本發(fā)明屬于煙草制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種三步法降解煙草薄片果膠含量的方法。
背景技術(shù)：
造紙法煙草薄片（paper-processreconstitutedtobacco）是一種煙草資源再生利用的產(chǎn)品。它是利用一些煙草廢棄料、邊角料，如煙梗、煙葉碎片、煙末等為原料，經(jīng)過浸提、濃縮、分離、打漿、磨漿、抄造、烘干、加香工藝過程，制成煙葉薄片，用作卷煙填充物。造紙法煙草薄片，不僅在改善煙葉產(chǎn)品結(jié)構(gòu)強(qiáng)度、燃燒性能及降低卷煙的煙氣煙堿和焦油量等方面具有優(yōu)勢，同時還能降低煙葉單耗，節(jié)約生產(chǎn)成本，可以說是煙草工業(yè)近年最重要的成果之一。而近年來，生物技術(shù)與造紙法煙草薄片技術(shù)在生產(chǎn)中的結(jié)合應(yīng)用，不僅發(fā)揮了造紙法煙草薄片的工藝優(yōu)勢，而且利用生物技術(shù)有選擇地改變煙草化學(xué)成分，明顯改善了煙草薄片的品質(zhì)。
果膠質(zhì)是煙草等植物細(xì)胞壁的構(gòu)成成分，是結(jié)構(gòu)復(fù)雜分子量大的復(fù)合糖類化合物。果膠在煙草中的含量約為5%-13%。煙草中果膠質(zhì)含量過高使得煙草燃燒不充分，分解成小分子甲醇、乙酸等使卷煙吸味刺激性大。果膠在煙葉醇化過程中也會產(chǎn)生多達(dá)1.2%-1.5%的乙酸，進(jìn)而使人嗆咳、灼燒喉嚨，并有辛辣的刺激性氣味，在燃燒分解時還能產(chǎn)生揮發(fā)性羰基物等有害物質(zhì)，對吸食健康不利。因此適當(dāng)降低煙葉果膠含量對于提升煙葉品質(zhì)、降低卷煙危害成分具有重要研究價值。
現(xiàn)有技術(shù)中，針對煙草薄片中果膠類物質(zhì)的降解主要是采用傳統(tǒng)的果膠酶進(jìn)行的。但是由于煙草薄片中果膠結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和多樣性，而現(xiàn)有技術(shù)中的果膠酶普遍存在對于煙草薄片中果膠降解針對性不強(qiáng)、降解不夠充分、降解過程難以控制的缺陷，因而急需探討新的果膠酶及其在煙草薄片加工中的應(yīng)用。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明目的在于通過提供一種利用特定菌株發(fā)酵制備的果膠酶，采用“三步法”將這種果膠酶應(yīng)用在煙草薄片加工過程中，進(jìn)而實現(xiàn)對一級和二級浸取液及混合漿中果膠的降解，從而降低煙草薄片果膠含量，最終改善煙草品質(zhì)。
本發(fā)明的技術(shù)方案具體如下所述。
一種利用華根霉發(fā)酵制備的果膠酶，通過如下生產(chǎn)步驟制備獲得：
（1）菌種活化，從保藏培養(yǎng)基上挑取發(fā)酵菌株，接種到活化培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)2~3d左右；
所述發(fā)酵菌株具體為黑龍江省輕工科學(xué)研究院在中國工業(yè)微生物菌種保藏中心保藏的保藏號為cicc41051的華根霉（rhizopuschinensis），該菌株為可公開獲得菌株；
所述活化培養(yǎng)基為pda培養(yǎng)基；從保藏培養(yǎng)基挑取菌株后接種活化培養(yǎng)基時具體可采用劃線法接種；
所述pda培養(yǎng)基按常規(guī)方法制備，具體為：馬鈴薯提取液1.0l（200g馬鈴薯），葡萄糖20.0g，瓊脂15.0g，ph自然；
（2）制備種子液，將步驟（1）中活化后的菌種接種到種子培養(yǎng)基中，24~28℃、120~180rmin搖床培養(yǎng)36~48h左右（優(yōu)選，25℃、160r/min培養(yǎng)48h），制備種子液；
所述種子培養(yǎng)基配方為：果膠3g/l，酵母粉15g/l，nano33.0g，mgso4?7h2o0.5g，kcl0.5g，feso4?4h2o0.01g，k2hpo41.0g，蒸餾水1.0l，ph=6.0～6.5；
