本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及兒童急性淋巴細(xì)胞白血病基因分型的試劑盒。
背景技術(shù)：
：白血病是造血系統(tǒng)的惡性增殖性疾病，是嚴(yán)重威脅小兒生命和健康的疾病之一。其中，急性淋巴細(xì)胞白血病(acutelymphoblasticleukemia，all)是最常見的類型，占兒童白血病的75％-80％。目前公認(rèn)兒童all是多基因、多信號通路改變的一種異質(zhì)性腫瘤。初診時(shí)精確的診斷分型是保證臨床合理化治療、取得良好預(yù)后的基礎(chǔ)。目前國際上對兒童all的診斷分型通用的是細(xì)胞形態(tài)學(xué)(morphology)、免疫學(xué)(immunology)、細(xì)胞遺傳學(xué)(cytogenetics)和分子生物學(xué)(molecularbiology)分型，即micm分型。根據(jù)micm分型結(jié)果，一般分為如下七個(gè)亞型：bcr-abl1+all、e2a-pbx1+all、超二倍體all、mll基因重排+all、othersb-all、t-all和tel-aml1+all。然而，在micm分型指導(dǎo)下，大約25％的all患兒至今未能檢出染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常；即使相同亞型的患兒，采用相同的治療方案，也可出現(xiàn)不同的治療效果?？梢姡哂邢嗤螒B(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)和融合基因特征的兒童all，還具有更微觀水平的其他區(qū)別。因此，探索更加精確合理、簡便快捷并易于臨床推廣應(yīng)用的分型方法已成為兒童all個(gè)性化治療的迫切需要。采用簡捷高效的gexp多重基因表達(dá)遺傳分析技術(shù)(multiplexgeneexpressionprofilergeneticanalysissystem，gexp)檢測57個(gè)與臨床亞型密切相關(guān)的分型基因，可準(zhǔn)確將兒童all分成上述七個(gè)亞型，與micm常規(guī)分型的符合率達(dá)到94％(具體內(nèi)容已在中國發(fā)明專利文獻(xiàn)cn104059970b中公開)。該方法具有實(shí)驗(yàn)成本低且檢測周期短等優(yōu)點(diǎn)，但操作步驟較繁瑣、靈敏度較低且反應(yīng)體系較不穩(wěn)定。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何對兒童急性淋巴細(xì)胞白血病進(jìn)行基因分型。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了用于兒童急性淋巴細(xì)胞白血病基因分型檢測的試劑盒。該試劑盒適用于采用gexp多重基因表達(dá)遺傳分析系統(tǒng)，通過3個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)對56個(gè)兒童急性淋巴細(xì)胞白血病的分型基因(其中pbx1基因在gexp系統(tǒng)中設(shè)計(jì)兩對引物，實(shí)則57對引物)進(jìn)行檢測。所述試劑盒為試劑盒甲或試劑盒乙。本發(fā)明所提供的試劑盒甲可包括引物對組a、引物對組b和引物對組c，其特征在于：所述試劑盒甲還包括udg酶和dutp。每個(gè)引物對組對應(yīng)于1個(gè)gexp擴(kuò)增反應(yīng)。所述引物對組a可含有如下20個(gè)引物對：20個(gè)正向引物的序列分別為：序列1至序列20均去除自5’末端起的18個(gè)核苷酸后所形成的20個(gè)序列；與所述20個(gè)正向引物相匹配的反向引物的序列依次分別為：序列21至序列40均去除自5’端末端起的19個(gè)核苷酸后所形成的20個(gè)序列。所述引物對組b可含有如下18個(gè)引物對：18個(gè)正向引物的序列分別為：序列41至序列58均去除自5’末端起的18個(gè)核苷酸后所形成的18個(gè)序列；與所述18個(gè)正向引物相匹配的反向引物的序列依次分別為：序列59至序列76均去除自5’端末端起的19個(gè)核苷酸后所形成的18個(gè)序列。所述引物對組c可含有如下19個(gè)引物對：19個(gè)引物對的正向引物的序列分別為：序列77至序列95均去除自5’末端起的18個(gè)核苷酸后所形成的19個(gè)序列；與所述19個(gè)正向引物相匹配的反向引物的序列依次分別為：序列96至序列114均去除自5’端末端起的19個(gè)核苷酸后所形成的19個(gè)序列。在實(shí)際操作中，為了保證gexp系統(tǒng)檢測的高準(zhǔn)確性，所述試劑盒甲中，所述引物對組a、所述引物對組b和所述引物對組c中均還可包括如下3個(gè)內(nèi)參引物對和2個(gè)質(zhì)控引物對：所述3個(gè)內(nèi)參引物對的正向引物的序列分別可為：序列115至序列117均去除自5’末端起的18個(gè)核苷酸后所形成的3個(gè)序列；與所述3個(gè)內(nèi)參引物對的正向引物相匹配的反向引物的序列依次分別可為：序列118至序列120均去除自5’端末端起的19個(gè)核苷酸后所形成的3個(gè)序列；所述2個(gè)質(zhì)控引物對的正向引物的序列分別可為：序列121和序列122均去除自5’末端起的18個(gè)核苷酸后所形成的2個(gè)序列；與所述2個(gè)質(zhì)控引物對的正向引物相匹配的反向引物的序列依次分別可為：序列123和序列124均去除自5’端末端起的19個(gè)核苷酸后所形成的2個(gè)序列。上述任一所述試劑盒甲可由所述引物對組a、所述引物對組b、所述引物對組c、所述udg酶和所述dutp組成。在本發(fā)明中，所述引物對組a具體由所述試劑盒甲中如上所述20個(gè)引物對(所述引物對組a中)、所述3個(gè)內(nèi)參引物對和所述2個(gè)質(zhì)控引物對組成；所述引物對組b具體由所述試劑盒甲中如上所述18個(gè)引物對(所述引物對組b中)、所述3個(gè)內(nèi)參引物對和所述2個(gè)質(zhì)控引物對組成；所述引物對組c具體由所述試劑盒甲中如上所述19個(gè)引物對(所述引物對組c中)、所述3個(gè)內(nèi)參引物對和所述2個(gè)質(zhì)控引物對組成。其中，以上所有的自5’末端起的18個(gè)核苷酸，以及自5’端末端起的19個(gè)核苷酸，均為為實(shí)現(xiàn)采用gexp多重基因表達(dá)遺傳分析系統(tǒng)對兒童急性淋巴細(xì)胞白血病的分型基因的表達(dá)量進(jìn)行測定而設(shè)置的正向通用tag序列(5’-aggtgacactatagaata-3’)和反向通用tag序列(5’-gtacgactcactataggga-3’)。本發(fā)明所提供的試劑盒乙可包括引物對組a’、引物對組b’和引物對組c’，其特征在于：所述試劑盒乙還可包括udg酶和dutp。每個(gè)引物對組對應(yīng)于1個(gè)gexp擴(kuò)增反應(yīng)。所述引物對組a’可含有如下20個(gè)引物對：20個(gè)正向引物的序列分別為序列1至序列20；與所述20個(gè)正向引物相匹配的反向引物的序列依次分別為序列21至序列40。所述引物對組b’可含有如下18個(gè)引物對：18個(gè)正向引物的序列分別為序列41至序列58；與所述18個(gè)正向引物相匹配的反向引物的序列依次分別為序列59至序列76。所述引物對組c’可含有如下19個(gè)引物對：20個(gè)正向引物的序列分別為序列77至序列95；與所述20個(gè)正向引物相匹配的反向引物的序列依次分別為序列96至序列114。在實(shí)際操作中，為了保證gexp系統(tǒng)檢測的高準(zhǔn)確性，所述試劑盒乙中，所述引物對組a’、所述引物對組b’和所述引物對組c’中均還可包括如下3個(gè)內(nèi)參引物對和2個(gè)質(zhì)控引物對：所述3個(gè)內(nèi)參引物對的正向引物的序列分別可為序列115至序列117；與所述3個(gè)內(nèi)參引物對的正向引物相匹配的反向引物的序列依次分別可為序列118至序列120；所述2個(gè)質(zhì)控引物對的正向引物的序列分別可為序列121和序列122；與所述2個(gè)質(zhì)控引物對的正向引物相匹配的反向引物的序列依次分別可為序列123和序列124。上述任一所述試劑盒乙可由所述引物對組a’、所述引物對組b’、所述引物對組c’、所述udg酶和所述dutp組成。所述為引物對組a’-c’為：在所述引物對組a-c的每條正向引物的5’末端連接所述正向通用tag序列(5’-aggtgacactatagaata-3’)，在每條反向引物的5’末端連接所述反向通用tag序列(5’-gtacgactcactataggga-3’)。在本發(fā)明中，所述引物對組a’具體由所述試劑盒乙中如上所述20個(gè)引物對(所述引物對組a’中)、所述3個(gè)內(nèi)參引物對和所述2個(gè)質(zhì)控引物對組成；所述引物對組b’具體由所述試劑盒乙中如上所述18個(gè)引物對(所述引物對組b’中)、所述3個(gè)內(nèi)參引物對和所述2個(gè)質(zhì)控引物對組成；所述引物對組c’具體由所述試劑盒乙中如上所述19個(gè)引物對(所述引物對組c’中)、所述3個(gè)內(nèi)參引物對和所述2個(gè)質(zhì)控引物對組成。