本發(fā)明涉及酶及其編碼的基因與應(yīng)用，特別涉及一種皺紋盤(pán)鮑的基因工程表達(dá)，具體涉及一種皺紋盤(pán)鮑硫氧還蛋白過(guò)氧化酶(tpx)及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：硫氧還蛋白過(guò)氧化酶(thioredoxinperoxidase，tpx)是過(guò)氧化物還原酶家族的一員，是過(guò)氧化物酶超家族的新成員，廣泛存在于自然界中，能夠清除體內(nèi)的多種自由基，維持體內(nèi)環(huán)境平衡。硫氧還蛋白過(guò)氧化酶中tpx1、tpx2、tpx6均位于胞漿中；tpx3存在于線粒體；tpx4位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞外基質(zhì)；tpx5則分布在過(guò)氧化物酶體內(nèi)。其含有一個(gè)或者二個(gè)半胱氨酸殘基，其主要分為六種類型：前五種同工酶均含有二個(gè)半胱氨酸殘基，第六種同工酶則含有一個(gè)半胱氨酸殘基。具有相同數(shù)量的半胱氨酸殘基，它們的同源性較高。在體內(nèi)參與細(xì)胞的許多生理生化反應(yīng)：作為細(xì)胞傳遞的信號(hào)、對(duì)細(xì)胞增殖和分化起調(diào)控作用等。而且由于tpx2天然的抗氧化性能，可用于開(kāi)發(fā)抗氧化性食品、醫(yī)藥制備等領(lǐng)域。皺紋盤(pán)鮑(h.discushannaiino)隸屬于軟體動(dòng)物門(mén)(mollusca)、腹足綱(gastropoda)、前鰓亞綱(prosobranchia)、原始腹足目(archaeogastropoda)、鮑科(haliotidae)，以其豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值在民間一直被認(rèn)為是與魚(yú)翅、燕窩齊名的營(yíng)養(yǎng)食品。目前，已有的對(duì)鮑藥用及食用價(jià)值的研究主要集中在多肽與多糖的提取制備及其生物活性研究。海洋生物因其特殊的生活環(huán)境和代謝方式，體內(nèi)存在許多具有藥用價(jià)值的特殊生理活性物質(zhì)，是開(kāi)發(fā)新型海洋藥物和功能食品的重要資源。福建省皺紋盤(pán)鮑資源豐富、產(chǎn)量大，至2013年，鮑產(chǎn)量達(dá)到88470t，所占比例超過(guò)全國(guó)產(chǎn)量的80％。鮑產(chǎn)業(yè)已成為福建省海水養(yǎng)殖的支柱產(chǎn)業(yè)之一，也是水產(chǎn)業(yè)增長(zhǎng)速度最快、經(jīng)濟(jì)效益最好的產(chǎn)業(yè)。如何充分高效地利用鮑資源，挖掘其中的生物活性物質(zhì)往保健食品和海洋藥物方向高值化利用，符合我省和我國(guó)當(dāng)今新興的海洋戰(zhàn)略發(fā)展研究。對(duì)于硫氧還蛋白過(guò)氧化酶的直接分離提取工藝相對(duì)復(fù)雜；而化學(xué)合成成本過(guò)高且難以保持其天然結(jié)構(gòu)?；蚬こ桃约暗鞍踪|(zhì)工程的應(yīng)用為獲得天然活性肽開(kāi)辟了有效途徑?；蚬こ讨苽渖锘钚噪目朔酥苯訌膭?dòng)、植物原料中提取抗氧化蛋白篩選的盲目性，純化工藝簡(jiǎn)單，便于規(guī)?；a(chǎn)，具有很好的產(chǎn)業(yè)化前景。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供皺紋盤(pán)鮑硫氧還蛋白過(guò)氧化酶hdhtpx2的制備方法以其在制備食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用。具體而言，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：第一方面，本發(fā)明提供了一種編碼皺紋盤(pán)鮑硫氧還蛋白過(guò)氧化酶的基因，含有seqidno.1所述的堿基序列或者含有編碼如下蛋白質(zhì)(a)或(b)的基因：(a)由seqidno.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)在(a)限定的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有硫氧還蛋白過(guò)氧化酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。優(yōu)選的，根據(jù)以上所述的基因，其中用于所述基因擴(kuò)增的引物如seqidno.3和seqidno.4所示。第二方面，本發(fā)明還提供了一種皺紋盤(pán)鮑硫氧還蛋白過(guò)氧化酶，含有以上所述的編碼超氧化物歧化酶的基因所編碼。第三方面，本發(fā)明提供了一種表達(dá)皺紋盤(pán)鮑硫氧還蛋白過(guò)氧化酶基因的載體，所述載體為含有以上所述的硫氧還蛋白過(guò)氧化酶基因、aox1啟動(dòng)子和終止子序列、多克隆位點(diǎn)以及篩選標(biāo)志的畢赤酵母表達(dá)載體，所述畢赤酵母表達(dá)載體優(yōu)選為ppic9k。優(yōu)選的，根據(jù)以上所述的載體，所述硫氧還蛋白過(guò)氧化酶基因位于畢赤酵母表達(dá)載體ppic9k的多克隆位點(diǎn)處snabⅰ和notⅰ限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)之間。優(yōu)選的，根據(jù)以上所述的載體，所述篩選標(biāo)志為6×his-tag標(biāo)簽。本發(fā)明還提供了一種皺紋盤(pán)鮑硫氧還蛋白過(guò)氧化酶制備方法，包括以下步驟：(1)構(gòu)建含有編碼皺紋盤(pán)鮑硫氧還蛋白過(guò)氧化酶的基因的重組表達(dá)載體；(2)將步驟(1)所得重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，并將宿主細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得可表達(dá)皺紋盤(pán)鮑硫氧還蛋白過(guò)氧化酶的基因工程菌菌株；(3)發(fā)酵培養(yǎng)已得到的基因工程菌菌株并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得表達(dá)產(chǎn)物；(4)分離純化步驟(3)所得的表達(dá)產(chǎn)物，獲得重組蛋白，皺紋盤(pán)鮑硫氧還蛋白過(guò)氧化酶；其中，步驟(1)中所述編碼皺紋盤(pán)鮑硫氧還蛋白過(guò)氧化酶的基因，含有seqidno.1所述的堿基序列或者含有編碼如下蛋白質(zhì)(a)或(b)的基因：(a)由seqidno.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)在(a)限定的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有硫氧還蛋白過(guò)氧化酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。