（3）發(fā)酵培養(yǎng)，將步驟（2）中所制備的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，24~28℃、120~180rmin搖床培養(yǎng)3~16h以進(jìn)一步發(fā)酵培養(yǎng)（優(yōu)選，25℃、160r/min搖床培養(yǎng)10h左右）；
將種子液接種發(fā)酵培養(yǎng)基時，接種量具體可按4%體積分?jǐn)?shù)比例進(jìn)行接種；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：果膠23.18~56.82g/l、酵母粉0.98~6.02g/l，ph=5~6（優(yōu)選配方為：果膠50g/l、酵母粉3.0g/l，ph=6）；
（4）制備粗酶液，將步驟（3）中發(fā)酵液經(jīng)抽濾濾去菌體，再經(jīng)超濾濃縮即可獲得粗酶液，測定酶活后即可作為果膠酶進(jìn)行應(yīng)用。
所述華根霉發(fā)酵制備的果膠酶在煙草中的應(yīng)用，用于煙草薄片加工過程，用于降解煙草薄片原料中果膠。
具體使用時，以上述步驟（4）所制備粗酶液直接應(yīng)用為例，將果膠酶粗酶液稀釋0~50倍后，用于煙草薄片加工過程時，將其用于一級浸取液、二級浸取液和混合漿中的任意一個或幾個；
用于一級浸取液時，一級浸取液以干重計，一級浸取液：果膠酶粗酶液=1g：1~10ml的比例，將一級浸取液與果膠酶粗酶液溶液混合均勻，45~55℃、酶解2~4h；
用于二級浸取液時，二級浸取液以干重計，二級浸取液：果膠粗酶液=1g：1~10ml的比例，將二級浸取液與果膠酶粗酶液溶液混合均勻，45~55℃、酶解2~4h；
用于混合漿時，混合漿以干重計，混合漿：果膠酶粗酶液=1g：1~10ml的比例，將混合漿與果膠酶粗酶液溶液混合均勻，45~55℃，酶解2~4h。
優(yōu)選處理工藝條件為，將果膠酶粗酶液稀釋20倍后，
用于一級浸取液時，一級浸取液以干重計，一級浸取液：果膠酶粗酶液=1g：6ml的比例，將一級浸取液與果膠酶粗酶液溶液混合均勻，55℃、酶解4h；
用于二級浸取液時，二級浸取液以干重計，二級浸取液：果膠粗酶液=1g：4ml的比例，將二級浸取液與果膠酶粗酶液溶液混合均勻，55℃、酶解4h；
用于混合漿時，混合漿以干重計，混合漿：果膠酶粗酶液=1g：3ml的比例，將混合漿與果膠酶粗酶液溶液混合均勻，55℃，酶解3h。
一種三步法降解煙草薄片果膠含量的方法，具體包括如下步驟：
（1）制備粗酶液，即按照上述步驟（1）至步驟（4）制備粗酶液；稀釋0~50倍后備用，
（2）按現(xiàn)有工藝制備煙草薄片，在煙草薄片制備工藝的一級浸取液、二級浸取液和混合漿中的任意一個或幾個過程中應(yīng)用步驟（1）中所制備粗酶液，優(yōu)選處理工藝為：一級浸取液、二級浸取液和混合漿中均應(yīng)有步驟（1）中所制備粗酶液；
用于一級浸取液時，一級浸取液以干重計，一級浸取液：果膠酶粗酶液=1g：1~10ml的比例，將一級浸取液與果膠酶粗酶液溶液混合均勻，45~55℃、酶解2~4h；
用于二級浸取液時，二級浸取液以干重計，二級浸取液：果膠粗酶液=1g：1~10ml的比例，將二級浸取液與果膠酶粗酶液溶液混合均勻，45~55℃、酶解2~4h；
用于混合漿時，混合漿以干重計，混合漿：果膠酶粗酶液=1g：1~10ml的比例，將混合漿與果膠酶粗酶液溶液混合均勻，45~55℃，酶解2~4h。
本發(fā)明的總體技術(shù)路線是：將特定菌種首先進(jìn)行發(fā)酵，通過篩選優(yōu)化最佳發(fā)酵條件，獲得最高果膠酶酶活的粗酶液，然后將粗酶液采用“三步法”直接用于煙草薄片生產(chǎn)過程，以降低薄片產(chǎn)品的果膠含量，進(jìn)一步通過優(yōu)化處理工藝，獲得最佳降解效果，從而改善煙草品質(zhì)。
初步試驗表明，本發(fā)明采用特定菌種發(fā)酵所得粗酶液的酶活最高可達(dá)2986.87u/ml，具有較好的應(yīng)用潛力。進(jìn)一步用于煙草薄片原料處理后，最終可降低煙草薄片中果膠含量。將處理后煙草薄片用于卷煙后，進(jìn)一步的感官抽吸評價表明，添加有酶解后煙草薄片的卷煙樣品相較于未處理的樣品，卷煙煙氣更加細(xì)膩，甜潤感有所增強(qiáng)且刺激性減輕，香氣量增加，雜味減少，勁頭足，且燃燒性更好，從而較好的改善了煙草的吸食品質(zhì)。