上述任一所述試劑盒中還可包括rt酶和/或dna聚合酶。所述dna聚合酶具體可為熱啟動(dòng)dna聚合酶。上述任一所述試劑盒中還可包括pcdna3.1(+)質(zhì)粒和/或kan基因編碼的rna片段。其中，所述kan基因編碼的rna片段為序列127所示的rna片段，在本發(fā)明中具體購自寧波海爾施基因科技有限公司，產(chǎn)品目錄號為p/n2060126。上述任一所述試劑盒的制備方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述任一所述試劑盒的制備方法，可包括包括將所述引物對組中組成各引物對的每條單鏈dna、所述udg酶和所述dutp分別單獨(dú)包裝的步驟。上述任一所述試劑盒在制備通過gexp多重基因表達(dá)遺傳分析系統(tǒng)進(jìn)行兒童急性淋巴細(xì)胞白血病基因分型的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明還保護(hù)一種用于兒童急性淋巴細(xì)胞白血病基因分型檢測的方法，可包括如下步驟：采用上述任一所述試劑盒對待測兒童急性淋巴細(xì)胞白血病患兒的rna進(jìn)行多重rt-pcr反應(yīng)，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行基因分型。本發(fā)明還保護(hù)一種通過gexp多重基因表達(dá)遺傳分析系統(tǒng)進(jìn)行兒童急性淋巴細(xì)胞白血病基因分型的產(chǎn)品。該產(chǎn)品含有上述任一所述試劑盒。上文中，采用上述任一所述試劑盒或上述任一所述產(chǎn)品對待測兒童急性淋巴細(xì)胞白血病患兒的rna進(jìn)行多重rt-pcr反應(yīng)的反應(yīng)體系可為10μl，由2μl模板、2.5μlrt-pcrbuffer、3μlleukemiaprimermix、1μlsolution、1μl濃度為0.25ng/μl的kanrrna和0.5μlrt-pcrenzymemix組成。所述leukemiaprimermix由56個(gè)分型基因(57對引物)、3個(gè)內(nèi)參基因和2個(gè)質(zhì)控基因的反向引物、56個(gè)分型基因(57對引物)、3個(gè)內(nèi)參基因和2個(gè)質(zhì)控基因的正向引物和pcdna3.1(+)質(zhì)粒組成。56個(gè)分型基因(57對引物)、3個(gè)內(nèi)參基因和2個(gè)質(zhì)控基因的反向引物在該多重rt-pcr反應(yīng)體系中的引物濃度如表5中第4列所示。56個(gè)分型基因(57對引物)、3個(gè)內(nèi)參基因和2個(gè)質(zhì)控基因的正向引物在該多重rt-pcr反應(yīng)體系中的引物濃度如表5中第5列所示。pcdna3.1(+)質(zhì)粒在所述leukemiaprimermix中的濃度為1000拷貝數(shù)/μl。solution為熒光標(biāo)記物和dntp的混合液，其中熒光標(biāo)記物的濃度可為12μm，datp、dctp和dgtp濃度均可為3.5mm，dutp和dttp的總濃度可為3.5mm，dutp和dttp的濃度比可為1:1、1:3或2:3。rt-pcrenzymemix由rt酶、熱啟動(dòng)dna聚合酶和udg酶混合而成。udg酶在所述rt-pcrenzymemix中的濃度可為0.25u/μl以上。rt酶、熱啟動(dòng)dna聚合酶和udg酶在所述rt-pcrenzymemix中的濃度依次可為10u/μl、2.5u/μl和0.25u/μl。rt酶、熱啟動(dòng)dna聚合酶和udg酶在所述rt-pcrenzymemix中的濃度依次可為10u/μl、2.5u/μl和0.375u/μl。所述kanrrna為序列表中序列127所示的rna片段，在本發(fā)明中具體購自寧波海爾施基因科技有限公司，產(chǎn)品目錄號為p/n2060126。所述rt-pcrbuffer在本發(fā)明中具體購自寧波海爾施基因科技有限公司。上述任一所述rt酶和上述任一所述熱啟動(dòng)dna聚合酶在本發(fā)明中具體購自寧波海爾施基因科技有限公司。實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明提供的試劑盒可進(jìn)行rt-pcr一步法，不僅使得操作更加簡便、污染的可能性減小、靈敏度提高，而且采用dutp/udg技術(shù)防污染，使得實(shí)驗(yàn)體系更加穩(wěn)定，準(zhǔn)確性和特異性大大提高，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。附圖說明圖1為不同dutp用量下的gexp多重基因遺傳分析系統(tǒng)檢測結(jié)果。圖2為檢測不同單位的udg酶抗污染能力。具體實(shí)施方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。下述實(shí)施例中，bcr-abl1+all簡稱bcr-abl1，e2a-pbx1+all簡稱e2a-pbx1，超二倍體all簡稱hyperdiploid，mll基因重排+all簡稱mll，othersb-all簡稱others，tel-aml1+all簡稱tel-aml1。rt-pcrbuffer、udg酶、rt酶和熱啟動(dòng)dna聚合酶均為寧波海爾施基因科技有限公司的產(chǎn)品。solutionx和kanrrna(序列表中序列127所示的rna片段)均為寧波海爾施基因科技有限公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為依次為p/n2060013和p/n2060126。solutionx為熒光標(biāo)記物和dntp的混合液，其中熒光標(biāo)記物的濃度為12μm，datp、dctp、dgtp和dttp濃度均為3.5mm。實(shí)施例1、臨床樣本的收集、采集及處理一、臨床標(biāo)本的收集收集2011年5月至2016年8月期間在北京兒童醫(yī)院治療的的219例all患兒的初診骨髓標(biāo)本(經(jīng)患兒本人或監(jiān)護(hù)人同意，并簽署了知情同意書)。二、急性淋巴細(xì)胞白血病初診患兒診斷分型219例all患兒經(jīng)過micm分型確診為all，包括t-all(tlineageall，t-all)患兒16例、前前b-all(progenitorblineageall，pro-b-all)患兒9例、前b-all(precursorblineageall，pre-b-all)患兒3例、普通b-all(commonblineageall，c-b-all)患兒191例。診斷分型標(biāo)準(zhǔn)按全國統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)(兒童急性淋巴細(xì)胞白血病診療建議.中華兒科雜志.2006，44(5)：392-395)。采用多重巢式反轉(zhuǎn)錄pcr方法檢測表1所示的45種染色體結(jié)構(gòu)畸變形成的融合基因。219例all患兒中，檢測結(jié)果呈陰性的白血病患兒133例，檢測結(jié)果呈陽性的白血病患兒86例(其中，tel-aml1融合基因陽性白血病患兒56例，e2a-pbx1融合基因陽性白血病患兒12例，mll基因重排的白血病患兒5例，sil-tal1融合基因陽性的白血病患兒4例，bcr-abl1融合基因陽性白血病患兒9例)。表1.北京兒童醫(yī)院常規(guī)檢測的45種融合基因聯(lián)合采用熒光原位雜交技術(shù)(fluorescenceinsituhybridization，fish)、染色體核型分析和流式細(xì)胞儀檢測骨髓細(xì)胞dna指數(shù)(dnaindex，di)的方法檢測染色體結(jié)構(gòu)或數(shù)目異常的變異。219例all患兒中，71例患兒為無染色體結(jié)構(gòu)異常的高超二倍體(hyperdiploid)，即染色體數(shù)目在51-65條，另有2例hyperdiploid患兒分別合并tel-aml1融合基因陽性和e2a-pbx1融合基因陽性；1例t-all和1例bcr-abl1融合基因陽性患兒同時(shí)伴有染色體數(shù)目減低，為亞二倍體(hypodiploid)，即染色體數(shù)目在30-39條。對219例all患兒總結(jié)如下：12例e2a-pbx1，其中1例同時(shí)為hyperdiploid；56例tel-aml1，其中1例同時(shí)為hyperdiploid；5例mll基因重排，其中1例同時(shí)伴有ikzf1缺失；9例bcr-abl1，其中1例同時(shí)為hypodiploid，另有5例同時(shí)伴有ikzf1缺失；71例hyperdiploid；16例t-all，其中4例含有sil-tal1融合基因，另有1例為hypodiploid；其余50例暫時(shí)未檢出任何染色體結(jié)構(gòu)或數(shù)目異常，暫歸為others。患兒詳細(xì)信息如表2所示。