本發(fā)明涉及一種新型米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶的生產(chǎn)方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

蛋白酶(protease，ec3.4)是一類催化蛋白質(zhì)水解生成多肽和氨基酸的酶，在生物體中發(fā)揮著不同的生理功能。蛋白酶來源豐富，廣泛存在于動(dòng)植物及微生物中。通過天然篩選和基因工程等手段獲得的蛋白酶具有不同的特性，已應(yīng)用于食品、制革、飼料和洗滌等多個(gè)領(lǐng)域。

天冬氨酸蛋白酶是具有重要工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的一類蛋白酶，在奶酪制造、調(diào)味料生產(chǎn)、酪蛋白水解物制備、肉類嫩化及多肽制備等中都有應(yīng)用。大多數(shù)天冬氨酸蛋白酶在酸性ph條件下表現(xiàn)出較高活性，又被稱為酸性蛋白酶。已報(bào)道的產(chǎn)酸性蛋白酶的菌株主要有曲霉屬的黑曲霉、米曲霉和泡盛曲霉等。根毛霉屬和毛霉屬也是產(chǎn)酸性蛋白酶的優(yōu)良菌株，已被廣泛應(yīng)用于商業(yè)凝乳酶制劑的制備。目前，國內(nèi)研究較多的是米黑毛霉所產(chǎn)的凝乳酶，經(jīng)紫外誘變后的米黑毛霉所產(chǎn)的凝乳酶活力達(dá)到2703su/ml(李學(xué)朋,關(guān)明玲,馮瑞章等.產(chǎn)凝乳酶米黑毛霉的誘變育種研究.食品工業(yè)科技,2015,36:137-141)。李學(xué)朋等人優(yōu)化了米黑毛霉產(chǎn)凝乳酶的固體發(fā)酵條件，產(chǎn)酶活力最高達(dá)3649su/ml(李學(xué)朋,師希雄,馮瑞章等.米黑毛霉產(chǎn)凝乳酶固體發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化.食品工業(yè)科技,2014,7:130-134)。此外，米黑毛霉一個(gè)天冬氨酸蛋白酶基因已在卷枝毛霉中成功表達(dá)(dickinsonl.,harboem.,heeswijckr.v.,stromanp.,jepsenl.p.expressionofactivemucormieheiasparticproteaseinmucorcircinelloides.carlsbergresearchcommunicaions,1987,52,243-252)。有專利報(bào)道利用米黑毛霉生產(chǎn)凝乳酶方法(專利號為201310472404.6，申請日期2013.10.11)，采用米黑毛霉atcc16457發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶，添加硫酸鹽和還原糖發(fā)酵時(shí)酶活力最高為410imcu/ml。

米黑根毛霉是工業(yè)生產(chǎn)蛋白酶和脂肪酶的重要菌株，其產(chǎn)生的天冬氨酸蛋白酶應(yīng)用十分廣泛。自1997年米黑根毛霉一個(gè)凝乳酶被純化以來，其凝乳酶相關(guān)特性得到了一系列研究，但其蛋白酶活性較低(preethas.,boopathyr.purificationandcharacterizationofamilkclottingproteasefromrhizomucormiehei.worldjournalofmicrobiologyandbiotechnology,1997,13,573-578)。近年來，米黑根毛霉蛋白酶的研究主要集中在高壓均質(zhì)和熱處理對其凝乳酶和蛋白酶活性等的影響方面(ricardob.,tribsta.a.l.,&cristianinim.comparativeeffectsofhighisostaticpressureandthermalprocessingontheinactivationofrhizomucormieheiprotease.lwt-foodscienceandtechnology,2016,65:1050～1053)，也有將米黑根毛霉蛋白酶與駱駝凝乳酶復(fù)合應(yīng)用于奶酪方面的報(bào)道(soltanim.,borano.s.,&hayaloglua.a.effectofvariousblendsofcamelchymosinandmicrobialrennet(rhizomucormiehei)onmicrostructureandrheologyicalpropertyesofiranianufwhitecheese.lwt-foodscienceandtechnology,2016,68:724-728)。國內(nèi)專利報(bào)道僅有米黑根毛霉天然菌株及其在制備β-葡聚糖酶和凝乳酶中的應(yīng)用(專利號為201110312302.9，申請日期2011.10.14)，在以黃豆粉為氮源時(shí)其固體發(fā)酵粗酶液的凝乳酶活力最高達(dá)到85714u/g干基。雖然米黑根毛霉基因組報(bào)道過其含有多個(gè)蛋白酶基因，但對其蛋白酶基因的克隆表達(dá)和蛋白酶的其他應(yīng)用報(bào)道較少。本發(fā)明的米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶與已報(bào)道的蛋白酶同源性最高僅為45％，具有新穎性，同時(shí)具有良好的酶學(xué)特性，能夠有效嫩化豬肉和制備低分子量多肽，在食品行業(yè)具有很大應(yīng)用潛力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種重組天冬氨酸蛋白酶的生產(chǎn)方法及其在豬肉嫩化和多肽制備中的應(yīng)用，天冬氨酸蛋白酶來源于米黑根毛霉(rhizomucormiehei)。