需要解釋的是，本申請中所述“三步法”是指對煙草薄片加工工藝中煙草原料的浸取液的不同處理階段進(jìn)行酶解處理，通過在不同工藝階段分別加入發(fā)酵制備的果膠酶，從而降低最終煙草薄片成品的果膠含量。因而總體而言，本申請與現(xiàn)有煙草薄片加工工藝結(jié)合較為緊密，可直接配合現(xiàn)有煙草薄片加工工藝使用，由于不需額外改動生產(chǎn)工藝，具有較好的適用性，結(jié)合其改進(jìn)效果而言，具有一定的推廣應(yīng)用價值。
附圖說明
圖1為煙草薄片加工工藝流程示意圖。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的解釋說明。在介紹具體實施例前，就下述實施例中果膠含量測定、果膠降解率的計算方法簡要介紹如下。
果膠含量測定
下述實施例中對于煙草薄片中的果膠含量采用咔唑比色法測定，具體測定步驟如下：
1、樣品預(yù)處理，取待測樣品（酶解處理后或未處理樣品），量取10ml或10g（精確到0.001g）樣品于250ml錐形瓶中，加入150ml加熱至沸騰的0.05mol/l的hcl溶液，裝上冷凝器，于90℃水浴中加熱回流1h，冷卻后把濾液移入250ml容量瓶中，加入2mol/l的naoh中和至ph=4，搖勻，收集濾液即得總果膠提取液，備用；
2、以半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品，咔唑比色法測定果膠含量，取步驟a中所得總果膠提取液1ml于含有6ml濃硫酸的試管中，搖勻；
85℃水浴加熱15min；冷卻，加入0.15%咔唑無水乙醇溶液0.3ml，搖勻，暗置30min；530nm下測吸光度；
3、根據(jù)咔唑比色法標(biāo)準(zhǔn)曲線和公式，求得待測液果膠含量；
所述公式為：果膠（%）=c×v×k×100/(w×106)；
其中，c：對照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的果膠提取稀釋液的果膠含量（μg/ml)，v：果膠提取液原液體積（ml），k：果膠提取液稀釋倍數(shù)，w：樣品質(zhì)量（g），106：質(zhì)量單位換算系數(shù)；
所述咔唑比色法標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法為：
首先準(zhǔn)確稱取0.1000g半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品于燒杯中，用少量蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，用ph為3的鹽酸定容；
然后分別取0、1、2、3、4、5、6、7ml于8個100容量瓶中，用ph為3的hcl定容，得到濃度為0、10、20、30、40、50、60、70μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液；
最后以上述方法測定，然后繪制咔唑比色法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
果膠降解率計算
下述實施例中果膠降解率按以下公式計算：
ei=[（c0－ci）/c0]×100%；
其中，ei：果膠的降解率，c0：空白對照樣中果膠水解生成的半乳糖醛酸的量；ci：酶處理的煙草薄片中果膠水解生成的半乳糖醛酸的量；空白對照樣和酶處理的煙草薄片中果膠含量測定均按上述咔唑比色法進(jìn)行測定。
酶活力檢測方法：參照miller(1959)方法。取0.4mll%果膠溶液于試管中，加入1.0mlph=5的0.04mol/lna2hpo4-0.02mol/l檸檬酸緩沖液，45℃水浴平衡5min；加入0.1ml適當(dāng)稀釋的酶液，45℃反應(yīng)30min（空白對照組以煮沸失活的酶液代替），加入3.0mldns溶液終止反應(yīng)，沸水浴5min，冷卻，定容至15ml，于分光光度計540nm波長下測吸光度，得到反應(yīng)體系中半乳糖醛酸的量；