優(yōu)選的，根據(jù)以上所述的制備方法，其中步驟(1)中，所述表達(dá)載體為畢赤酵母表達(dá)載體，優(yōu)選為ppic9k。優(yōu)選的，根據(jù)以上所述的制備方法，其中步驟(2)中，所述宿主細(xì)胞為畢赤酵母gs115菌株。另外，本發(fā)明還提供了以上所述的皺紋盤(pán)鮑硫氧還蛋白過(guò)氧化酶在食品添加劑、藥物制備領(lǐng)域、保健品領(lǐng)域或者化妝品領(lǐng)域中的應(yīng)用。優(yōu)選的，根據(jù)以上所述的應(yīng)用，其中所述食品添加劑為動(dòng)物飼料添加劑，所述皺紋盤(pán)鮑硫氧還蛋白過(guò)氧化酶和動(dòng)物血液的溶血率小于10％。優(yōu)選的，根據(jù)以上所述的應(yīng)用，其中所述皺紋盤(pán)鮑硫氧還蛋白過(guò)氧化酶能夠保護(hù)和修復(fù)過(guò)氧化氫引起的細(xì)胞損傷。本發(fā)明所取得的有益效果是：本發(fā)明借助基因工程技術(shù)，利用ppic9k畢赤酵母表達(dá)載體，成功高效得在體外表達(dá)了可溶的、易純化分離的、具有抗氧化活性的皺紋盤(pán)鮑hdhtpx2蛋白，該重組蛋白具有很強(qiáng)的清除超氧陰離子自由基、羥自由基等活性。皺紋盤(pán)鮑hdhtpx2的基因工程表達(dá)產(chǎn)品將在制備食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域中發(fā)揮其應(yīng)用價(jià)值。附圖說(shuō)明圖1為pcr擴(kuò)增hdhtpx2目的基因片段。m為dnamarkerdl2000，其中標(biāo)號(hào)1為hdhtpx2目的基因pcr產(chǎn)物，bp代表堿基。圖2為sds-page電泳分析ppic9k-hdhtpx2重組載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母gs115菌株后，hdhtpx2蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)圖，其中m為預(yù)染蛋白marker26616，標(biāo)號(hào)1-7為重組表達(dá)載體ppic9k-hdhtpx2轉(zhuǎn)化畢赤酵母后，甲醇誘導(dǎo)0h，6h，12h，24h，48h，72h，96h不同時(shí)間蛋白表達(dá)產(chǎn)物。圖3為sds-page電泳分析不同甲醇濃度誘導(dǎo)下hdhtpx2蛋白的表達(dá)圖，其中m為預(yù)染蛋白marker26616，標(biāo)號(hào)1-4分別為0.5％體積、1％體積、2％體積、3％體積甲醇濃度誘導(dǎo)下hdhtpx2蛋白的表達(dá)條帶。圖4為不同ph條件下hdhtpx2的表達(dá)圖，其中m為預(yù)染蛋白marker26616，標(biāo)號(hào)1-5分別ph為4，5，6，7，8時(shí)hdhtpx2蛋白的表達(dá)條帶。圖5為sds-page電泳分析純化前后hdhtpx2的表達(dá)圖，其中m為預(yù)染蛋白marker26614，1為純化前hdhtpx2蛋白的表達(dá)條帶，2為純化后hdhtpx2蛋白的表達(dá)條帶。圖6為不同濃度的hdhtpx2蛋白清除羥自由基能力測(cè)定結(jié)果圖。圖7為不同濃度的維生素c(vc)清除羥自由基能力測(cè)定結(jié)果圖。圖8為l929細(xì)胞在不同濃度的hdhtpx2蛋白處理下的細(xì)胞存活率圖。圖9為l02細(xì)胞在不同濃度的hdhtpx2蛋白處理下的細(xì)胞存活率圖。圖10為馬血在不同濃度的hdhtpx2蛋白處理下的溶血率圖。圖11為l929細(xì)胞在不同濃度的過(guò)氧化氫處理的hdhtpx2蛋白作用下的細(xì)胞存活率圖。圖12為l02細(xì)胞在不同濃度的過(guò)氧化氫處理的hdhtpx2蛋白作用下的細(xì)胞存活率圖。圖13為本發(fā)明構(gòu)建的ppic9k-hdhtpx2重組表達(dá)載體圖。具體實(shí)施方式如上所述，本發(fā)明的目的在于提供一種皺紋盤(pán)鮑硫氧還蛋白過(guò)氧化酶，其可以在體外表達(dá)，而且易于分離純化，具有很強(qiáng)的清除超氧陰離子自由基、羥自由基等活性，而且具有細(xì)胞安全性和損傷修復(fù)和保護(hù)功能，可以用作食品添加劑、藥物制備以及化妝品或者保健品等領(lǐng)域。本發(fā)明通過(guò)借助基因工程技術(shù)，提供了一種編碼皺紋盤(pán)鮑硫氧還蛋白過(guò)氧化酶的基因，含有seqidno.1所述的堿基序列或者含有編碼如下蛋白質(zhì)(a)或(b)的基因：(a)由seqidno.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)在(a)限定的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有硫氧還蛋白過(guò)氧化酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明所述的皺紋盤(pán)鮑硫氧還蛋白過(guò)氧化酶包括在seqidno.2所示的氨基酸基礎(chǔ)上，進(jìn)行一個(gè)或者幾個(gè)，優(yōu)選10個(gè)以內(nèi)的氨基酸的取代、缺失或者增加，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該知曉，幾個(gè)氨基酸的取代、缺失或者增加并不影響蛋白質(zhì)整體的功能。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述皺紋盤(pán)鮑硫氧還蛋白過(guò)氧化酶，具有seqidno.2所示的氨基酸序列。本發(fā)明借助基因工程手段，提供了一種皺紋盤(pán)鮑硫氧還蛋白過(guò)氧化酶的制備方法，具體通過(guò)借助畢赤酵母表達(dá)載體，將編碼皺紋盤(pán)鮑硫氧還蛋白過(guò)氧化酶的基因構(gòu)建到該載體中，然后導(dǎo)入宿主細(xì)胞，篩選可以表達(dá)皺紋盤(pán)鮑硫氧還蛋白過(guò)氧化酶的工程菌菌株，然后進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，純化后得到該蛋白。本發(fā)明所構(gòu)建的真核重組表達(dá)載體ppic9k-hdhtpx2如圖12所示，其特點(diǎn)是采用aox1啟動(dòng)子，酵母信號(hào)肽α-factor因子引導(dǎo)目的蛋白hdhtpx2的分泌表達(dá)，并在c端帶有6×his-tag便于親和層析純化目的蛋白。其中，在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述皺紋盤(pán)鮑硫氧還蛋白過(guò)氧化酶的制備方法，包括以下步驟：(1)：構(gòu)建皺紋盤(pán)鮑hdhtpx2的畢赤酵母表達(dá)載體；(2)：將步驟(1)所得畢赤酵母表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，并將宿主細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得可表達(dá)hdhtpx2的基因工程菌菌株；(3)：發(fā)酵培養(yǎng)已得到的基因工程菌菌株并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得表達(dá)產(chǎn)物；(4)：分離純化步驟(3)所得的表達(dá)產(chǎn)物，獲得重組蛋白，即hdhtpx2。