本發(fā)明涉及k-卡拉膠寡糖領(lǐng)域，具體地說是一種具有抗氧化活性的k-卡拉膠寡糖制備方法。

背景技術(shù)：

卡拉膠作為一種結(jié)構(gòu)獨(dú)特的天然海洋硫酸多糖，被稱為類肝素多糖，其生物活性已經(jīng)成為當(dāng)前多糖研究領(lǐng)域中的一個熱點(diǎn)。近年來，卡拉膠在生理學(xué)和病理學(xué)研究中所顯出來的生物活性已相繼被人們發(fā)現(xiàn)。實驗研究顯示，卡拉膠具有抗血管新生、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗菌、抗病毒、降血糖等生物學(xué)活性。但由于卡拉膠多糖分子量較大，溶解性和吸收性較差，結(jié)構(gòu)復(fù)雜等原因，限制了其應(yīng)用。而卡拉膠寡糖分子量較小，溶解性增強(qiáng)，結(jié)構(gòu)簡化，易于吸收，穩(wěn)定性和安全性都有所增加，多糖鏈經(jīng)過不同形式的斷裂后活性基團(tuán)充分暴露，其活性較卡拉膠有顯著提高，同時寡糖還具有低毒性的特征，因此拓寬了卡拉膠的應(yīng)用范圍，目前卡拉膠寡糖活性的研究已日益受到關(guān)注。

卡拉膠寡糖是從紅藻細(xì)胞壁中提取得到的一種水溶性硫酸寡糖，主要存在于紅藻綱的角叉菜屬(chondrus)、杉藻屬(gigartina)、麒麟菜屬(eucheuma)和沙菜屬中。

卡拉膠寡糖的基本結(jié)構(gòu)是由β(1→3)-d-吡喃半乳糖(g)和α(1→4)-d-吡喃半乳糖(d)為基本骨架交替連接形成的硫酸線性寡糖。根據(jù)是否含有3，6-內(nèi)醚半乳糖以及半乳糖上的硫酸基團(tuán)的含量和分子中半乳糖所連接的位置不同，卡拉膠寡糖可分為八種類型：k-卡拉膠寡糖、γ-卡拉膠寡糖、ι-卡拉膠寡糖、ω-卡拉膠寡糖、λ-卡拉膠寡糖、υ-卡拉膠寡糖、ψ-卡拉膠寡糖、ξ-卡拉膠寡糖。常用的卡拉膠寡糖主要有k-、ι-、λ-型。

目前卡拉膠寡糖的制備主要有化學(xué)降解、物理降解和酶降解三種方法?；瘜W(xué)和物理降解方法存在反應(yīng)條件不易控制、降解產(chǎn)物不均一等缺點(diǎn)，在工業(yè)生產(chǎn)中受到限制，而酶降解法可以最大程度地保護(hù)反應(yīng)底物的活性基團(tuán)不會在降解過程中受到破壞，降解產(chǎn)物均一，反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)物活性較高。在酶解制備卡拉膠寡糖方法有報道，但是未見具有抗氧化活性的酶解k-卡拉膠寡糖的報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的問題是提供一種具有抗氧化活性的k-卡拉膠寡糖制備方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種具有抗氧化活性的k-卡拉膠寡糖制備方法，包括以下步驟：(a)k-卡拉膠酶的制備

將cellulophagalyticastrainn5-2菌種接種于活化培養(yǎng)基中，于20-30℃、150-250rpm/min搖床中培養(yǎng)15-20h，進(jìn)行培養(yǎng)活化，得到種子液；

按2-4％的接種量將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于20-30℃、150-250rpm/min搖床中培養(yǎng)15-20h，得到發(fā)酵液；

將發(fā)酵液在4℃條件下，于4000-5000r/min冷凍離心20min，離心后取上清液，得到粗酶液；

(b)k-卡拉膠寡糖的制備

k-卡拉膠的溶解：用0.1mol/l的na2hpo4·12h2o將k-卡拉膠配置為濃度為1％的溶液，在40℃加熱攪拌使之完全溶解，

k-卡拉膠的酶解：將粗酶液與溶解的k-卡拉膠溶液按照1:7～10的體積比混合，于40℃水浴加熱攪拌5-10min，

酶解液滅活：將酶解后的液體于100℃滅活15min，

酶解液離心：將酶解滅活的產(chǎn)物于8000r/min，高速離心10min；

酶解液凍干：酶解液離心物真空冷凍干燥，得到k-卡拉膠寡糖粉末。

進(jìn)一步的，本發(fā)明還包括上述具有抗氧化活性的k-卡拉膠寡糖的清除羥自由基能力的測定，其包括以下步驟：

取1.0ml濃度為1.865mmol/l鄰二氮菲的無水乙醇溶液于帶塞試管中，分別加入濃度為0.2m的ph7.4磷酸鹽緩沖液2ml和1ml不同濃度系列的k-卡拉膠寡糖混合，濃度系列為1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml、8mg/ml，充分混合后加入1.0ml濃度為1.865mmol/l的feso4·7h2o溶液，再次混勻后加入1.0ml0.03％(v/v)的h2o2，于37℃恒溫水浴，保持60min；