以其中1號患兒為例，融合基因?yàn)閠el-aml1，即表示該患兒檢測45種融合基因的結(jié)果只顯示她攜帶有融合基因tel-aml1，而剩余的44種融合基因檢測結(jié)果均為陰性，染色體數(shù)目正常。表2.219例患兒臨床信息注：“/”表示檢測結(jié)果均為陰性。三、骨髓標(biāo)本的采集在無菌條件下，分別抽取all患兒的骨髓2ml(從不同部位抽取，如胸骨或髂骨)，加入乙二胺四乙酸鹽(edta)抗凝。收集骨髓標(biāo)本要求：edta抗凝，骨髓量大于2ml，無血凝塊，標(biāo)本存放時(shí)間小于24h。四、提取單個(gè)核細(xì)胞從收集的骨髓中提取單個(gè)核細(xì)胞，操作步驟如下：a、取提取管，加入2ml骨髓標(biāo)本和10ml紅細(xì)胞裂解液(用蒸餾水溶解20mgedta鈉鹽、4.2g氯化銨和0.5g碳酸氫鉀，然后用蒸餾水定容至500ml)，充分混合，室溫放置3min，1000rpm常溫離心3min，然后棄上層液體(觀察提取管底層，如混有較多紅細(xì)胞，可重復(fù)該步驟1-2次，以去除紅細(xì)胞)。b、完成步驟a后，取所述提取管，加入10ml生理鹽水，充分混勻，1000rpm常溫離心3min，然后棄上層液體。c、完成步驟b后，取所述提取管，加入少量生理鹽水，充分混勻后轉(zhuǎn)移至ep管(規(guī)格為1.5ml)，4000rpm常溫離心5s，棄去上層液體，下層液體即為提取的單個(gè)核細(xì)胞標(biāo)本。單個(gè)核細(xì)胞標(biāo)本中的單個(gè)核細(xì)胞數(shù)應(yīng)在107個(gè)數(shù)量級。將單個(gè)核細(xì)胞標(biāo)本存放于-80℃冰箱，備用。五、提取單個(gè)核細(xì)胞的總rna用trizol試劑(invitrogen公司的產(chǎn)品)提取單個(gè)核細(xì)胞的總rna，提取步驟依次如下：a、將單個(gè)核細(xì)胞標(biāo)本從-80℃冰箱取出，立即加trizol試劑1ml，反復(fù)吹打混勻，室溫靜置5min(目的為使細(xì)胞溶解)。b、完成步驟a后，加入氯仿0.2ml，劇烈振搖15s，室溫靜置3min。然后4℃、12000rpm離心15min。c、完成步驟b后，將上層水相轉(zhuǎn)移至另一ep管(無rna酶)中，再加入0.5ml異丙醇，顛倒混勻3～4次，室溫靜置10min。然后4℃、12000rpm離心10min。d、完成步驟c后，棄上清，然后加入1ml75％(v/v)乙醇水溶液，充分洗滌沉淀，4℃、7500rpm離心5min。徹底棄上清，37℃干燥，將沉淀重懸于約20μl的depc水中。e、完成步驟d后，按1:1000比例稀釋rna(如：1μlrna加入1000μldepc水)，通過分光光度法測定樣品od260及od280，od260/od280比值應(yīng)大于或等于1.8，否則重新提取樣品。rna濃度(μg/μl)＝od260×40×稀釋倍數(shù)/1000＝od260×40。實(shí)施例2、gexp多重基因遺傳分析系統(tǒng)檢測一、引物的合成57個(gè)分型基因、3個(gè)內(nèi)參基因(b2m、psmc4和gusb)和2個(gè)質(zhì)控基因(pcdna3.1(+)和kanr)的引物序列已在中國發(fā)明專利文獻(xiàn)cn104059970b中公開，具體信息見表3。表3.57個(gè)分型基因、3個(gè)內(nèi)參基因和2個(gè)質(zhì)控基因的引物序列及分組排序注：序列1-126為加入了通用tag序列后的引物序列；片段大小*是指去除通用tag序列后的擴(kuò)增片段大小。二、gexp反應(yīng)體系優(yōu)化1、制備rna混合標(biāo)本隨機(jī)取表4中編號為1-16的16例初診all患兒rna標(biāo)本，先用dna/rna酶-freeh2o分別稀釋至50ng/μl，然后等體積混合，得到rna混合樣品。16例all患兒的臨床資料及rna初始濃度見表4。表4.16例all患兒rna樣品的臨床信息及rna濃度2、一步法多重rt-pcr反應(yīng)體系中引物濃度的初步優(yōu)化(1)一步法多重rt-pcr反應(yīng)體系的配制初始leukemiaprimermix由1體積份初始rtprimermix(由57個(gè)分型基因、3個(gè)內(nèi)參基因和2個(gè)質(zhì)控基因的反向引物混合而成)和1體積份初始pcrprimermix(由57個(gè)分型基因、3個(gè)內(nèi)參基因和2個(gè)質(zhì)控基因的正向引物混合，然后加入終濃度為1000拷貝數(shù)/μl的pcdna3.1(+)質(zhì)粒)混合而成。rt-pcrenzyme由rt酶和熱啟動(dòng)dna聚合酶混合而成；rt酶和熱啟動(dòng)dna聚合酶在rt-pcrenzyme中的濃度依次為10u/μl和2.5u/μl。配制一步法多重rt-pcr反應(yīng)體系。該一步法多重rt-pcr反應(yīng)體系為10μl，由2μl步驟1制備的rna混合標(biāo)本、2.5μlrt-pcrbuffer、3μl初始leukemiaprimermix、1μlsolutionx、1μl濃度為0.25ng/μl的kanrrna和0.5μlrt-pcrenzyme組成。57個(gè)分型基因、3個(gè)內(nèi)參基因和2個(gè)質(zhì)控基因的反向引物在該一步法多重rt-pcr反應(yīng)體系中的濃度均為333nm；57個(gè)分型基因、3個(gè)內(nèi)參基因和2個(gè)質(zhì)控基因的正向引物在該一步法多重rt-pcr反應(yīng)體系中的濃度均為66.7nm。(2)多重rt-pcr和gexp毛細(xì)管電泳取步驟(1)配制的一步法多重rt-pcr反應(yīng)體系，進(jìn)行多重rt-pcr，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。將該pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行g(shù)exp毛細(xì)管電泳。多重rt-pcr反應(yīng)條件：105℃熱蓋處理；25℃5min；50℃30min；95℃預(yù)變性15min；94℃變性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸1min；4℃保存。根據(jù)毛細(xì)管電泳結(jié)果選定信號相對適中的峰為基準(zhǔn)峰，調(diào)整各反向引物濃度，從而優(yōu)化反應(yīng)體系。具體優(yōu)化方法：比基準(zhǔn)峰高的反向引物設(shè)為一組，比基準(zhǔn)峰低的反向引物設(shè)為另外一組，分別向下或向上設(shè)不同濃度梯度，找出相對合適的引物濃度配制成改良的rtprimermix。改良的leukemiaprimermix由1體積份改良的rtprimermix和1體積份初始pcrprimermix混合而成。3、一步法多重rt-pcr反應(yīng)體系中dutp和dttp比例的確定由于dutp的擴(kuò)增效率低于dttp，應(yīng)在發(fā)揮dutp防污染作用的同時(shí)保證擴(kuò)增效率，因此dutp和dttp應(yīng)按一定比例加入。(1)一步法多重rt-pcr反應(yīng)體系的配制配制一步法多重rt-pcr反應(yīng)體系。一步法多重rt-pcr反應(yīng)體系為10μl，由2μl步驟1制備的rna混合標(biāo)本、2.5μlrt-pcrbuffer、3μl改良的leukemiaprimermix、1μlsolution(solutionx、solutiony1、solutiony2或solutiony3)、1μl濃度為0.25ng/μl的kanrrna和0.5μlrt-pcrenzyme組成。solutionx中，dutp的濃度為0mm，dttp的濃度為3.5mm。solutiony1和solutionx的唯一不同在于：solutiony1中還包括dutp，且dutp的濃度為0.88mm，dttp的濃度為2.62mm(dutp和dttp的濃度比為1:3)。solutiony2和solutionx的唯一不同在于：solutiony2中還包括dutp，且dutp的濃度為1.4mm，dttp的濃度為2.1mm(dutp和dttp的濃度比為2:3)。solutiony3和solutionx的唯一不同在于：solutiony3中還包括dutp，且dutp的濃度為1.75mm，dttp的濃度為1.75mm(dutp和dttp的濃度比為1:1)。(2)多重rt-pcr和gexp毛細(xì)管電泳同步驟2中(2)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1(a為solutionx，b為solutiony1，c為solutiony2，d為solutiony3)。結(jié)果表明，dutp的加入對擴(kuò)增效率影響不明顯，因此確定使用dutp和dttp的比例為1：1來進(jìn)行后續(xù)多重rt-pcr反應(yīng)。4、一步法多重rt-pcr反應(yīng)體系中udg酶用量的確定(1)一步法多重rt-pcr反應(yīng)體系的配制配制一步法多重rt-pcr反應(yīng)體系。