其中，在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，步驟(4)中分離純化為先將表達(dá)產(chǎn)物透析后，再進(jìn)行親和層析。以下通過(guò)實(shí)施例結(jié)合附圖詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該知曉的，這些實(shí)施例僅用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)看做是對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明的基礎(chǔ)上，可以進(jìn)行常規(guī)手段置換，或者在本發(fā)明所構(gòu)建的編碼皺紋盤(pán)鮑硫氧還蛋白過(guò)氧化酶基因的基礎(chǔ)上，進(jìn)行基因的添加的取代、缺失或者添加等，并不影響或者基本不影響所表達(dá)的硫氧還蛋白過(guò)氧化酶的蛋白活性。本發(fā)明實(shí)施例中所用到的試劑或者儀器，均為本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的試劑或者儀器。本發(fā)明所用到的方法為分子生物學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法。其中，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中用到的儀器和設(shè)備如下：pcr擴(kuò)增儀(ptc0-200)購(gòu)自bio-rad公司；凝膠成像分析系統(tǒng)(tanon2500)購(gòu)自上海天能科技有限公司；高速冷凍離心機(jī)(5810r)購(gòu)自eppendorf公司；純水系統(tǒng)(direct-q3uv)購(gòu)自milipore公司；分析天平(bsa224s)購(gòu)自sartoriusag公司；高壓蒸汽滅菌鍋(gi54dws)購(gòu)自致微儀器有限公司；酶標(biāo)儀(infinite200pro)購(gòu)自tecan公司；藍(lán)光切膠儀(equ312)購(gòu)自sangonbiotech；恒溫金屬浴(chb-t2-b)購(gòu)自thermoq公司；振蕩儀(ms3bs25)購(gòu)自ika公司；電子天平(bsa8201)購(gòu)自sartorius公司；電子ph計(jì)(fe28-standard)購(gòu)自mettlertoledo；冷藏冰箱bcd-277(kk28f58ti)購(gòu)自haier公司；普通干燥箱(dhg-9141a)購(gòu)自上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；垂直板電泳儀(dyy-6c)購(gòu)自biorad公司；垂直板電泳槽(552br)購(gòu)自bio-rad公司；aktapurrifier蛋白純化系統(tǒng)(zq23494)購(gòu)自akta公司；-80℃超低溫冰箱(dw-86l388a)購(gòu)自haier公司；低溫?fù)u床(maxq6000)購(gòu)自thermo公司；脫色搖床(ty-808)購(gòu)自南京大學(xué)；電轉(zhuǎn)儀(1652100)購(gòu)自bio-rad公司；微量移液槍(p37050e)購(gòu)自eppendorf公司；薄層掃描儀(v700)購(gòu)自epson公司；透析袋(含透析夾)(161129)購(gòu)自greenbird公司。實(shí)施例1皺紋盤(pán)鮑hdhtpx2重組表達(dá)載體的構(gòu)建1.皺紋盤(pán)鮑hdhtpx2目的基因的獲得根據(jù)ppic9k載體多克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增編碼皺紋盤(pán)鮑hdhtpx2基因的特異性上游引物f1和下游引物r1。pcr擴(kuò)增皺紋盤(pán)鮑hdhtpx2基因序列，擴(kuò)增的hdhtpx2基因序列如seqidno.1所示，該序列編碼的氨基酸序列如seqidno.2所示。在上游引物hdhtpx2的5`端加上snabi酶切位點(diǎn)，在下游引物hdhtpx2的5`端添加noti酶切位點(diǎn)，終止密碼子和6×his組氨酸標(biāo)簽：下游引物采用noti酶切位點(diǎn)：上游引物hdhtpx2f1序列如seqidno.3所示：5`catgtacgtagcccaagtcggaaacctc3`，其中seqidno.3序列中的第五個(gè)堿基到第十個(gè)堿基表示引入的snabi酶切位點(diǎn)。下游引物hdhtpx2f1r1序列如seqidno.4所示：5`atgcggccgctcaatggtgatggtgatgatggttgaccttggagaag3`，其中，seqidno.4序列中的第三個(gè)堿基到第十個(gè)堿基表示引入的noti酶切位點(diǎn)，第十一個(gè)堿基到第十三個(gè)堿基表示終止密碼子，第十四個(gè)堿基到第三十一個(gè)堿基為6×his-tag序列。以皺紋盤(pán)鮑cdna為模板，以hdhtpxf1和hdhtpxr1為上、下游引物擴(kuò)增目的基因片段，然后與ppmd18-t質(zhì)粒連接，獲得含有hdhtpx2目的基因的重組陽(yáng)性質(zhì)粒，然后以該陽(yáng)性質(zhì)粒為擴(kuò)增模板，分別以hdhtpxf1和hdhtpxr1為上、下游引物，以transstartfastpfudnapolymerase高保真酶(購(gòu)自transgen公司)，擴(kuò)增目的基因片段，反應(yīng)體系為：表1pcr反應(yīng)體系無(wú)菌miliq水31.5μl5×buffer(含mg2+)10μldntps(2.5mmeach)4μlpmd18-t/hdhtpx重組陽(yáng)性質(zhì)粒1.5μl上游引物hdhtpx2f1(10μm)1μl下游引物hdhtpx2r1(10μm)1μltransstartfastpfudnapolymerase(2.5u/μl)1μl總反應(yīng)體積50μl將上述體系混合均勻，在熱循環(huán)儀上按照以下程序進(jìn)行pcr反應(yīng)：皺紋盤(pán)鮑hdhtpx2基因pcr程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性1min；94℃變性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸45sec，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min，4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，將所有反應(yīng)液進(jìn)行1.2％(w/v)瓊脂糖凝膠-tae電泳，用axygen公司的凝膠回收試劑盒回收和純化含目的片段的瓊脂糖凝膠(如圖1所示)，其中dnamarkerdl-2000購(gòu)自于takara公司。