最后，在536nm下分別測量各組混合溶液的吸光度值as，以蒸餾水代替樣品作為空白組測吸光度值ab，以蒸餾水替代h2o2作為損傷組，測吸光度an，以抗壞血酸代替樣品作為陽性對照，抗氧化劑的羥自由基清除率按以下公式計算：

羥自由基清除率(％)＝[(as-an)/(ab-an)]×100。

進(jìn)一步的，本發(fā)明還包括上述具有抗氧化活性的k-卡拉膠寡糖的清除超氧陰離子能力的測定，包含以下步驟：

在96孔板孔中依次加入黃嘌呤與nbt的混合液、100μl的0.049units/ml黃嘌呤氧化酶、50μl不同濃度系列的k-卡拉膠寡糖溶液，混勻；

混勻后于37℃孵育30min，酶標(biāo)儀測od560值，不加樣品溶液作為空白對照，維生素c為陽性對照，每個濃度的樣品平行測定三次，分別計算清除率；

樣品清除率＝(od空白-od樣品)/od空白×100％。

進(jìn)一步的，上述中的黃嘌呤與nbt的混合液是將50μl黃嘌呤0.4mmol/l和50μlnbt0.24mmol/l溶于0.01mol/lph＝8.0的pbs中，定容至150ml；不同濃度系列的k-卡拉膠寡糖分別為1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml、8mg/ml。

本發(fā)明制備方法比現(xiàn)有的制備方法更簡單、快捷。本發(fā)明采用酶法降解，使得制備過程簡單快捷、產(chǎn)物的率高、質(zhì)量穩(wěn)定，并且該產(chǎn)品具有抗氧化活性，具有開發(fā)具有抗氧化功能的保健食品的前景。

附圖說明

圖1為k-卡拉膠寡糖hplc檢測圖；

圖2為k-卡拉膠四糖esi-ms檢測圖；

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。

一種具有抗氧化活性的k-卡拉膠寡糖的制備方法具體包括：

一、k-卡拉膠酶的制備

1、將篩選的cellulophagalyticastrainn5-2菌種先接種于活化培養(yǎng)基中，于20-30℃、150-250rpm/min搖床培養(yǎng)15-20h，進(jìn)行培養(yǎng)活化，得到種子液。

2、按2-4％的接種量將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，20-30℃、150-250rpm/min搖床培養(yǎng)15-20h。

3、將發(fā)酵液在4℃條件下，4000-5000r/min冷凍離心20min，離心后取上清液，即為粗酶液。

二、k-卡拉膠寡糖的制備

1、k-卡拉膠的溶解：用0.1mol/l的na2hpo4·12h2o將k-卡拉膠配置為濃度為1％的溶液，40℃加熱攪拌使之完全溶解。

2、k-卡拉膠的酶解，將制備好的粗酶液與步驟1溶解的k-卡拉膠溶液按照1:7-10的體積比混合，40℃水浴加熱攪拌5-10min即可。

3、酶解液滅活，將酶解后的液體100℃滅活15min；

4、酶解液離心，酶解的產(chǎn)物8000r/min，高速離心10min；

5、酶解液凍干，酶解液真空冷凍干燥后的k-卡拉膠寡糖粉末。

三、k-卡拉膠寡糖的檢測分析

1、高效液相色譜(hplc)分析

檢測儀器：美國戴安dionexultimate3000液相色譜儀，色譜條件：色譜柱kromasilc18(4.6mm×150mm，5μm)；流動相：磷酸鹽緩沖液/乙腈(83:17，v/v)；檢測器：二極管陣列紫外檢測器(dad)。

表1k-卡拉膠寡糖hplc檢測結(jié)果

由上表1及圖1所示，k-卡拉膠寡糖主要含有k-卡拉膠二糖、四糖、六糖、八糖。根據(jù)高效液相色譜對降解后得到的k-卡拉膠寡糖的分析，其主要含有k-卡拉膠二糖、四糖、六糖、八糖，恰恰正是這種比例的各糖分布，使得其能夠有效的促進(jìn)機(jī)體的抗氧化功能，清除自由基對機(jī)體的損傷。