該一步法多重rt-pcr反應(yīng)體系為10μl，由2μlpcr擴(kuò)增產(chǎn)物的稀釋液(將步驟3中(2)得到的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物用無dna/rna酶h2o稀釋107倍得到)、2.5μlrt-pcrbuffer、3μl改良的leukemiaprimermix、1μlsolutiony3、1μl濃度為0.25ng/μl的kanrrna和0.5μlrt-pcrenzymemix(rt-pcrenzyme、rt-pcrenzymemix1、rt-pcrenzymemix2或rt-pcrenzymemix3)組成。rt-pcrenzymemix1由rt酶、熱啟動(dòng)dna聚合酶和udg酶混合而成；rt酶、熱啟動(dòng)dna聚合酶和udg酶在rt-pcrenzymemix1中的濃度依次為10u/μl、2.5u/μl和0.125u/μl。rt-pcrenzymemix2由rt酶、熱啟動(dòng)dna聚合酶和udg酶混合而成；rt酶、熱啟動(dòng)dna聚合酶和udg酶在rt-pcrenzymemix2中的濃度依次為10u/μl、2.5u/μl和0.25u/μl。rt-pcrenzymemix3由rt酶、熱啟動(dòng)dna聚合酶和udg酶混合而成；rt酶、熱啟動(dòng)dna聚合酶和udg酶在rt-pcrenzymemix3中的濃度依次為10u/μl、2.5u/μl和0.375u/μl。(2)多重rt-pcr和gexp毛細(xì)管電泳同步驟2中(2)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2(a為rt-pcrenzyme，b為rt-pcrenzymemix1，c為rt-pcrenzymemix2，d為rt-pcrenzymemix3)。結(jié)果表明，0.25u的udg酶(即采用rt-pcrenzymemix2)足以消除稀釋107倍的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物污染。5、一步法多重rt-pcr反應(yīng)體系中引物終濃度的確定(1)一步法多重rt-pcr反應(yīng)體系的配制配制一步法多重rt-pcr反應(yīng)體系。該一步法多重rt-pcr反應(yīng)體系為10μl，由2μl步驟1制備的rna混合標(biāo)本、2.5μlrt-pcrbuffer、3μl改良的leukemiaprimermix、1μlsolutiony3、1μl濃度為0.25ng/μl的kanrrna和0.5μlrt-pcrenzymemix2組成。(2)多重rt-pcr和gexp毛細(xì)管電泳同步驟2中(2)。由于dutp和udg酶的加入，使得擴(kuò)增效率在一定程度上受到影響。再次向下或向上設(shè)不同濃度梯度，找出合適的引物濃度。其中，col6a3和gng11分型基因在rt引物濃度調(diào)整至1000nm時(shí)，仍然峰高過低，故進(jìn)一步上調(diào)這兩個(gè)基因的正向引物濃度，至88.9nm時(shí)獲得理想峰高。nedd4分型基因引物濃度上調(diào)后仍不能獲得理想的信號峰，考慮該基因的擴(kuò)增可能受dutp和udg酶的影響較大，故剔除。綜合上述優(yōu)化條件，本發(fā)明提供了一步法多重rt-pcr反應(yīng)體系。該一步法多重rt-pcr反應(yīng)體系為10μl，由2μl模板、2.5μlrt-pcrbuffer、3μlleukemiaprimermix、1μlsolutiony3、1μl濃度為0.25ng/μl的kanrrna和0.5μlrt-pcrenzymemix2組成。56個(gè)分型基因(57對引物)、3個(gè)內(nèi)參基因和2個(gè)質(zhì)控基因的反向引物在該一步法多重rt-pcr反應(yīng)體系中的引物濃度如表5中第4列所示；56個(gè)分型基因(57對引物)、3個(gè)內(nèi)參基因和2個(gè)質(zhì)控基因的正向引物在一步法多重rt-pcr反應(yīng)體系中的引物濃度如表5中第5列所示。leukemiaprimermix由1體積份rtprimermix(由56個(gè)分型基因、3個(gè)內(nèi)參基因和2個(gè)質(zhì)控基因的反向引物混合而成)和1體積份pcrprimermix(由56個(gè)分型基因、3個(gè)內(nèi)參基因和2個(gè)質(zhì)控基因的正向引物混合，然后加入終濃度為1000拷貝數(shù)/μl的pcdna3.1(+)質(zhì)粒)混合而成。表5.rt-pcr多重反應(yīng)體系中的各基因的引物濃度三、制定標(biāo)準(zhǔn)曲線以步驟二配制的leukemiaprimermix做標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)。以步驟二中1制備的rna混合標(biāo)本為標(biāo)準(zhǔn)rna樣品，梯度分別設(shè)置為100ng/μl、50ng/μl、25ng/μl、12.5ng/μl、6.25ng/μl、3.125ng/μl和1.56ng/μl。分別做重復(fù)孔，確保結(jié)果的重復(fù)性及線性關(guān)系良好。配制一步法多重rt-pcr反應(yīng)體系。該一步法多重rt-pcr反應(yīng)體系為10μl，由2μl不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)rna樣品、2.5μlrt-pcrbuffer、3μlleukemiaprimermix、1μlsolutiony3、1μl濃度為0.25ng/μl的kanrrna和0.5μlrt-pcrenzymemix2組成。(2)多重rt-pcr和gexp毛細(xì)管電泳同步驟2中(2)。標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果可同時(shí)得到目標(biāo)基因與內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，縱坐標(biāo)為特定基因與反應(yīng)質(zhì)控基因(kanr)峰面積的比值(ratio)。四、gexp基因多重檢測1、一步法多重rt-pcr反應(yīng)以實(shí)施例一中提取的rna為模板，采用無dna/rna酶h2o稀釋至50ng/μl。在步驟二中配制的leukemiaprimermix的引導(dǎo)下，分別得到56個(gè)分型基因、3個(gè)內(nèi)參基因和2個(gè)質(zhì)控基因的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。反應(yīng)體系為10μl，由2μl模板、2.5μlrt-pcrbuffer、3μlleukemiaprimermix、1μlsolutiony3、1μl濃度為0.25ng/μl的kanrrna和0.5μlrt-pcrenzymemix2組成。多重rt-pcr反應(yīng)條件：105℃熱蓋處理；25℃5min；50℃30min；95℃預(yù)變性15min；94℃變性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸1min；4℃保存。2、gexp毛細(xì)管電泳gexp多重基因表達(dá)遺傳分析系統(tǒng)、sls、dss400、石蠟油、分離緩沖液、樣品板及緩沖液板均為美國beckmancoulter公司的產(chǎn)品。(1)制備上樣緩沖液(sampleloadingsolution，sls)和分子量內(nèi)標(biāo)(dnasizestandard-400，dss400)混合液：將32μlsls和0.25μldss400用槍頭混勻10次備用。(2)在每個(gè)樣本孔中加入約32μlsls和dss400混合液，再將步驟1中得到的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物1μl加至樣品板，加入一滴石蠟油覆蓋樣品。(3)另取緩沖液板，在與樣品板對應(yīng)的孔內(nèi)加入3/4體積的分離緩沖液。(4)進(jìn)入genomelabgexp多重基因表達(dá)遺傳分析系統(tǒng)的setup程序，輸入樣品名，對每個(gè)樣本指定freg-3分離方法，指定默認(rèn)的gexp分析方法，開始運(yùn)行毛細(xì)管電泳程序。(5)將gexp原始數(shù)據(jù)(.cqs文件)導(dǎo)出，將步驟三中繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線及gexp原始數(shù)據(jù)(.cqs文件)導(dǎo)入急性淋巴細(xì)胞白血病基因表達(dá)分析軟件((v2.0)，2016sr030652，寧波海爾施基因科技有限公司的產(chǎn)品)，計(jì)算每個(gè)目的基因與內(nèi)參基因峰面積(peakarea)的比值，最終得到219例初診all患兒56個(gè)分型基因相對表達(dá)量(每個(gè)目的基因與內(nèi)參基因的比值)。五、生物信息學(xué)分析完成步驟四后，利用隨機(jī)抽樣方法將219例樣本隨機(jī)分為2組，其中111例作為訓(xùn)練集，其余108例作為測試集。