本發(fā)明所述的重組天冬氨酸蛋白酶是由seqidno：1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明保護(hù)上述重組天冬氨酸蛋白酶的編碼基因，所述重組天冬氨酸蛋白酶的編碼基因是seqidno：2所示的dna分子。

本發(fā)明提供一種重組質(zhì)粒，是將米黑根毛霉的天冬氨酸蛋白酶基因rmproa連接至巴斯德畢赤酵母(pichiapastoris)gs115表達(dá)載體ppic9k構(gòu)建而成。

本發(fā)明提供一種重組菌株，所述重組菌株是以pichiapastorisgs115為宿主構(gòu)建的，是將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入巴斯德畢赤酵母中獲得的，所述重組菌株表達(dá)堿基序列如seqidno：2所示的dna，得到重組天冬氨酸蛋白酶。

本發(fā)明提供一種制備重組天冬氨酸蛋白酶的方法，是將上述米黑根毛霉的蛋白酶基因rmproa連接至巴斯德畢赤酵母(pichiapastoris)gs115表達(dá)載體ppic9k，并轉(zhuǎn)化至畢赤酵母中誘導(dǎo)表達(dá)得到重組天冬氨酸蛋白酶。

本發(fā)明提供應(yīng)用所述重組菌株發(fā)酵生產(chǎn)重組天冬氨酸蛋白酶的方法，是由上述重組菌株進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)得到重組天冬氨酸蛋白酶。

上述應(yīng)用所述重組菌株制備重組天冬氨酸蛋白酶經(jīng)過如下步驟：

1)種子液培養(yǎng)：將重組菌株接種于ypd培養(yǎng)基中，在30℃、220rpm條件下培養(yǎng)24h，得到種子液；

2)分批發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟1)的種子液以10％接種量接種于5l發(fā)酵罐中的分批發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，分批發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量為20-30％，攪拌轉(zhuǎn)速為500-600rpm，通氣量為1.0-2.0vvm，用25％氨水調(diào)節(jié)ph，控制ph4.0-6.0，培養(yǎng)溫度為28-30℃；

3)甘油流加培養(yǎng)：當(dāng)分批發(fā)酵培養(yǎng)基中的甘油耗盡溶氧反彈時(shí)以15-20ml/h/l的流速補(bǔ)加質(zhì)量濃度為50％的甘油，待甘油再次耗盡溶氧反彈時(shí)，饑餓0.5-1.5h，開始流加誘導(dǎo)培養(yǎng)基；

4)甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)：將攪拌轉(zhuǎn)速升高至800-900rpm，誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用分段流加方式：0-8h時(shí)流速為3.6ml/h/l，>8h時(shí)流速為10.9ml/h/l，誘導(dǎo)重組天冬氨酸蛋白酶表達(dá)，得到發(fā)酵液；