從圖1可以看出，回收得到的皺紋盤(pán)鮑hdhtpx2目的基因pcr產(chǎn)物長(zhǎng)度為600bp左右，與理論值相符。2.hdhtpx2目的基因酶切(1)hdhtpx2目的基因片段的第一次單酶切：取20μg上述回收的皺紋盤(pán)鮑hdhtpx2目的基因片段，用snabⅰ限制性內(nèi)切酶(購(gòu)自takara公司)單酶切，充分混勻后37℃孵育8h，單酶切見(jiàn)表2。表2含目的基因的酶切體系回收目的基因片段20μg10×snabⅰ酶反應(yīng)緩沖液12μl0.1％bsa12μlsnabⅰ限制性內(nèi)切酶(15u/μl)2μl無(wú)菌miliq水67μl總反應(yīng)體積120μl反應(yīng)結(jié)束后，pcr酶切產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1.2％(w/v)瓊脂糖凝膠-tae電泳鑒別酶切效果；用核酸共沉劑(takara公司)回收酶切后的hdhtpx2目的基因片段。處理后的hdhtpx2目的基因片段具有snabⅰ的粘性末端。(2)hdhtpx2目的基因片段的第二次單酶切：取40μg上述核酸共沉劑回收的hdhtpx2的目的基因片段，用限制性內(nèi)切酶notⅰ(購(gòu)自takara公司)單酶切，充分混勻后37℃孵育8h，單酶切體系如表3所示。表3單酶切體系核酸共沉劑回收產(chǎn)物40μg10×notⅰ酶反應(yīng)緩沖液12μl0.1％bsa12μl0.1％tritonx-10012μlnotⅰ限制性內(nèi)切酶(10u/μl)1μl無(wú)菌miliq水43μl總反應(yīng)體積120μl反應(yīng)完成后，用1.2％(w/v)瓊脂糖凝膠-tae電泳鑒別酶切效果；用核酸共沉劑(購(gòu)自takara公司)回收酶切后的hdhtpx2目的基因片段。處理后的hdhtpx2目的基因片段具有snabⅰ和notⅰ的粘性末端。3.ppic9k載體雙酶切位點(diǎn)的構(gòu)建將ppic9k(購(gòu)自invitrogen公司)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞(購(gòu)自tiangen公司)，然后涂板于含50μg/ml的氨芐霉素的lb平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。次日挑取單克隆菌落，接種于5ml含50μg/ml的氨芐霉素的lb液體培養(yǎng)基中，37℃，180rpm/min培養(yǎng)8h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，離心收集菌體，小量提取ppic9k質(zhì)粒。取3μg上述純化的ppic9k載體，用snabⅰ和notⅰ限制性酶雙酶切，37℃孵育8h，酶切體系如表4所示；反應(yīng)結(jié)束后，用0.8％(w/v)瓊脂糖凝膠-tae電泳檢測(cè)酶切結(jié)果。然后用核酸共沉劑(d605a，購(gòu)自takara公司)回收酶切后的載體。表4重組載體酶切體系10×h酶反應(yīng)緩沖液12μl0.1％bsa12μlecorⅰ限制性內(nèi)切酶(15u/μl)2μlnotⅰ限制性內(nèi)切酶(10u/μl)2μlppic9k載體質(zhì)粒40μl無(wú)菌miliq水52μl總反應(yīng)體積120μl利用表4中的酶切體系處理后的ppic9k載體具有snabⅰ和notⅰ的粘性末端。4.ppic9k和目的片段hdhtpx2的連接采用dnaligationkit(購(gòu)自takara公司)，將具有snabⅰ和notⅰ的粘性末端的ppic9k載體與具有相同粘性末端hdhtpx2的基因片段進(jìn)行連接，反應(yīng)體系如下：表5目的基因與載體連接體系ppic9k載體1μlhdhtpx2基因片段4μlligationsolutionⅰ5μl總反應(yīng)體積10μl將反應(yīng)液置于16℃連接過(guò)夜，次日，取5μl連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化至50μle.colidh5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有氨芐霉素(50μg/ml)的lb瓊脂平板上培養(yǎng)過(guò)夜。次日挑取單克隆，以hdhtpx2f1(seqidno.1)和hdhtpx2r1(seqidno.2)為上下游引物，如前所述用pcr法鑒定陽(yáng)性克隆菌，交由上海生工公司進(jìn)行dna核苷酸序列測(cè)定。結(jié)果顯示連接正確，核苷酸的開(kāi)放閱讀框(orf)連續(xù)編碼，得到ppic9k-hdhtpx2重組表達(dá)載體。實(shí)施例2ppic9k-hdhtpx2重組質(zhì)粒在畢赤酵母gs115中的誘導(dǎo)表達(dá)1.ppic9k-hdhtpx2的線性化和在畢赤酵母中的表達(dá)測(cè)序正確的含表達(dá)載體的菌株劃線培養(yǎng)，挑取單克隆搖菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后，由sacⅰ限制性內(nèi)切酶(購(gòu)自takara公司)線性化，反應(yīng)體系如下：表6重組質(zhì)粒線性化反應(yīng)體系重組表達(dá)載體80μlsacⅰ限制性內(nèi)切酶5μl10×l酶反應(yīng)緩沖液12μl無(wú)菌miliq水23μl總反應(yīng)體積120μl充分混勻，離心，于恒溫金屬浴37℃酶切過(guò)夜。反應(yīng)結(jié)束后，用核酸共沉劑回收線性化后的酶切產(chǎn)物ppic9k-hdhtpx2。再將其用電擊法轉(zhuǎn)化至畢赤酵母gs115感受態(tài)細(xì)胞中，選取在25kda位置出現(xiàn)蛋白質(zhì)條帶的單克隆，進(jìn)行表達(dá)條件的優(yōu)化。2.重組質(zhì)粒表達(dá)條件的優(yōu)化(1)hdhtpx2在不同時(shí)間點(diǎn)的誘導(dǎo)1)挑選單菌落于10mlbmgy培養(yǎng)基中，28℃，230rpm振蕩培養(yǎng)約20h；2)直至菌液發(fā)白，od600在2.0～6.0之間，23℃，2000g離心5min，棄上清收集細(xì)胞；3)加入等體積bmmy重懸細(xì)胞，28℃，230rpm振蕩培養(yǎng)24h誘導(dǎo)表達(dá)，并每隔24h補(bǔ)充0.5％的甲醇至溶液總體積不變；4)在0h、6h、12h、24h、48h、72h、96h不同時(shí)間點(diǎn)中各取1ml發(fā)酵液作為誘導(dǎo)前樣品，4℃，12000g離心10min，取900μl上清利用sds-page電泳分析蛋白的表達(dá)量。其中，bmgy生長(zhǎng)用培養(yǎng)基：稱量10g酵母提取物，20g胰蛋白胨于700ml水中，充分混勻，冷卻至室溫后加入1m磷酸鉀緩沖液、10×ynb和10×gy各100ml，以及2ml的500×b，121℃高壓滅菌20min，4℃保存。