtggaaaatctctagcagtagggccgtaagttagttggagacgtaggcggatcct-3'(seqidno.7)。

當q/c堿基配對個數(shù)為8時，q鏈的核苷酸序列為：

5'-atgtggaaaatctctagcagtagggccgtaagttagttggagacgtaggcggatccta-3'(seqidno.8)。

空白對照組是指加有除靶序列t以外的兩步放大體系的spr響應(yīng)信號值。

當q/c堿基配對個數(shù)為3時，也能得到較好的檢測結(jié)果，此處不再贅述。

2.為考察熵驅(qū)動的鏈置換循環(huán)放大反應(yīng)時間對表面等離子共振hiv相關(guān)基因檢測傳感器的影響，本實驗采用了含不同反應(yīng)時間(15，30，45，60，75min)的反應(yīng)體系，然后進行表面等離子共振檢測，如圖5可見，聚合延伸體系的最佳反應(yīng)時間為30min。

圖5中，捕獲探針的進樣量為100μl，濃度為1μm。

q/c堿基互補配對個數(shù)為6，q鏈序列為q6：

5'-atgtggaaaatctctagcagtagggccgtaagttagttggagacgtaggcggatcc-3'(seqidno.4)。

混合液中復合物prq、單鏈f的濃度均為250nm，靶序列t的濃度為100nm。熵驅(qū)動的鏈置換循環(huán)放大反應(yīng)溫度為37℃，進樣量為30μl。雙層dna四面體納米分子的濃度為1μm，進樣量為60μl。再生液naoh的濃度為50mm，進樣量為5μl。流速均為2μl·min^-1。其他操作與實施例1相同。

空白對照組是指加有除靶序列t以外的兩步放大體系的spr響應(yīng)信號值。

3.同理，為考察熵驅(qū)動的鏈置換循環(huán)放大反應(yīng)溫度對表面等離子共振hiv相關(guān)基因檢測傳感器的影響，本實驗采用了不同的反應(yīng)溫度(4℃，25℃，37℃，42℃，48℃)，然后進行表面等離子共振檢測。如圖6可見，信噪比最佳的雜交溫度為37℃。

圖6中，捕獲探針的進樣量為100μl，濃度為1μm。q/c堿基互補配對個數(shù)為6，q鏈序列為q6：

5'-atgtggaaaatctctagcagtagggccgtaagttagttggagacgtaggcggatcc-3'(seqidno.4)?；旌弦褐袕秃衔飌rq、單鏈f的濃度均為250nm，靶序列t的濃度為100nm。熵驅(qū)動的鏈置換循環(huán)放大反應(yīng)時間為30min，進樣量為30μl。雙層dna四面體納米分子的濃度為1μm，進樣量為60μl。再生液naoh的濃度為50mm，進樣量為5μl。流速均為2μl·min^-1。其他操作與實施例1相同。

空白對照組是指加有除靶序列t以外的兩步放大體系的spr響應(yīng)信號值。

4.同理，為考察雙層dna四面體納米分子進樣量對表面等離子共振hiv相關(guān)基因檢測傳感器的影響，本實驗采用了不同的進樣體積(10，20，30，40，50μl)，然后進行表面等離子共振檢測。如圖7可見，信噪比最佳的進樣體積為30μl。

圖7中，捕獲探針的進樣量為100μl，濃度為1μm。q/c堿基互補配對個數(shù)為6，q鏈序列為q6：

5'-atgtggaaaatctctagcagtagggccgtaagttagttggagacgtaggcggatcc-3'(seqidno.4)?；旌弦褐袕秃衔飌rq、單鏈f的濃度均為250nm，靶序列t的濃度為100nm。熵驅(qū)動的鏈置換循環(huán)放大反應(yīng)溫度為37℃，反應(yīng)時間為30min，進樣量為30μl。雙層dna四面體納米分子的濃度為1μm。再生液naoh的濃度為50mm，進樣量為5μl。流速均為2μl·min^-1。其他操作與實施例1相同。