5)離心和純化：將所述發(fā)酵液依次進(jìn)行離心和純化。

重組天冬氨酸蛋白酶的離心、純化包括以下步驟：

(1)將發(fā)酵培養(yǎng)后得到的發(fā)酵液在10000×g條件下冷凍離心10min，取上清液，所述上清液為含有重組天冬氨酸蛋白酶的溶液；

(2)將步驟(1)中含有重組天冬氨酸蛋白酶的溶液依次進(jìn)行qsff強(qiáng)陰離子交換層析和s-100凝膠過濾層析，得到純化后的重組天冬氨酸蛋白酶。

上述發(fā)酵培養(yǎng)使用的分批發(fā)酵培養(yǎng)基包括：caso40.93g，k2so418.2g，mgso4·7h2o14.9g，koh4.13g，甘油40g，85％磷酸26.7ml，ptm14.35ml/l；所述甲醇誘導(dǎo)是含有12ml/lptm1的100％甲醇的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

本發(fā)明提供一種重組天冬氨酸蛋白酶嫩化豬肉的方法，步驟如下：

(1)將原料豬肉剔除可見的結(jié)締組織及脂肪，切成方塊；

(2)按原料豬肉重量計(jì)算，均勻注射0.1-1.0mg/100g肉重的重組天冬氨酸蛋白酶，于4℃放置48h。

本發(fā)明提供一種重組天冬氨酸蛋白酶制備多肽的方法，步驟如下：

(1)動(dòng)物肉類原料(如兔肉等)按重量計(jì)算，加入100-500u/g肉重的重組天冬氨酸蛋白酶，動(dòng)物蛋白原料(如阿膠等)和植物蛋白原料(如大豆蛋白等)按質(zhì)量體積比計(jì)算，加入50-200u/ml反應(yīng)液的重組天冬氨酸蛋白酶，55℃恒溫酶解2-8h，將得到的酶解液升溫至85-120℃，滅酶10-60min，然后進(jìn)行過濾處理，得到濾液；

(2)將濾液進(jìn)行濃縮處理，干燥后即得到多肽。

步驟(1)中將動(dòng)物肉類原料去除內(nèi)臟和油脂，攪碎，高溫高壓蒸煮1-4h，冷卻至40-70℃后再進(jìn)行酶解。

所述重組天冬氨酸蛋白酶的生產(chǎn)、純化及其嫩化豬肉和水解動(dòng)物及植物蛋白制備多肽的應(yīng)用均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)驗(yàn)證明：本發(fā)明所述重組菌株能夠采用上述發(fā)酵罐培養(yǎng)方法分泌表達(dá)胞外蛋白酶，發(fā)酵至6天時(shí)胞外酶活為3400u/ml。本發(fā)明提供的重組天冬氨酸蛋白酶能有效嫩化豬肉，降低剪切力，使肉質(zhì)適口。本發(fā)明提供的重組天冬氨酸蛋白酶能夠有效水解動(dòng)物及植物蛋白，制備低分子量多肽。

附圖說明

本發(fā)明有如下附圖：

圖1重組菌株在分批補(bǔ)料發(fā)酵過程中的發(fā)酵歷程圖。

圖2分批補(bǔ)料發(fā)酵過程中發(fā)酵上清液sds-page電泳圖，泳道1-9分別為誘導(dǎo)0h、24h、48h、72h、96h、118h、144h、168h、192h發(fā)酵上清液樣品。

圖3重組天冬氨酸蛋白酶純化過程中的蛋白電泳圖，m：低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1：粗酶液；2：qsff強(qiáng)陰離子交換層析純化后的蛋白；3：s-100凝膠過濾層析純化后的蛋白；4：endoh處理后的蛋白；5：蛋白酶酶譜。

圖4重組天冬氨酸蛋白酶的最適ph測定曲線圖。使用的緩沖液分別為：kcl-hcl(◆),citrate(△),mes(●),mops(×),tris-hcl(○),ches(■)。

圖5重組天冬氨酸蛋白酶的ph穩(wěn)定性測定曲線圖。使用的緩沖液分別為：kcl-hcl(◆),citrate(△),mes(●),mops(×),tris-hcl(○),ches(■)。