bmmy表達(dá)用培養(yǎng)基：稱量10g酵母提取物，20g胰蛋白胨于700ml水中，充分混勻，冷卻至室溫后加入1m磷酸鉀緩沖液、10×ynb和10×m各100ml，并加入2ml的500×b，121℃高壓滅菌20min，4℃保存。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:ppic9k-hdhtpx2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母gs115后，挑取單克隆菌株在10mlbmgy生長(zhǎng)用培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，離心收集菌體，轉(zhuǎn)入bmmy表達(dá)用生長(zhǎng)培養(yǎng)基中加入0.5％甲醇誘導(dǎo)表達(dá)96h(每24h補(bǔ)充0.5％甲醇)。結(jié)果如圖2所示(其中蛋白質(zhì)markers購(gòu)自thermo公司，以下相同，即本發(fā)明實(shí)驗(yàn)過(guò)程中用到的蛋白質(zhì)markers均購(gòu)自于thermo公司)。圖2結(jié)果表明，甲醇誘導(dǎo)后在約25kda位置出現(xiàn)蛋白質(zhì)條帶，與表達(dá)的目的蛋白tpx2分子量相當(dāng)。且隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)蛋白在72h表達(dá)量最高。(2)hdhtpx2在不同甲醇濃度下的誘導(dǎo)1)挑取單菌落接種于10mlbmgy培養(yǎng)基中，28℃，230rpm振蕩培養(yǎng)24h；2)直至菌液發(fā)白，od600在2.0～6.0之間，23℃，2000g離心5min，棄上清收集細(xì)胞；3)加入等體積bmmy重懸細(xì)胞，補(bǔ)充不同濃度的甲醇分別為0.5％、1.0％、2.0％、3.0％，28℃，230rpm振蕩培養(yǎng)24h誘導(dǎo)表達(dá)；4)在不同甲醇濃度中各取1ml發(fā)酵液作為誘導(dǎo)前樣品，4℃，12000g離心10min，取900μl上清應(yīng)用sds-page對(duì)蛋白表達(dá)量進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：ppic9k-hdhtpx2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的畢赤酵母gs115后，挑取單克隆菌株在10mlbmgy生長(zhǎng)用培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，離心收集菌體，轉(zhuǎn)入bmmy表達(dá)用生長(zhǎng)培養(yǎng)基中分別加入0.5％、1.0％、2.0％、3.0％甲醇誘導(dǎo)表達(dá)24h。結(jié)果如圖3所示：甲醇誘導(dǎo)后在約25kda位置出現(xiàn)蛋白質(zhì)條帶，與表達(dá)的目的蛋白tpx2分子量相當(dāng)。且隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)蛋白在0.5％甲醇濃度下表達(dá)量最高。(3)hdhtpx2在不同ph條件下的誘導(dǎo)1)挑選單菌落接種于10mlbmgy培養(yǎng)基中，28℃，230rpm振蕩培養(yǎng)24h；2)直至菌液發(fā)白，od600在2.0～6.0之間，23℃，2000g離心5min，棄上清收集細(xì)胞；3)加入等體積bmmy重懸細(xì)胞，調(diào)整不同濃度的ph分別為4、5、6、7、8，28℃，230rpm振蕩培養(yǎng)24h誘導(dǎo)表達(dá)；4)在不同ph中各取1ml發(fā)酵液作為誘導(dǎo)前樣品，4℃，12000g離心10min，取900μl上清利用sds-page法對(duì)于蛋白表達(dá)量進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：ppic9k-hdhtpx2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的畢赤酵母gs115后，挑取單克隆菌株在10mlbmgy生長(zhǎng)用培養(yǎng)基中培養(yǎng)16h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，離心收集菌體，轉(zhuǎn)入ph為4、5、6、7、8的bmmy表達(dá)用生長(zhǎng)培養(yǎng)基中加入0.5％甲醇誘導(dǎo)表達(dá)24h。結(jié)果如圖4所示：甲醇誘導(dǎo)后在約25kda位置出現(xiàn)條帶，與表達(dá)的目的蛋白tpx2分子量相當(dāng)，ph7表達(dá)量最高。實(shí)施例3目的蛋白hdhtpx2的大量表達(dá)和純化1.tpx2的大量表達(dá)1)從保種中取1ml菌液接種于25mlypd液體培養(yǎng)基，28℃，230rpm振蕩培養(yǎng)16h；2)取5ml菌液接種于150mlbmgy培養(yǎng)基中，28℃，230rpm振蕩培養(yǎng)24h；3)直至菌液發(fā)白，od600在2.0～6.0之間，23℃，2000g離心5min，棄上清收集細(xì)胞；4)加入等體積bmmy重懸細(xì)胞，28℃，230rpm振蕩培養(yǎng)24h誘導(dǎo)表達(dá)，4℃，5000g離心10min，收集培養(yǎng)液上清。2.上柱前樣品的制備4℃離心，收集誘導(dǎo)表達(dá)1l菌液的上清，透析緩沖液液透析3次，離心收集上清液和用于純化的溶液經(jīng)0.45μm膜過(guò)濾后備用。3.親和層析柱純化1)運(yùn)行電腦與純化儀，直到純化儀指示燈不閃為止，用注射器對(duì)泵軟管道進(jìn)行排氣；1)洗泵：用milliq水清洗預(yù)裝柱(histraptmffcrude5ml)15ml；2)柱平衡：溶液c平衡histrap層析柱15ml；3)上樣：以2ml/min的流速上柱，待曲線走勢(shì)平穩(wěn)后收集流穿樣品；4)洗脫未結(jié)合蛋白：用15ml的溶液a洗脫未結(jié)合蛋白；5)洗脫并收集目的蛋白：目的蛋白用溶液a與溶液b各50％來(lái)洗脫并收集，取少量進(jìn)行sds-page電泳鑒定；6)沖洗：用100％溶液b15ml沖洗histrap層析柱，主要是除去高濃度的雜蛋白；7)保存：用15ml超純水洗泵，并保存在經(jīng)過(guò)濾除菌的20％乙醇中。其中，溶液a：稱量2.922g氯化鈉、0.6808g咪唑、6.67g十二水和磷酸氫二鈉以及0.212g二水磷酸二氫鈉混溶于蒸餾水并定容至1l，ph為8.5，0.45μm濾膜后4℃保存。溶液b：稱量29.22g氯化鈉、68.08g咪唑、6.66g十二水和磷酸氫二鈉以及0.212g二水磷酸二氫鈉混溶于蒸餾水并定容至1l，ph為8.5，0.45μm濾膜后4℃保存。4.純化后蛋白的透析脫鹽將洗脫下的目的蛋白放入透析袋透析，4℃透析3次，每8h更換一次，換pbs緩沖液透析2次，最后從透析袋中取出蛋白樣品，酶標(biāo)儀測(cè)定蛋白濃度后4℃保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)結(jié)果：重組畢赤酵母hdhtpx2在bmmy中誘導(dǎo)表達(dá)24h后，離心收集上清，取少量進(jìn)行sds-page電泳分析。