空白對照組數(shù)據(jù)是指加有除靶序列t以外的兩步放大體系的spr響應(yīng)信號值。

圖4-圖7中，信噪比是指實驗組與對照組在同一橫坐標條件下的spr響應(yīng)信號值之比。

實施例4制備的表面等離子共振hiv相關(guān)基因檢測傳感器的性能分析

為了評估表面等離子共振hiv相關(guān)基因檢測傳感器的性能，在最優(yōu)實驗條件下，對以雜交液(ph7.0)配制的不同濃度的hiv相關(guān)基因標準品進行分析。

捕獲探針的進樣量為100μl，濃度為1μm。q/c堿基互補配對個數(shù)為6，q鏈序列為q6：

5'-atgtggaaaatctctagcagtagggccgtaagttagttggagacgtaggcggatcc-3'(seqidno.4)?；旌弦褐袕秃衔飌rq、單鏈f的濃度均為250nm，靶序列t的濃度a-g依次為150nm、15nm、1.5nm、150pm、15pm、1.5pm、0。熵驅(qū)動的鏈置換循環(huán)放大反應(yīng)溫度為37℃，反應(yīng)時間為30min，進樣量為30μl。雙層dna四面體納米分子的濃度為1μm，進樣量為30μl。再生液naoh的濃度為50mm，進樣量為5μl。流速均為2μl·min^-1。其他操作與實施例1相同。

具體的，用雜交液(ph7.0)稀釋hiv相關(guān)基因到6個不同濃度(150nm，15nm，1.5nm，150pm，15pm，1.5pm)，進樣30μl，用四參數(shù)(四參數(shù)包括q/c堿基配對個數(shù)、熵驅(qū)動的鏈置換循環(huán)放大反應(yīng)時間、熵驅(qū)動的鏈置換循環(huán)放大反應(yīng)溫度、雙層dna四面體納米分子進樣量)擬合繪制校準s形曲線，校準曲線檢測范圍為1pm-150nm，回歸方程為y(δru)＝152.55×lgc(nm)+863.36，相關(guān)系數(shù)為0.9906。將未添加hiv相關(guān)基因的雜交液作為空白對照，并重復檢測3次，計算平均值和標準差，根據(jù)空白信號平均值加上3倍標準差所對應(yīng)的值估計最低檢出限，計算得50fm，檢測結(jié)果如圖8-a所示，標準曲線如圖8-b所示。

實施例5制備的表面等離子共振hiv相關(guān)基因檢測傳感器的特異性分析

表面等離子共振hiv相關(guān)基因檢測傳感器的特異性，在分析不分離的生物樣本中的基因序列時具有重要的作用，主要取決于識別體系的特異性。為了評價本表面等離子共振hiv相關(guān)基因檢測傳感器的特異性，我們對與hiv相關(guān)基因相比的單堿基突變、雙堿基突變、完全不互補序列分別采用實施例4所構(gòu)建的表面等離子共振hiv相關(guān)基因檢測傳感器進行測定。序列分別為：

單堿基錯配：5'-actgctagagattttccactt-3'(seqidno.19)。

雙堿基錯配：5'-actgctagagattttacactt-3'(seqidno.20)。

完全不互補：5'-tagcttatcagactgatgttga-3'(seqidno.21)。

捕獲探針的進樣量為100μl，濃度為1μm。q/c堿基互補配對個數(shù)為6，q鏈序列為q6：

5'-atgtggaaaatctctagcagtagggccgtaagttagttggagacgtaggcggatcc-3'(seqidno.4)?；旌弦褐袕秃衔飌rq、單鏈f的濃度均為250nm，各錯配序列的濃度為100nm。熵驅(qū)動的鏈置換循環(huán)放大反應(yīng)溫度為37℃，反應(yīng)時間為30min，進樣量為30μl。雙層dna四面體納米分子的濃度為1μm，進樣量為30μl。再生液naoh的濃度為50mm，進樣量為5μl。流速均為2μl·min^-1。

結(jié)果如圖9所示，相比同濃度的hiv相關(guān)基因，單堿基和雙堿基突變序列的spr響應(yīng)信號都有明顯降低，完全不互補序列接近空白所對應(yīng)的spr響應(yīng)信號。這些結(jié)果說明制備的表面等離子共振hiv相關(guān)基因檢測傳感器具有良好的特異性。