圖6重組天冬氨酸蛋白酶的最適溫度測定曲線圖。

圖7重組天冬氨酸蛋白酶溫度穩(wěn)定性測定曲線圖。

圖8高效凝膠過濾色譜(hpsec)測定兔肉水解產(chǎn)物多肽分子量分布圖。

圖9高效凝膠過濾色譜(hpsec)測定阿膠水解產(chǎn)物多肽分子量分布圖。

圖10高效凝膠過濾色譜(hpsec)測定大豆蛋白水解產(chǎn)物多肽分子量分布圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖1-10和具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。下述實(shí)施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

主要原料和試劑：

酵母粉、胰蛋白胨，購自英國oxoid公司；其它試劑如無特殊說明均為分析純。

種子培養(yǎng)基ypd：胰蛋白胨20g/l，酵母粉10g/l，葡萄糖20g/l。

實(shí)施例1：重組菌株的構(gòu)建和鑒定

提取米黑根毛霉rna，反轉(zhuǎn)錄為cdna，以cdna為模板，設(shè)計(jì)引物，通過pcr方法獲得rmproa基因，將其克隆至表達(dá)載體ppic9k上，獲得重組質(zhì)粒ppic9k-rmproa，轉(zhuǎn)化pichiapastorisgs115，經(jīng)篩選鑒定獲得重組菌株。巴斯德畢赤酵母的轉(zhuǎn)化采用電轉(zhuǎn)化法，涂布md平板，培養(yǎng)3-4天后挑取單克隆進(jìn)行下一步篩選。

引物如下：

上游：ccggaattcctccctgtcactaatgtttcccag

下游：gcggccgcttacatgttaagagctgccgcggac

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：經(jīng)與蛋白序列比對，蛋白酶與已報(bào)道的來源于米黑根毛霉的毛霉凝乳酶(mucorpepsin，p00799.1)(yangj.,teplyakova.,&quailj.w.crystalstructureoftheasparticproteinasefromrhizomucormieheiatresolution.journalofmolecularbiology,1997,268:449-459)同源性最高，僅為45％，其次為來源于微小毛霉(mucorpusillus)的凝乳酶(rennin,aab24375.1)(43％)(aikawaj.,nishiyamam.,&bepput.proteinengineeringofthemilk-clottingasparticproteinases.scandinavianjournalofclinicalandlaboratoryinvestigationsupplementum,2011,210:51-58)。因此該蛋白酶具有新穎性。蛋白酶基因全長1326bp，編碼441個(gè)氨基酸，含有n端信號肽和兩個(gè)糖基化位點(diǎn)。

實(shí)施例2：5l發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)重組天冬氨酸蛋白酶

從固體培養(yǎng)基平板上挑取單菌落接種于ypd培養(yǎng)基(500ml三角瓶中裝液量50ml)中30℃、220rpm培養(yǎng)24h作為種子液，然后以10％接種量接種于包含1.5l分批發(fā)酵培養(yǎng)基(caso40.93g，k2so418.2g，mgso4·7h2o14.9g，koh4.13g，甘油40g，85％磷酸26.7ml，ptm14.35ml/l)的5l發(fā)酵罐中，初始攪拌轉(zhuǎn)速為600rpm，通氣量為1.0vvm，25％氨水調(diào)節(jié)ph5.0，培養(yǎng)溫度30℃，當(dāng)甘油耗盡溶氧反彈時(shí)以流加方式補(bǔ)加50％甘油(w/v，含12ml/lptm1)，待甘油再次耗盡溶氧反彈時(shí)，饑餓培養(yǎng)1h，流加誘導(dǎo)培養(yǎng)基(100％甲醇含12ml/lptm1)，攪拌轉(zhuǎn)速提高至800rpm，誘導(dǎo)蛋白酶表達(dá)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用分段流加方式：0-8h流速3.6ml/h/l，>8h流速10.9ml/h/l。每隔12h取樣一次，測定酶活力、蛋白含量等參數(shù)。

蛋白酶活力測定采用gb/t23527-2009。具體方法如下：1ml酶液與1ml酪蛋白溶液在40℃條件下保溫10min后，加入2ml三氯乙酸終止反應(yīng)，12000rpm離心3min，取1ml上清液加入5mlna2co3和1mlfolin試劑，40℃保溫20min，于660nm處測定吸光值。以先加入三氯乙酸終止反應(yīng)的酶液作為對照。