利用‘e1071’r程序包(http://www.r-project.org/)和10倍交叉驗(yàn)證策略對111例訓(xùn)練集樣本進(jìn)行訓(xùn)練，構(gòu)建supportvectormachine(svm)分類器，平均準(zhǔn)確度98.30％(見表6)。表6.在111例訓(xùn)練樣本中交叉驗(yàn)證56個(gè)分型基因-gexp分類器all分型tpfptnfn準(zhǔn)確度敏感性特異性bcr-abl12.92.110600.98108110.980631e2a-pbx15.90.110500.99909910.999057hyperdiploid36071.13.90.9648650.9038981mll2.50.510800.99549510.995413others21.53.583.92.10.949550.9137480.96021t-all801030111tel-aml127.60.482.40.60.9909910.9789410.995195注：平均準(zhǔn)確度＝98.30％；tp表示真陽性；fp表示假陽性；tn表示真陰性；fn表示假陰性；準(zhǔn)確度＝(tp+tn)/(tp+fn+tn+fp)；敏感性＝tp/(tp+fn)；特異性＝tn/(tn+fp)。采用該svm分類器預(yù)測108例測試集的樣本。分析結(jié)果顯示(表7)：該分類器預(yù)測兒童all完全獨(dú)立樣本常見7種亞型的平均準(zhǔn)確度為94.84％。表7.采用56個(gè)分型基因-gexp分類器預(yù)測108例測試集樣本all分型tpfptnfn準(zhǔn)確度敏感性特異性bcr-abl10410400.962963na0.962963e2a-pbx13.62.410200.97777810.977051hyperdiploid33.41.66580.9111110.8098010.976458mll0210600.981481na0.981481others18.26.872.910.10.8435190.6469080.915016t-all7.10.910000.99166710.991128tel-aml126.21.878.61.40.9703700.9503330.977696注：平均準(zhǔn)確度＝94.84％；tp表示真陽性；fp表示假陽性；tn表示真陰性；fn表示假陰性；準(zhǔn)確度＝(tp+tn)/(tp+fn+tn+fp)；敏感性＝tp/(tp+fn)；特異性＝tn/(tn+fp)。上述結(jié)果表明，采用本發(fā)明提供的rt-pcr一步法取代逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增的兩步法，不僅使得操作更加簡便、污染的可能性減小(rt和pcr反應(yīng)之間無需開管)、靈敏度提高(cdna產(chǎn)物全部經(jīng)pcr擴(kuò)增)，而且采用dutp/udg技術(shù)防污染，使得實(shí)驗(yàn)體系更加穩(wěn)定，準(zhǔn)確性和特異性大大提高。所謂dutp/udg技術(shù)就是將普通反應(yīng)體系中的dttp部分用dutp替代，再加入udg酶。在反應(yīng)過程中，由于dttp被部分替換成dutp，因此pcr擴(kuò)增產(chǎn)物dna片段中均含有dutp。下次擴(kuò)增時(shí)，若反應(yīng)體系被含有dutp的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物dna污染，則在dutp/udg反應(yīng)系統(tǒng)中通過在25℃下，udg酶選擇性地將含有dutp的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物dna磷酸骨架上的dutp降解下來而對正常胸腺嘧啶或尿嘧啶的模板dna或rna無破壞作用。由于udg酶不耐熱，在50℃下會(huì)熱變性失活，不影響新擴(kuò)增的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。這樣既防止了含有dutp的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物污染,又不妨礙目的基因的擴(kuò)增，提高了擴(kuò)增的準(zhǔn)確性和特異性。<110>首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院哈爾濱工業(yè)大學(xué)寧波海爾施基因科技有限公司<120>兒童急性淋巴細(xì)胞白血病基因分型的試劑盒<160>127<170>patentinversion3.5<210>1<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>1aggtgacactatagaatatctccctgttggtgatttgt38<210>2<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>2aggtgacactatagaatagaactgacttggcaggagat38<210>3<211>36<212>dna<213>人工序列<220><223><400>3aggtgacactatagaatacgctgcacaagttcctgg36<210>4<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>4aggtgacactatagaatactgagactccattttgctgc38<210>5<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223><400>5aggtgacactatagaatagagcacaatgaagcaagaaca39<210>6<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223><400>6aggtgacactatagaatagtgaaaattcctggcgagaag39<210>7<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>7aggtgacactatagaataacaactcagtggagcattca38<210>8<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>8aggtgacactatagaataacgtgcagctaacaaaatgg38<210>9<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>9aggtgacactatagaatatccaccgtaaagaaaatgcg38<210>10<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>10aggtgacactatagaatacaaaggccaaagccaagaaa38<210>11<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>11aggtgacactatagaatactctttgcatccggagagtg38<210>12<211>37<212>dna<213>人工序列<220><223><400>12aggtgacactatagaataaaatccagaccctagcacg37<210>13<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>13aggtgacactatagaatagacggctgcaatcaatgaaa38<210>14<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>14aggtgacactatagaatacagttaattggcatgctgct38<210>15<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>15aggtgacactatagaataggcaaaatcagcagggaaac38<210>16<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>16aggtgacactatagaataaggaggaaaagtgaaccgac38<210>17<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>17aggtgacactatagaatacgtccaacaggtcatctctg38<210>18<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>18aggtgacactatagaataattgaagctgctaaccttgc38<210>19<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>19aggtgacactatagaataaggagtccattctgagccga38<210>20<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223><400>20aggtgacactatagaataagtgaagttgcagagacaaca39<210>21<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