酶活力單位：1ml酶液或1g酶在45℃、ph5.0的條件下，每min分解底物產(chǎn)生lμg半乳糖醛酸的酶量定義為1單位聚半乳糖醛酸酶(pg)酶活；以u/ml表示；
酶活力計算公式：u=(c實驗-c對照)*n*1000*(v總/v酶)/t；
其中：n—酶液稀釋倍數(shù)，v總—反應(yīng)總體積，v酶—酶液體積，t—反應(yīng)時間（min）；
dns法標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：
配置1mg/ml的半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液；取1mg/ml半乳糖醛酸溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml于試管中，補(bǔ)水至1ml，加dns試劑3ml，混合后于沸水中煮7min，冷卻后定容至15ml，于分光光度計540nm波長下測吸光度；以吸光度為縱坐標(biāo)，半乳糖醛酸量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
實施例1
本實施例所提供的利用華根霉發(fā)酵所制備的果膠酶，通過如下生產(chǎn)步驟制備獲得。
（1）菌種活化，從保藏培養(yǎng)基上挑取發(fā)酵菌株，接種到活化培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)3d左右；
所述發(fā)酵菌株具體為黑龍江省輕工科學(xué)研究院(l188)中科院微生物所在中國工業(yè)微生物菌種保藏中心(cicc)保藏的保藏號為cicc41051的華根霉，本實施例中所用菌株從保藏單位購買獲得；
所述活化培養(yǎng)基為pda培養(yǎng)基；從保藏培養(yǎng)基挑取菌株后接種活化培養(yǎng)基時具體采用劃線法接種；
所述pda培養(yǎng)基按常規(guī)方法制備，具體為：馬鈴薯提取液1.0l，葡萄糖20.0g，瓊脂15.0g，ph自然；
所述馬鈴薯提取液制備方法為：取去皮馬鈴薯200g，切成小塊，加水1.0l煮沸30min，濾去馬鈴薯塊，將濾液補(bǔ)足至1.0l，121℃滅菌即可。
（2）制備種子液，將步驟（1）中活化后的菌種接種到種子培養(yǎng)基中，25℃、160r/min搖床培養(yǎng)48h，制備種子液；
所述種子培養(yǎng)基配方為：果膠3g/l，酵母粉15g/l，nano33.0g，mgso4?7h2o0.5g，kcl0.5g，feso4?4h2o0.01g，k2hpo41.0g，蒸餾水1.0l，ph=6.0；
具體裝液量為：100/250ml錐形瓶。
從活化培養(yǎng)基中挑取菌株時，具體按如下方法進(jìn)行：
用打孔器在活化培養(yǎng)基平板上靠近菌株生長邊緣的位置取兩塊0.5cm2的、長滿新生菌絲的接種塊，再接種于種子培養(yǎng)基中；
還需解釋的是，在搖床發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后后，可加入滅菌的磁珠和適量的玻璃珠，使用磁力攪拌器攪拌1h，以使將培養(yǎng)物打碎，便于作為種子液接種用于進(jìn)一步發(fā)酵培養(yǎng)擴(kuò)增使用。
（3）發(fā)酵培養(yǎng)，將步驟（2）中所制備的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，25℃、160r/min搖床培養(yǎng)10h以進(jìn)一步發(fā)酵培養(yǎng)；
將種子液接種發(fā)酵培養(yǎng)基時，接種量具體按4%體積分?jǐn)?shù)比例進(jìn)行接種；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：果膠50g/l、酵母粉3.0g/l，ph=6。
（4）制備粗酶液，將步驟（3）中發(fā)酵液經(jīng)抽濾濾去菌體，再經(jīng)超濾濃縮即可獲得粗酶液，測定酶活后即可作為果膠酶進(jìn)行應(yīng)用，其酶活為2986.87u/ml。