酶活力的單位定義為：在上述條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸所需的酶量(u)。

采用lowry法測定蛋白含量。描述lowry法測定蛋白含量的參考文獻(xiàn)：lowry,o.h.,rosebrough,n.j.,farr,a.l.andrandall,r.j.proteinmeasurementwiththefolinphenolreagent.biol.chem.,1951,193:265-275.

sds-page凝膠電泳參照laemmli實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行(laemmliu.k.cleavageofstructuralproteinsduringtheassemblyoftheheadofbacteriophaget4.nature,1970,227:680-685)。具體方法如下：配制12.5％分離膠和4.5％濃縮膠，樣品與處理液混合后煮沸5min，冷卻后上樣，10ma恒流電泳，待指示劑至膠底時(shí)結(jié)束電泳。用考馬斯亮藍(lán)r-250染色顯示蛋白帶，甲醇、乙酸洗脫背景色。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：經(jīng)5l發(fā)酵罐高密度發(fā)酵后，重組菌株在156h時(shí)最高產(chǎn)蛋白酶活力為3400u/ml，蛋白含量為6.42mg/ml(重組菌株高密度發(fā)酵歷程見圖1)。sds-page分析重組菌株在分批補(bǔ)料發(fā)酵過程中上清液蛋白情況(圖2)，其主要蛋白條帶約為52kda，比預(yù)測蛋白分子量(45.8kda)明顯較高，可能發(fā)生了糖基化作用。

實(shí)施例3：重組天冬氨酸蛋白酶的純化與酶學(xué)性質(zhì)

一、重組天冬氨酸蛋白酶的純化

1、發(fā)酵罐培養(yǎng)重組天冬氨酸蛋白酶

同實(shí)施例2的步驟。發(fā)酵液10000×g冷凍離心10min，取上清液(粗酶液)。

2、離子交換層析

(1)將步驟1得到上清液進(jìn)行qsff強(qiáng)陰離子交換層析，流速為0.1ml/min，用0-500mmnacl水溶液線性梯度洗脫10個(gè)柱體積，收集具有蛋白酶酶活組分。酶活力測定條件同實(shí)施例2。

(2)將步驟(1)過柱收集的溶液進(jìn)行超濾處理(濾膜選擇可截留分子量在10kda以上的蛋白質(zhì))，收集蛋白大分子，然后將蛋白大分子溶于20mmph8.0的tris-hcl緩沖液中。

3、凝膠過濾層析

將步驟2中(2)收集的溶液進(jìn)行s-100凝膠過濾層析，流速為0.33ml/min，首先用含有100mmnacl的20mmph8.0的tris-hcl緩沖液平衡凝膠柱，然后上樣，再用相同的緩沖液進(jìn)行分離，收集具有蛋白酶酶活組分。酶活力測定條件同實(shí)施例2。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：重組天冬氨酸蛋白酶純化過程中的sds-page電泳及酶譜圖見圖3。經(jīng)qsff強(qiáng)陰離子交換層析和s-100凝膠過濾層析純化得到電泳純蛋白酶，采用sds-page和s-100測定蛋白分子量分別為52.4kda和50.6kda，經(jīng)endoh處理后，蛋白分子量為46.4kda。該蛋白發(fā)生了糖基化作用。

二、重組天冬氨酸蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)

以下所述緩沖液如下：kcl-hcl緩沖液、檸檬酸緩沖液、mes緩沖液、mops緩沖液、tris-hcl緩沖液、ches緩沖液。

1、重組天冬氨酸蛋白酶最適ph和ph穩(wěn)定性的測定

將重組天冬氨酸蛋白酶的稀釋液(分別采用不同緩沖液進(jìn)行稀釋)進(jìn)行蛋白酶酶活測定，得到重組天冬氨酸蛋白酶的最適ph。酶活測定條件同實(shí)施例2。