223><400>21gtacgactcactatagggaccagtttccgactccttttg39<210>22<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223><400>22gtacgactcactatagggagtggtggaggtccaaggtat39<210>23<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223><400>23gtacgactcactatagggacggtgcacaaagttcttctc39<210>24<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223><400>24gtacgactcactatagggactcctcttcatgtcaggcaa39<210>25<211>40<212>dna<213>人工序列<220><223><400>25gtacgactcactatagggaaagagggcctttttccattca40<210>26<211>40<212>dna<213>人工序列<220><223><400>26gtacgactcactatagggaataaggctgtttgagggatgc40<210>27<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223><400>27gtacgactcactatagggactttgctctcgcaggagatt39<210>28<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223><400>28gtacgactcactatagggaaaggaacctcccaattcact39<210>29<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223><400>29gtacgactcactatagggatcaaggggatctcttctgtg39<210>30<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223><400>30gtacgactcactatagggaagctaacgagcagacagaag39<210>31<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223><400>31gtacgactcactatagggagcccactgataaggcaatga39<210>32<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>32gtacgactcactatagggagtgggagttacaccatgcc38<210>33<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223><400>33gtacgactcactatagggacctgctctctatgatgcact39<210>34<211>41<212>dna<213>人工序列<220><223><400>34gtacgactcactatagggaatgtactgtgctctaacattct41<210>35<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223><400>35gtacgactcactatagggactcagcactccaagaacctg39<210>36<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223><400>36gtacgactcactatagggacttctcacctgctggttctt39<210>37<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223><400>37gtacgactcactatagggagtcaaccagcctctctatga39<210>38<211>40<212>dna<213>人工序列<220><223><400>38gtacgactcactatagggaattgtttccagacattgctcg40<210>39<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223><400>39gtacgactcactatagggattcctgttgcagggtcgtaa39<210>40<211>40<212>dna<213>人工序列<220><223><400>40gtacgactcactatagggaagcatgttggttttatctggg40<210>41<211>40<212>dna<213>人工序列<220><223><400>41aggtgacactatagaatattttcacactggccttaaagag40<210>42<211>34<212>dna<213>人工序列<220><223><400>42aggtgacactatagaatatcggctccctgcgtta34<210>43<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>43aggtgacactatagaatatttcacagcccacatctctc38<210>44<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>44aggtgacactatagaataacgtgaccactggacagtta38<210>45<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>45aggtgacactatagaataactcagtggagcattcagat38<210>46<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223><400>46aggtgacactatagaatacccatccaagtggaatgtatg39<210>47<211>37<212>dna<213>人工序列<220><223><400>47aggtgacactatagaataatgccggctcagagaatac37<210>48<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>48aggtgacactatagaatacctacttcttggtcagtgcc38<210>49<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223><400>49aggtgacactatagaataggagaagaaactcaagagagc39<210>50<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>50aggtgacactatagaataggcagtgtcaatgagaacct38<210>51<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>51aggtgacactatagaatagataaagcgatcacacccca38<210>52<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>52aggtgacactatagaataacgcggatcgagtttgataa38<210>53<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223><400>53aggtgacactatagaatacagtaagccacccactagaca39<210>54<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>54aggtgacactatagaataagatcattaccatgcgcagc38<210>55<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>55aggtgacactatagaatacgcagagaggggaatgaaaa38<210>56<211>40<212>dna<213>人工序列<220><223><400>56aggtgacactatagaatagtcttctacaaatgcttctggg40<210>57<211>41<212>dna<213>人工序列<220><223><400>57aggtgacactatagaataagccacaatcactcatcagagta41<210>58<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>58aggtgacactatagaataaccggatatttggtttgcca38<210>59<211>36<212>dna<213>人工序列<220><223><400>59gtacgactcactatagggagcccccgtaatggggta36<210>60<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223><400>60gtacgactcactatagggaaacacgctgaggttgtctac39<210>61<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223><400>61gtacgactcactatagggagaccatgtttggttgattgc39<210>62<211>44<212>dna<213>人工序列<220><223><400>62gtacgactcactatagggaaatatcatggaccatcttttgaagc44<210>63<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223><400>63gtacgactcactatagggactctcgcaggagattcatca39<210>64<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223><400>64gtacgactcactatagggaaagcccatcctaggtactga39<210>65<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>65gtacgactcactatagggaagagctgggtgtatgtgct38<210>66<211>42<212>dna<213>人工序列<220><223><400>66gtacgactcactatagggagttgggtcttcaagatcagatac42<210>67<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223><400>67gtacgactcactatagggattcagggccatcttgtactc39<210>68<211>41<212>dna<213>人工序列<220><223><400>68gtacgactcactatagggactcacacaccctattttcaagg41<210>69<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223><400>69gtacgactcactatagggacagcagcagcattcattttc39<210>70<211>40<212>dna<213>人工序列<220><223><400>70gtacgactcactatagggacaaagatgtctcgggattcct40<210>71<211>43<212>dna<213>人工序列<220><223><400>71gtacgactcactatagggaagccagtaccaataagttaacgtc43<210>72<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223><400>72gtacgactcactatagggacttgcccacttcaaatcgac39<210>73<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223><400>73gtacgactcactatagggagatctttcgcagctggatca39<210>74<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223><400>74gtacgactcactatagggagtctctgctcactactctcc39<210>75<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223><400>75gtacgactcactatagggagggcatgggaatgggagttc39<210>76<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223><400>76gtacgactcactatagggaggaactcatggcttaggagg39<210>77<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>77aggtgacactatagaatacccctttggtttgacatcac38<210>78<211>42<212>dna<213>人工序列<220><223><400>78aggtgacactatagaatacagaactagagtgaaaactacagg42<210>79<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>79aggtgacactatagaataggcaactctgatcccaactc38<210>80<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>80aggtgacactatagaatatgcacatgttccagtcttct38<210>81<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>81aggtgacactatagaatagacatcatcatcaaggcgct38<210>82<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>82aggtgacactatagaatagaagcttctgaaccatccac38<210>83<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>83aggtgacactatagaatagttaccaatgacaacgcctc38<210>84<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>84aggtgacactatagaataaatttggcagaactagcaga38<210>85<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223><400>85aggtgacactatagaatatctgatgcccctcaatacttc39<210>86<211>37<212>dna<213>人工序列<220><223><400>86aggtgacactatagaatatgactggcaacagtcggat37<210>87<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>87aggtgacactatagaatagtttcccctcttggatctgt38<210>88<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223><400>88aggtgacactatagaatacttcactgaaaagagacctca39<210>89<211>36<212>dna<213>人工序列<220><223><400>89aggtgacactatagaatagctctgtagctgagtggg36<210>90<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>90aggtgacactatagaatagtgttggctttgctaggatg38<210>91<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223><400>91aggtgacactatagaatacctacaggtacccaggcttta39<210>92<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>92aggtgacactatagaataaaagaggaagcagaagcaga38<210>93<211>40<212>dna<213>人工序列<220><223><400>93aggtgacactatagaatacagctatctcaacagcttcttc40<210>94<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223><400>94aggtgacactatagaataaaaaattaaacaccgccctga39<210>95<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>95aggtgacactatagaataaaccatttgcttttctgggg38<210>96<211>40<212>dna<213>人工序列<220><223><400>96gtacgactcactatagggagttctgcatcaagaggtttgg40<210>97<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223><400>97gtacgactcactatagggatgaatccacttcttccgctc39<210>98<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223><400>98gtacgactcactatagggacaggaggcatccagcaatta39<210>99<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223><400>99gtacgactcactatagggaactggtagccaaacatcagg39<210>100<