實施例2
將實施例1所制備粗酶液采用“三步法”分別作用于河南中煙煙草薄片工藝生產(chǎn)線上的一級浸取液、二級浸取液和混合漿三個位置（生產(chǎn)工藝流程圖如圖1所示），用于降解浸取液和混合漿中的果膠，具體使用方法為：
將實施例1中所制備果膠酶粗酶液（酶活為2986.87u/ml，理論而言，實施例1中所制備任意酶活的粗酶液均可用于降解果膠應(yīng)用，但為確定較好降解條件及對煙草實際改善效果，因而僅以實施例1所制備的酶活為2986.87u/ml的粗酶液為例進(jìn)行實驗）進(jìn)行適當(dāng)稀釋，然后將稀釋后粗酶液根據(jù)不同體積比（浸取液、混合漿(干重g)與粗酶液體積(ml)之比）設(shè)計，45℃~55℃條件下，酶解2~4h；
酶解結(jié)束后，將粗酶液中的果膠酶進(jìn)行失活處理，待進(jìn)一步制成成品煙草薄片后進(jìn)而測定樣品中的果膠含量。
同樣操作條件下，加入失活酶液（將粗酶液煮沸失活）作為對照組，最終計算果膠降解率。
一級浸取液酶解效果
實驗過程中，為獲得一級浸取液內(nèi)果膠最佳的降解率，發(fā)明人采用正交試驗設(shè)計的方法，選用l9(34)正交表對果膠降解條件（粗酶液稀釋倍數(shù)、體積比、酶解溫度、酶解時間）進(jìn)行了優(yōu)化試驗設(shè)計。
具體正交實驗因素水平設(shè)計如下：
不同酶解條件下對一級浸取液中果膠降解情況進(jìn)行測定，具體測定結(jié)果如下所示：
從上述實驗結(jié)果可以看出，將粗酶液稀釋20倍、料液比1:6、反應(yīng)溫度55℃、處理時間4小時，在此條件下煙草薄片生產(chǎn)過程中果膠降解率達(dá)到最大，可將煙草薄片所含的果膠量由2.50%降低到1.60%，降解率達(dá)到36.00%。
二級浸取液和混合漿酶解參數(shù)
采用上述類似正交實驗設(shè)計，分別對二級浸取液和混合漿的酶解工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明：
用于二級浸取液時，最佳工藝參數(shù)為：二級浸取液以干重計（所述干重為將浸取液在低溫狀態(tài)烘至無液體揮發(fā)即可），二級浸取液：果膠粗酶液=1g：4ml的比例，將二級浸取液與果膠酶粗酶液溶液混合均勻，55℃、酶解4h；
用于混合漿時，最佳工藝參數(shù)為：混合漿以干重計，混合漿：果膠酶粗酶液=1g：3ml的比例，將混合漿與果膠酶粗酶液溶液混合均勻，55℃，酶解3h。
測定及計算結(jié)果表明，分別用于二級浸取液、混合漿時，降解率可達(dá)41.3%和49.8%。
為進(jìn)一步檢測酶解處理后煙草薄片對于煙草吸食效果的改進(jìn)程度，以上述最佳酶解處理條件處理后煙草薄片（一級浸取液、二級浸取液和混合漿均一最佳工藝參數(shù)進(jìn)行果膠降解）為例，發(fā)明人對其進(jìn)行了實際卷煙抽吸實驗，相關(guān)實驗過程簡要介紹如下。
將最佳酶解條件處理后煙草薄片在80℃條件下進(jìn)行適當(dāng)烘干（至濕度65%）后，切絲，然后置于恒溫恒濕箱內(nèi)平衡（相對濕度(60±5)%，溫度(22±2)℃）48h；
按煙絲重量15%（即稱取0.12g樣品）與平衡后85%的許昌b2f均勻混合后按現(xiàn)有技術(shù)制備抽吸用卷煙，此即為試驗組卷煙。
相同條件及相同方法下采用滅活酶處理的煙草薄片所制備的卷煙記為對照組，以蒸餾水處理的煙草薄片所制備的卷煙組記為空白組。
將各組卷煙樣品（每支煙只總重0.80±0.01g）在溫度(22±2)℃、相對濕度(60±5)%的恒溫恒濕箱中平衡24h后，依據(jù)國家現(xiàn)行成品煙評析標(biāo)準(zhǔn)gb5606.4-2005對卷煙進(jìn)行質(zhì)量評吸鑒定和評價。
具體評價結(jié)果如下表所示：
從上述評價結(jié)果可以看出，酶解處理后的煙草薄片添加與卷煙后，可使卷煙的香氣更加細(xì)膩，煙氣透發(fā)性更好，同時能夠增加甜潤感且減輕刺激性，口感發(fā)澀程度減小，余味純凈舒適，勁頭足，且燃燒性更好，卷煙的吸食品質(zhì)得到了較好改善。