結(jié)果表明hdhtpx2在純化后得到清晰的條帶。重組畢赤酵母hdhtpx2在bmmy中誘導(dǎo)表達(dá)24h后，4℃離心收集上清，用磷酸緩沖液透析上清3次，離心收集上清，經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾，上柱純化備用。利用鎳離子螯合親和層析柱親和純化的原理，tpx2能特異性與鎳離子螯合親和層析柱結(jié)合，而雜蛋白不能結(jié)合在鎳離子螯合親和層析柱上，根據(jù)280nm檢測(cè)紫外吸收曲線，判斷流出組分為雜蛋白，洗脫組分為螯合目的蛋白tpx2。對(duì)純化前和純化后的蛋白進(jìn)行sds-page電泳分析，電泳分析結(jié)果如圖5所示，其中，圖5中m為預(yù)染蛋白marker26614，標(biāo)號(hào)1為純化前hdhtpx2蛋白的表達(dá)條帶，標(biāo)號(hào)2為純化后hdhtpx2蛋白的表達(dá)條帶，蛋白經(jīng)過(guò)純化，呈現(xiàn)出清晰的條帶。接下來(lái)，發(fā)明人通過(guò)bradford法測(cè)定純化后的重組表達(dá)產(chǎn)物tpx2的濃度，測(cè)定重組表達(dá)產(chǎn)物清除羥自由基的能力及其對(duì)h2o2的還原作用進(jìn)行了研究。以期獲得活性好，穩(wěn)定性高的重組表達(dá)蛋白，為以后作為抗病原微生物新藥物和食品添加劑等的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。其中bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒、總超氧化物歧化酶(t-sod)測(cè)試盒(羥胺法)、羥自由基測(cè)定試劑盒均購(gòu)自于南京建成生物工程研究所。實(shí)施例4重組表達(dá)產(chǎn)物hdhtpx2活性的測(cè)定1.應(yīng)用bradford法測(cè)定重組表達(dá)產(chǎn)物hdhtpx2的濃度按照bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)操作如下:蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的制備：將10μl蛋白標(biāo)準(zhǔn)品10倍稀釋，使終濃度達(dá)到為0.5mg/ml。蛋白濃度的測(cè)定：1)將標(biāo)準(zhǔn)品按0、1、2、8、12、16、20μl稀釋至20μl，相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml。2)加入200μlg250染色液，室溫放置5min。3)測(cè)定a595nm制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。4)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用bradford法測(cè)定bsa標(biāo)準(zhǔn)品得到的蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算公式為y＝0.9672x+0.5501，r2＝0.9965，計(jì)算得到tpx2蛋白純品的濃度為13.9mg/l。2.重組表達(dá)產(chǎn)物hdhtpx2對(duì)羥自由基的清除作用按照羥自由基測(cè)定試劑盒(貨號(hào)：a018，廠家：南京建成生物工程研究所)說(shuō)明書(shū)中的描述測(cè)定重組表達(dá)產(chǎn)物hdhtpx2清除羥自由基能力，用維生素c(vc)做陽(yáng)性對(duì)照，其原理是在接受電子受體后通過(guò)顯色情況來(lái)說(shuō)明oh量的多少，顏色越深oh量越多。結(jié)果如圖6和圖7所示，隨著tpx2蛋白濃度的增大，tpx2蛋白對(duì)羥自由基清除率也增大(圖7)，tpx蛋白對(duì)羥自由基50％清除率的濃度為0.028mg/ml。用vc做陽(yáng)性對(duì)照，隨著vc濃度的增大，vc對(duì)羥自由基清除率呈上升趨勢(shì)(圖8)。vc對(duì)羥自由基的50％清除率的濃度為0.25mg/ml，與tpx2蛋白比較，tpx2蛋白對(duì)羥自由基的清除能力比vc強(qiáng)，約是vc的9倍。本發(fā)明根據(jù)皺紋盤(pán)鮑hdhtpx2的cdna序列特征，構(gòu)建真核重組表達(dá)載體ppic9k-hdhtpx2，sacⅰ線性化后，轉(zhuǎn)化畢赤酵母gs115菌株，誘導(dǎo)表達(dá)并純化獲得hdhtpx2的重組蛋白，鑒定重組蛋白抗氧化活性，研究發(fā)現(xiàn)hdhtpx2蛋白具有清除羥自由基的活性。本發(fā)明旨在獲得皺紋盤(pán)鮑hdhtpx2的基因工程表達(dá)產(chǎn)品，并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定，以期開(kāi)發(fā)抗病原微生物的新藥物或作為動(dòng)物飼料添加劑使用。本發(fā)明獲得了皺紋盤(pán)鮑hdhtpx2的畢赤酵母表達(dá)重組子ppic9k-hdhtpx2，并在畢赤酵母中成功重組表達(dá)獲得皺紋盤(pán)鮑hdhtpx2基因工程產(chǎn)品，確認(rèn)了hdhtpx2的抗氧化活性，為其作為抗病原微生物新藥物和動(dòng)物飼料添加劑的開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明進(jìn)一步研究了通過(guò)本發(fā)明記載的方法得到的皺紋盤(pán)鮑hdhtpx2的安全性評(píng)價(jià)以及對(duì)h2o2引起的細(xì)胞過(guò)氧化損傷的修復(fù)功能評(píng)價(jià)。通過(guò)細(xì)胞水平的安全性評(píng)價(jià)結(jié)果，本領(lǐng)域技術(shù)人員有理由相信，通過(guò)本發(fā)明得到的tpx2蛋白可以用作制備藥物，通過(guò)對(duì)細(xì)胞過(guò)氧化損傷的修復(fù)評(píng)價(jià)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以將本發(fā)明制備得到的tpx2蛋白用作動(dòng)物飼料添加劑，并為后續(xù)的應(yīng)用奠定良好的基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)中用到的主要試劑及主要耗材如下：dpbs/modified購(gòu)自hyclone公司；trypsin-edtasolution購(gòu)自bbilifesciences公司；胎牛血清和雙抗購(gòu)自gibco公司；細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑mts及pms購(gòu)自sigma公司其中，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中用到的主要儀器設(shè)備如下：二氧化碳培養(yǎng)箱(galaxy170)購(gòu)自eppendorf公司；光學(xué)倒置顯微鏡(dfc450c)購(gòu)自leica公司；恒溫金屬浴(chb-t2-b)購(gòu)自thermoq公司；酶標(biāo)儀(infinite200pro)購(gòu)自tecan公司。