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223><400>100gtacgactcactatagggaaaagttcctgtagaggtgcg39<210>101<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>101gtacgactcactatagggactcgttctcactcaggtgc38<210>102<211>40<212>dna<213>人工序列<220><223><400>102gtacgactcactatagggagctcaaacttgataggcttgg40<210>103<211>42<212>dna<213>人工序列<220><223><400>103gtacgactcactatagggacacattcttcagtcttgtttgga42<210>104<211>42<212>dna<213>人工序列<220><223><400>104gtacgactcactatagggaagatgccaaggttactaacatca42<210>105<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223><400>105gtacgactcactatagggatccacttggcagcgca35<210>106<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>106gtacgactcactatagggataccttcacgtggccattc38<210>107<211>41<212>dna<213>人工序列<220><223><400>107gtacgactcactatagggagcaatgaagaccatacagtaca41<210>108<211>44<212>dna<213>人工序列<220><223><400>108gtacgactcactatagggaagaagagtttggatatcagattcag44<210>109<211>40<212>dna<213>人工序列<220><223><400>109gtacgactcactatagggaatgccatggtcttccattagg40<210>110<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>110gtacgactcactatagggagagggatcttggcgttggt38<210>111<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223><400>111gtacgactcactatagggagatccacgtatgtctgaggt39<210>112<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223><400>112gtacgactcactatagggatttgttgaagcacaggtggc39<210>113<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>113gtacgactcactatagggaacagttgccgatgctttct38<210>114<211>40<212>dna<213>人工序列<220><223><400>114gtacgactcactatagggatgaggtgggatcagagatatt40<210>115<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>115aggtgacactatagaataccgtgtgaaccatgtgactt38<210>116<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>116aggtgacactatagaataggaagaccatgttggcaaag38<210>117<211>37<212>dna<213>人工序列<220><223><400>117aggtgacactatagaatagcttcgaggagcagtggta37<210>118<211>40<212>dna<213>人工序列<220><223><400>118gtacgactcactatagggaattcatccaatccaaatgcgg40<210>119<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223><400>119gtacgactcactatagggatgagcatcgaatctcttggt39<210>120<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223><400>120gtacgactcactatagggattcacccacacgatggcata39<210>121<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>121aggtgacactatagaatacagacaatcggctgctctga38<210>122<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>122aggtgacactatagaatacgggaaaacagcattccagg38<210>123<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>123gtacgactcactatagggagcttcagtgacaacgtcga38<210>124<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223><400>124gtacgactcactatagggagtgacgactgaatccggtga39<210>125<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>125aggtgacactatagaatagccagactcaccatttttgg38<210>126<211>40<212>dna<213>人工序列<220><223><400>126gtacgactcactatagggagatgaagtaggcaaaagcaca40<210>127<211>1200<212>rna<213>人工序列<220><223><400>127gaauacaagcuugggcgugucucaaaaucucugauguuacauugcacaagauaaaaauau60aucaucaugaacaauaaaacugucugcuuacauaaacaguaauacaagggguguuaugag120ccauauucaacgggaaacgucuugcucgaggccgcgauuaaauuccaacauggaugcuga180uuuauauggguauaaaugggcucgcgauaaugucgggcaaucaggugcgacaaucuaucg240auuguaugggaagcccgaugcgccagaguuguuucugaaacauggcaaagguagcguugc300caaugauguuacagaugagauggucagacuaaacuggcugacggaauuuaugccucuucc360gaccaucaagcauuuuauccguacuccugaugaugcaugguuacucaccacugcgauccc420cgggaaaacagcauuccagguauuagaagaauauccugagucaggugaaaauauuguuga480ugcgcuggcaguguuccugcgccgguugcauucgauuccuguuuguaauuguccuuuuaa540cagcgaucgcguauuucgucucgcucaggcgcaaucacgaaugaauaacgguuugguuga600ugcgagugauuuugaugacgagcguaauggcuggccuguugaacaagucuggaaagaaau660gcauaagcuuuugccauucucaccggauucagucgucacucauggugauuucucacuuga720uaaccuuauuuuugacgaggggaaauuaauagguuguauugauguuggacgagucggaau780cgcagaccgauaccaggaucuugccauccuauggaacugccucggugaguuuucuccuuc840auuacagaaacggcuuuuucaaaaauaugguauugauaauccugauaugaauaaauugca900guuucauuugaugcucgaugaguuuuucuaaucagaauugguuaauugguuguaacacug960gcagagcauuacgcugacuugacgggacggcggcuuuguugaauaaaucgaacuuuugcu1020gaguugaaggaucagaucacgcaucuucccgacaacgcagaccguuccguggcaaagcaa1080aaguucaaaaucaccaacugguccaccuacaacaaagcucucaucaaccguggcgacucu1140agaggauccccgggcgagcucccaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaccgaauu1200當(dāng)前第1頁12