將重組天冬氨酸蛋白酶液用不同ph值的各種不同緩沖液稀釋，50℃水浴鍋中處理30min，迅速置于冰水中冷卻30min，然后進(jìn)行蛋白酶酶活測定，得到重組天冬氨酸蛋白酶的ph穩(wěn)定性。酶活測定條件同實(shí)施例2。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：以酶活力最高點(diǎn)作為100％，計(jì)算采用其他緩沖液時(shí)蛋白酶的相對酶活，重組天冬氨酸蛋白酶的最適ph為5.5(mes緩沖液)(圖4)。將采用50mmph5.5的mes緩沖液且沒有進(jìn)行水浴和冷卻處理時(shí)的酶活作為100％，計(jì)算各種不同緩沖液處理后蛋白酶的相對酶活，重組天冬氨酸蛋白酶在ph5.0-8.0之間的緩沖液中處理30min后，殘余酶活力能保持在80％以上(圖5)。

2、重組天冬氨酸蛋白酶最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性的測定

將重組天冬氨酸蛋白酶液的稀釋液(用50mmph5.5的mes緩沖液進(jìn)行稀釋)進(jìn)行蛋白酶酶活測定，反應(yīng)溫度為30-75℃，得到重組天冬氨酸蛋白酶的最適溫度。酶活測定條件同實(shí)施例2。

將重組天冬氨酸蛋白酶的稀釋液(用50mmph5.5的mes緩沖液進(jìn)行稀釋)在不同溫度下(30-65℃)孵育30min，迅速置于冰水中冷卻30min，然后進(jìn)行蛋白酶酶活測定，得到重組天冬氨酸蛋白酶的溫度穩(wěn)定性。酶活測定條件同實(shí)施例2。

3、蛋白酶抑制劑對重組天冬氨酸蛋白酶活力的影響及其底物特異性

蛋白酶抑制劑對蛋白酶活力的影響：分別以一定濃度的抑胃肽(pepstatina)、乙二胺四乙酸(edta)、苯甲基磺酰氟(pmsf)和碘乙酰胺(iodoacetamide)處理酶液，40℃恒溫水浴鍋中保溫處理30min，處理后迅速將樣品放置于冰水浴中冷卻30min，然后在最適條件下測定殘余酶活。以未經(jīng)處理的酶液作為對照，測定蛋白酶活力，計(jì)算殘余酶活力占空白對照酶活力的百分含量。

底物特異性：分別以1％的酪蛋白、脫脂乳、偶氮酪蛋白、牛血清蛋白、血紅蛋白、大豆分離蛋白、明膠、卵清蛋白、人血清白蛋白、肌紅蛋白、魚精蛋白和膠原蛋白等為底物，按照標(biāo)準(zhǔn)方法測定酶活力。以酪蛋白為底物時(shí)的蛋白酶活為100％，分別計(jì)算蛋白酶對各種底物的比酶活和相對酶活。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：以酶活力最高點(diǎn)作為100％，計(jì)算其他溫度下重組天冬氨酸蛋白酶的相對酶活，重組天冬氨酸蛋白酶的最適溫度為55℃(圖6)。將沒有進(jìn)行孵育和冷卻處理的重組天冬氨酸蛋白酶的酶活作為100％，計(jì)算其他溫度處理后重組天冬氨酸蛋白酶的相對酶活，該酶具有較好的溫度穩(wěn)定性，在45℃下處理30min后酶活力基本沒有變化，50℃下處理30min后酶活力仍能保持80％以上(圖7)。重組蛋白酶活力受到天冬氨酸蛋白酶抑制劑pepstatina的強(qiáng)烈抑制(表1)，其他類型蛋白酶抑制劑對酶活力無太大影響。重組天冬氨酸蛋白酶具有較廣泛的底物特異性，對酪蛋白表現(xiàn)出最強(qiáng)的水解能力(表2)。

表1蛋白酶抑制劑對重組天冬氨酸蛋白酶活力的影響

表2重組天冬氨酸蛋白酶的底物特異性

實(shí)施例4：重組天冬氨酸蛋白酶對豬肉的嫩化

1、嫩化條件：將豬肉剔除可見的結(jié)締組織及脂肪，切成方塊，用一定濃度的酶液進(jìn)行注射嫩化處理，于4℃放置48h。以未進(jìn)行嫩化處理的豬肉作為對照。