實(shí)施例5重組表達(dá)產(chǎn)物hdhtpx2安全性評(píng)價(jià)1.hdhtpx2對(duì)l929和l02細(xì)胞活性的影響采用mts/pms法測(cè)定細(xì)胞活性：將細(xì)胞培養(yǎng)消化后，種板。然后在含10％fbs及1％p/s的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察。將培養(yǎng)基吸出，加入新的無(wú)fbs的培養(yǎng)基，100μl/孔，饑餓細(xì)胞12-16h。將原有的無(wú)fbs培養(yǎng)基從l929細(xì)胞和l02細(xì)胞中吸出棄掉，加入新的無(wú)fbs培養(yǎng)基，100μl/孔。向l929細(xì)胞和l02細(xì)胞加入用無(wú)fbs培養(yǎng)基稀釋的不同濃度的tpx2蛋白，分別為：0μg/μl、6.25μg/μl、12.5μg/μl、25μg/μl、50μg/μl、100μg/μl，并添加等體積的無(wú)fbs培養(yǎng)基作空白對(duì)照，置于37℃，含5％co2濃度的培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)24h觀察；棄掉原有的無(wú)fbs培養(yǎng)基，加入120μl/孔的細(xì)胞增殖工作液，將培養(yǎng)板避光放入37℃含5％co2濃度的恒溫培養(yǎng)箱中孵育45min，然后利用酶標(biāo)儀測(cè)定490nm吸光值。(1)hdhtpx2對(duì)l929細(xì)胞活性的影響利用l929細(xì)胞檢測(cè)重組蛋白對(duì)于正常細(xì)胞的毒性作用。l929細(xì)胞是小鼠成纖維細(xì)胞，該成纖維細(xì)胞是疏松結(jié)締組織的主要細(xì)胞成分，細(xì)胞成梭形或者扁的星狀，具有突起，可作為皮膚細(xì)胞研究模型通過(guò)檢測(cè)重組蛋白對(duì)于l929細(xì)胞的毒性，評(píng)價(jià)對(duì)于皮膚細(xì)胞的毒性和保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，分別制備不同濃度的hdhtpx蛋白溶液，然后分別加入到培養(yǎng)好l929細(xì)胞(其中l(wèi)929細(xì)胞購(gòu)自于上海微蒙酶聯(lián)試劑公司)在37℃，5％的co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，使得孵育溶液中蛋白濃度分別為0，6.25μg/ml，12.5μg/ml，25μg/ml，50μg/ml以及100μg/ml。共同孵育24h后測(cè)定細(xì)胞成活率。圖8結(jié)果表明，不同濃度的hdhtpx2蛋白加入l929細(xì)胞共孵24h后，hdhtpx2蛋白對(duì)于l929細(xì)胞活性沒(méi)有毒害作用。(2)hdhtpx2對(duì)l02細(xì)胞活性的影響利用l02細(xì)胞(人正常肝臟細(xì)胞)檢測(cè)重組蛋白對(duì)于正常細(xì)胞的毒性作用。l02細(xì)胞是人體正常的肝臟細(xì)胞。通過(guò)檢測(cè)重組蛋白對(duì)于l02細(xì)胞的毒性，可以用來(lái)評(píng)價(jià)重組蛋白的肝臟毒性。分別制備不同濃度的hdhtpx2蛋白溶液，然后分別加入到培養(yǎng)好的l02細(xì)胞(其中l(wèi)02細(xì)胞購(gòu)自于中山大學(xué))在37℃，5％的co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，使得孵育溶液中蛋白濃度分別為0，12.5μg/ml，25μg/ml，50μg/ml以及100μg/ml。共同孵育24h后測(cè)定細(xì)胞成活率。圖9結(jié)果表明，tpx2蛋白對(duì)l02細(xì)胞沒(méi)有毒害作用。2.重組表達(dá)產(chǎn)物tpx2蛋白的溶血性實(shí)驗(yàn)為了驗(yàn)證通過(guò)本發(fā)明制備得到的hdhtpx2蛋白在動(dòng)物飼料添加劑領(lǐng)域中的應(yīng)用。將本發(fā)明制備得到的hdhtpx2蛋白與馬血進(jìn)行溶血實(shí)驗(yàn)。利用pbs溶液配制不同濃度的hdhtpx2蛋白，然后將等量的hdhtpx2蛋白與等量的4％的馬血(購(gòu)自索萊寶)混合，使得hdhtpx2蛋白在復(fù)合溶液中的濃度分別為6.125μg/ml，11.25μg/ml，22.5μg/ml，45μg/ml，90μg/ml，180μg/ml，360μg/ml，以及720μg/ml。37℃靜置培養(yǎng)2h，之后用900g離心5min。取出200μl于96孔板上，用500nm的波長(zhǎng)檢測(cè)。分別用1％tritonx-100和pbs作為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析與對(duì)照組間均無(wú)顯著性差異，溶血率計(jì)算公式如下，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖10。溶血率(％)＝(樣品吸收-陰性對(duì)照吸收)/(陽(yáng)性對(duì)照吸收-陰性對(duì)照吸收)×100％。結(jié)果如圖9所示，隨著tpx2蛋白濃度的增大，馬血發(fā)生溶血均低于10％。在最大濃度為720μg/ml時(shí)，該蛋白不會(huì)引起馬血細(xì)胞的溶血。實(shí)施例6重組表達(dá)產(chǎn)物hdhtpx2對(duì)h2o2引起的細(xì)胞損傷的修復(fù)采用mts/pms法測(cè)定經(jīng)過(guò)h2o2稀釋的hdhtpx2蛋白對(duì)于細(xì)胞活性的影響：將細(xì)胞培養(yǎng)消化后，種板。然后在含10％fbs及1％p/s的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察。將培養(yǎng)基吸出，加入新的無(wú)fbs的培養(yǎng)基，100μl/孔，饑餓細(xì)胞12-16h。將原有的無(wú)fbs培養(yǎng)基從l929細(xì)胞和l02細(xì)胞中吸出棄掉，加入新的無(wú)fbs培養(yǎng)基，100μl/孔。向l929細(xì)胞和l02細(xì)胞加入用h2o2稀釋的不同濃度的hdhtpx2蛋白，分別為：0μg/μl、6.25μg/μl、12.5μg/μl、25μg/μl、50μg/μl、100μg/μl。