2、將k-卡拉膠寡糖用凝膠柱分離純化后得到k-卡拉膠四糖，進(jìn)行電噴霧質(zhì)譜(esi-ms)分析。結(jié)果如圖2所示，本申請中的k-卡拉膠酶屬于16族糖苷水解酶，為專一性內(nèi)切酶，專門水解α-3,6-內(nèi)醚-d-半乳糖和β-4-硫酸-d-半乳糖之間的β-1,4-糖苷鍵。k-卡拉膠酶專一性高、活性大，得到的產(chǎn)物分子量分布窄，對降解底物的硫酸根沒有破壞。

四、k-卡拉膠寡糖的抗氧化活性的檢測

1、k-卡拉膠寡糖清除羥自由基能力的測定

試劑：1.865mmol/l鄰二氮菲、無水乙醇溶液、0.2m的ph7.4磷酸鹽緩沖液、1.865mmol/l的feso4·7h2o溶液、0.03％(v/v)的h2o2、1mg/ml抗壞血酸

測定方法：

取1.0ml濃度為1.865mmol/l鄰二氮菲的無水乙醇溶液于帶塞試管中，分別加入濃度為0.2m的ph7.4磷酸鹽緩沖液2ml和1ml不同濃度的k-卡拉膠寡糖(濃度分別為1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml、8mg/ml)，充分混勻后加入1.0ml濃度為1.865mmol/l的feso4·7h2o溶液，再次混勻后加入1.0ml0.03％(v/v)的h2o2，于37℃恒溫水浴，60min后，在536nm下分別測量各組混合溶液的吸光度值得as，以蒸餾水代替樣品作為空白組測吸光度值得ab，以蒸餾水替代h2o2作為損傷組，測其吸光度值an，以抗壞血酸代替樣品作為陽性對照，抗氧化劑的羥自由基清除率按以下公式計算：

羥自由基清除率(％)＝[(as-an)/(ab-an)]×100。

表2k-卡拉膠寡糖對羥基自由基清除率

由表2可見，隨著k-卡拉膠寡糖濃度逐漸增加，其清除羥自由基的能力逐漸增加，當(dāng)k-卡拉膠寡糖濃度為8mg/ml時，其清除羥自由基的能力最大，達(dá)到陽性對照vc的28倍。

五、k-卡拉膠寡糖清除超氧陰離子能力的測定

試劑

xanthine(黃嘌呤):0.4mmol/l、xanthineoxidase(黃嘌呤氧化酶)貯液:1unit/ml、0.05unit/ml、nbt:(nitrobluetetrazoliumchloride氯化硝基四氮唑藍(lán)),0.24mmol、pbs(0.01mol/l,ph＝8.0)、pbs(0.01mol/l,ph＝7.4)、ascorbicacid:1mg/ml、hcl：1mol/l、naoh：1mol/l。

測定方法：

在96孔板孔中依次加入100μl黃嘌呤(0.4mmol/l)和nbt(0.24mmol/l)的混合液(每種各50μl，溶于0.01mol/l的pbs，ph＝8.0)，100μl黃嘌呤氧化酶(0.049units/ml),50μl不同濃度的k-卡拉膠寡糖溶液(濃度分別為1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml、8mg/ml)。混勻后37℃孵育30min,酶標(biāo)儀測od560值(扣除od800值)。不加樣品溶液作為空白對照，vc(維生素c)為陽性對照，每個濃度的樣品平行測定三次，分別計算清除率及樣品的ic50。

樣品清除率＝(od空白-od樣品)/od空白×100％.

表3k-卡拉膠寡糖對超氧陰離子清除率

由表3可見，隨著k-卡拉膠寡糖濃度逐漸增加，其清除超氧陰離子的能力逐漸增加，當(dāng)k-卡拉膠寡糖濃度為8mg/ml時，其清除超氧陰離子的能力最大，達(dá)到陽性對照vc的21倍。

通過對抗氧化活性的k-卡拉膠寡糖的測定，確定了抗氧化活性的k-卡拉膠寡糖在對超氧陰離子清除率、清楚超氧陰離子能力具有很好的效果，且本發(fā)明制備簡單、科學(xué)合理，具有較好的經(jīng)濟(jì)前景。

以上所述的本發(fā)明實施方式，并不構(gòu)成對本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。任何在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的權(quán)利要求保護(hù)范圍之內(nèi)。