2、剪切力測定：將處理好的肉沿垂直于肌纖維方向切割成2.5cm厚的肉塊，放于蒸煮袋中，盡量排出袋內(nèi)空氣，將袋口扎緊，在80℃水浴鍋中加熱，當(dāng)肉的中心溫度達(dá)到75℃時(shí)，取出冷卻至常溫后取樣。順著肌纖維方向切取截面積為1cm²的肉柱，然后在質(zhì)構(gòu)儀上測其剪切力值。剪切力測定參數(shù)：探頭，ta3/100；測試模式與選擇，tpa；測試前速度，2.0mm/s；測試速度，2.0mm/s；測試后速度，2.0mm/s；壓縮距離，20mm；測試時(shí)間，10.0s。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。實(shí)驗(yàn)證明：添加0.25mg/100g和0.5mg/100g肉重的重組天冬氨酸蛋白酶能夠明顯降低剪切力，并隨著濃度的增加，剪切力越低，表現(xiàn)出對豬肉的嫩化效果。

表3重組天冬氨酸蛋白酶對豬肉的嫩化

實(shí)施例5：重組天冬氨酸蛋白酶水解蛋白制備多肽

1、蛋白酶水解制備多肽：兔肉經(jīng)切碎處理后，高溫高壓蒸煮2h，加入重組天冬氨酸蛋白酶酶解6h，酶解條件：55℃，ph7.0。酶解后煮沸滅酶，離心除渣，取上清液冷凍干燥即得肽粉。動(dòng)物蛋白(阿膠)和植物蛋白(大豆蛋白)用50mmph5.5的mes緩沖液按照5％比例配制，分別加入100u/ml反應(yīng)液的重組天冬氨酸蛋白酶在55℃條件下酶解4h。酶解后煮沸滅酶，離心除渣，取上清液冷凍干燥即得肽粉。

2、水解產(chǎn)物多肽得率測定方法：采用opa法(wangd.,wangl.,zhuf.,etal.invitroandinvivostudiesontheantioxidantactivitiesoftheaqueousextractsofdouchi(atraditionalchinesessalt-fementedsoybeanfood).foodchemistry,2008,107:1421-1428)。25μl樣品與1mlopa試劑混合物(25ml100mm的四硼酸鈉溶液、10ml5％的sds溶液、1ml40mg/ml的鄰苯二甲醛溶液、100μlβ-巰基乙醇和13.9ml的水)，并在室溫下保持8min，在340nm處測定吸光值。以gly-leu二肽作為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算多肽含量。通過opa法測定的多肽含量除以水解液中的蛋白含量即為多肽得率。

3、多肽分子量高效凝膠過濾色譜(hpsec)檢測條件：tskgel硅膠凝膠柱tsk-gelg2000swxl，7.8×300mm，柱體積14.33ml。流動(dòng)相：含0.1％三氟乙酸的45％乙腈水溶液。流速：0.5ml/min。檢測器：紫外檢測器，214nm。柱溫：40℃。進(jìn)樣量：25μl。

實(shí)驗(yàn)證明：采用100u/g肉重的重組天冬氨酸蛋白酶水解兔肉，采用100u/ml反應(yīng)液的重組天冬氨酸蛋白酶水解阿膠和大豆蛋白制備多肽，水解產(chǎn)物多肽得率可大于10％(表4)；經(jīng)hpsec測定水解產(chǎn)物分子量分布情況，相對分子質(zhì)量小于1000da的多肽含量可大于90％(hpsec測定兔肉、阿膠和大豆蛋白多肽分子量分布圖分別見圖8、9、10)。

表4重組天冬氨酸蛋白酶水解蛋白產(chǎn)物分析

本說明書中未作詳細(xì)描述的內(nèi)容屬于本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員公知的現(xiàn)有技術(shù)。

<110>中國農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>一種新型米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶的生產(chǎn)方法及其應(yīng)用

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