同時(shí)以加入等體積的無(wú)fbs的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，置于37℃，含5％co2濃度的培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)3h觀察；棄掉原有的無(wú)fbs培養(yǎng)基，加入120μl/孔的細(xì)胞增殖工作液，將培養(yǎng)板避光放入37℃含5％co2濃度的恒溫培養(yǎng)箱中孵育45min，然后利用酶標(biāo)儀測(cè)定490nm吸光值。1.hdhtpx2對(duì)h2o2引起的l929細(xì)胞損傷的保護(hù)作用采用mts/pms法測(cè)定tpx2對(duì)l929細(xì)胞增殖的影響，設(shè)置6個(gè)孔做平行樣對(duì)照，并重復(fù)三次試驗(yàn)。以空白組為100％設(shè)置為對(duì)照值并與測(cè)定組比較。當(dāng)tpx2作用l929細(xì)胞并與h2o2共孵3h時(shí)，tpx2蛋白能夠保護(hù)l929細(xì)胞免受h2o2的損傷(圖11)。該實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了tpx2蛋白對(duì)l929細(xì)胞具有一定的抗氧化保護(hù)作用。2.hdhtpx2對(duì)h2o2引起的l02細(xì)胞損傷的保護(hù)作用用mts/pms法測(cè)定tpx2對(duì)l02細(xì)胞的增殖的影響，設(shè)置6個(gè)孔做平行樣對(duì)照，并重復(fù)三次試驗(yàn)。以空白組為100％設(shè)置為對(duì)照值并與測(cè)定組比較。當(dāng)tpx2作用l02細(xì)胞并與h2o2共孵3h時(shí)，tpx2蛋白能夠保護(hù)l02細(xì)胞免受h2o2的損傷(圖12)。該實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了tpx2蛋白對(duì)l02細(xì)胞具有一定的抗氧化保護(hù)作用。通過(guò)本發(fā)明的方法制備得到的hdhtpx2蛋白在濃度為0-100μg/ml范圍內(nèi)，對(duì)于l929細(xì)胞和l02細(xì)胞均未表現(xiàn)出細(xì)胞毒性。通過(guò)本發(fā)明的方法制備得到的hdhtpx2蛋白在濃度為0-720μg/ml范圍內(nèi)，未與馬血發(fā)生溶血現(xiàn)象，溶血率均小于10％。通過(guò)本發(fā)明的方法制備得到的hdhtpx2蛋白在濃度為0-100μg/ml范圍內(nèi)，對(duì)于過(guò)氧化氫引起的細(xì)胞損傷起到保護(hù)和修復(fù)作用?？傊?，通過(guò)本發(fā)明制備得到的hdhtpx2蛋白不僅表現(xiàn)出良好的酶活特性，而且在細(xì)胞水平表現(xiàn)出良好的安全性，同時(shí)未表現(xiàn)出溶血現(xiàn)象，可以將其作為動(dòng)物飼料添加劑使用。而且能夠?qū)τ趆2o2引起的細(xì)胞損傷起到保護(hù)和修復(fù)作用，具有優(yōu)良的生物學(xué)活性。以上所述，僅是本發(fā)明實(shí)施的較佳實(shí)施例，并非對(duì)本發(fā)明做任何形式上的限制，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所做的修改、等同替換和改進(jìn)等，均需要包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。sequencelisting<110>福建省水產(chǎn)研究所<120>皺紋盤(pán)鮑硫氧還蛋白過(guò)氧化酶及其制備方法和應(yīng)用<130>oicn170030<160>4<170>patentinversion3.3<210>1<211>594<212>dna<213>皺紋盤(pán)鮑（haliotisdiscushannai）hdhtpx2序列<400>1gcccaagtcggaaacctccaattgacaaaacctgcccctgaattcagtgcaaaggctatt60gtcaatggtgaattcaaagatgtcaaactgtcagactacagagggaaatatgttgtctta120tttttctaccctctagacttcacgtttgtctgcccaacagaaattattgcattcagcgat180cggtctgaagagttcaaaagcatcaactgtgaggtccttggatgttcaacagacagtgtg240tactcacatctagcatggatcaacaccccgaggaagcagggtggtcttggcaacatgaag300attcctctcctggcagacaagacaatggagatttcccgaaaatatggctgtctgaaggaa360gacgaaggagttgcattcagaggacttttcatcattgatgacaaggccaacctgcgccag420atcaccattaacgacctccctgttggacgctcagtggatgagaccctcagacttgttcag480gcattccagttcactgacaagcacggagaagtttgtcctgctggatggaaaccaggcgca540gacaccatgaagcccgaccccaagggcagccagaactacttctccaaggtcaac594<210>2<211>198<212>prt<213>皺紋盤(pán)鮑（haliotisdiscushannai）hdhtpx2氨基酸序列<400>2alaglnvalglyasnleuglnleuthrlysproalaproglupheser151015alalysalailevalasnglygluphelysaspvallysleuserasp202530tyrargglylystyrvalvalleuphephetyrproleuaspphethr354045phevalcysprothrgluileilealapheseraspargsergluglu505560phelysserileasncysgluvalleuglycysserthraspserval65707580tyrserhisleualatrpileasnthrproarglysglnglyglyleu859095glyasnmetlysileproleuleualaasplysthrmetgluileser100105110arglystyrglycysleulysgluaspgluglyvalalaphearggly115120125leupheileileaspasplysalaasnleuargglnilethrileasn130135140aspleuprovalglyargservalaspgluthrleuargleuvalgln145150155160alapheglnphethrasplyshisglygluvalcysproalaglytrp165170175lysproglyalaaspthrmetlysproaspprolysglyserglnasn180185190tyrpheserlysvalasn195<210>3<211>28<212>dna<213>人工序列<400>3catgtacgtagcccaagtcggaaacctc28<210>4<211>47<212>dna<213>人工序列<400>4atgcggccgctcaatggtgatggtgatgatggttgaccttggagaag47當(dāng)前第1頁(yè)12