圖9中，target、sm、dm、nc、blank依次表示實施例1中的靶序列t、本實施例中的單堿基錯配序列、雙堿基錯配序列、完全不互補序列以及空白對照組(空白對照組是指加有除靶序列t以外的兩步放大體系)的spr響應(yīng)信號值。

實施例6制備的表面等離子共振hiv相關(guān)基因檢測傳感器的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性分析

工作芯片固定一次捕獲探針，采用實施例4所構(gòu)建的表面等離子共振hiv相關(guān)基因檢測傳感器進行測定，以100nm靶序列t為樣品，檢測樣品30次，spr響應(yīng)信號降低﹤10％，表明工作芯片重復多次使用也能保持良好的性能。用工作芯片在最優(yōu)實驗條件下(即采用實施例4所構(gòu)建的spr傳感器)對1nm靶序列t進行檢測，重復進行三次平行實驗，變異系數(shù)為6.5％，表明本發(fā)明制備的表面等離子共振hiv相關(guān)基因檢測傳感器具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

綜上所述，本發(fā)明具有如下有益效果：(1)本發(fā)明研制了一種基于熵驅(qū)動的鏈置換循環(huán)放大體系和雙層dna四面體納米分子雙重信號放大的表面等離子共振傳感器，可以用于靈敏、快速、特異地檢測hiv相關(guān)基因。首先設(shè)計雙巰基標記的莖環(huán)型捕獲探針，該探針可與熵驅(qū)動的鏈置換循環(huán)放大體系輸出的雙鏈dna產(chǎn)物結(jié)合。通過設(shè)計，雙鏈dna產(chǎn)物的另一端可與雙層dna四面體納米分子結(jié)合。若樣品中不存在hiv相關(guān)基因時，不能觸發(fā)熵驅(qū)動的鏈置換循環(huán)放大反應(yīng)，不能輸出雙鏈dna產(chǎn)物，進而不能與捕獲探針結(jié)合；當樣品中存在hiv相關(guān)基因時，熵驅(qū)動的鏈置換循環(huán)放大反應(yīng)被觸發(fā)，輸出雙鏈dna產(chǎn)物，并游離出靶序列t進行第一次信號放大。結(jié)合到芯片表面的雙鏈dna產(chǎn)物可進一步結(jié)合雙層dna四面體納米分子，形成第二次信號放大。表面等離子共振傳感器對hiv相關(guān)基因進行檢測，校準曲線做四參數(shù)擬合，回歸方程為y(δru)＝152.55×lgc(nm)+863.36，檢測范圍為1pm-150nm，相關(guān)系數(shù)為0.9906，最低檢測限為50fm。當然，根據(jù)實驗結(jié)果，僅基于熵驅(qū)動的鏈置換循環(huán)放大體系也能對hiv相關(guān)基因進行檢測，在此基礎(chǔ)上，再加入單層或雙層dna四面體納米分子放大體系，能夠取得更好的檢測效果。

(2)特異性好：本發(fā)明首先制得雙巰基標記的莖環(huán)型捕獲探針，該探針與雙鏈dna復合物f-q互補結(jié)合，f-q上的結(jié)合位點在f鏈和q鏈上各有一段，該設(shè)計大大提高了識別的特異性。靶序列通過立足點觸發(fā)熵驅(qū)動的鏈置換反應(yīng)，整個過程嚴格遵守堿基互補配對原則，特異性好。雙鏈dna復合物f-q通過單鏈dna末端結(jié)合dna四面體納米分子，整個過程嚴格遵守堿基互補配對原則，降低了大分子顆粒吸附作用對結(jié)果的影響，大大提高了對靶序列檢測的特異性。

(3)檢測速度快：本發(fā)明利用熵驅(qū)動的鏈置換反應(yīng)和預先制備好的雙層dna四面體納米分子進行hiv相關(guān)基因的表面等離子共振檢測，整個過程僅需1h，相比其他方法大大縮短了檢測時間，檢測速度快。

上述實施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。

sequencelisting

<110>重慶醫(yī)科大學

<120>一種檢測hiv相關(guān)基因的spr傳感器及其制備與應(yīng)用

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<223>完全不互補序列

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