本發(fā)明涉及一種生產乙醇的方法，特別涉及一種酵母高密度發(fā)酵耦合同步糖化發(fā)酵生產乙醇的方法，屬于生物工程和能源領域。

背景技術：

化石能源逐漸枯竭將影響世界能源供應，解決此問題的關鍵在于開發(fā)可再生能源。以木質纖維素為原料，高效地生產清潔燃料，如乙醇、丙醇、丁醇等，可以在一定程度上減少人類對化石能源的依賴。

過去，利用木質纖維素發(fā)酵生產乙醇，要先將木質纖維素糖化后，再對糖化后含單糖的水解液進行發(fā)酵，這種方式稱為分步糖化發(fā)酵。分步糖化發(fā)酵的缺點是纖維素酶催化纖維素水解反應是一個可逆反應，而單糖的積累使得酶解反應受到抑制，纖維素水解不充分。另外，發(fā)酵時，由于單糖濃度過高會使得發(fā)酵被抑制。為了防止酶解過程中糖積累抑制酶解，提高纖維素酶的催化水解效率，后來，人們提出了同步糖化發(fā)酵方式。同步糖化發(fā)酵是指木質纖維素糖化和發(fā)酵生產乙醇同時進行，在同步糖化發(fā)酵過程中，酶解產生的單糖被酵母同步轉化。在同步糖化發(fā)酵過程中單糖濃度一直保持在較低水平。這樣，可以消除高濃度單糖對酶解的抑制作用。其中，李榮杰等在“一種利用秸稈發(fā)酵生產乙醇的方法”的專利中，提供了一種木質纖維素同步糖化、異構化發(fā)酵生產乙醇的方法。他們用稀酸或堿溶液對秸稈進行預處理，然后將預處理秸稈放入發(fā)酵罐中，加入酶制劑，利用纖維素酶、木聚糖酶和木糖異構酶預水解秸稈，之后，按15％接種量接種od600為6的釀酒酵母種子液，進行同步糖化發(fā)酵，最終，乙醇的產率為53.2％(cn101705255a)；魯杰等在“利用木質纖維素分批補料半同步糖化發(fā)酵制備乙醇的方法”的專利中，先將木質纖維素進行預處理，將預處理木質纖維素、纖維素酶液加入到錐形瓶，搖床振蕩預水解，之后，降溫，加入活化后的酵母液，同步糖化發(fā)酵，所得的乙醇的產率最高為79.1％(cn103074385a)。

同步糖化發(fā)酵實質上是一個將木質纖維素酶解成單糖和單糖發(fā)酵成乙醇的級聯(lián)反應。對于提高木質纖維素酶解效率的研究很多，主要方法是通過復配纖維素酶以及增加酶的使用量來提高酶解效率(陳朝儒，奚亞軍。甜高粱莖汁及莖渣同步糖化發(fā)酵工藝優(yōu)化。2016，32(3)：253-258；羅鵬。蒸汽爆破麥草同步糖化發(fā)酵轉化乙醇的研究。2007，35(12)：42-45；張偉。小麥秸稈同步糖化發(fā)酵制取燃料乙醇。2012，38(12)：50-54)，而對于酵母發(fā)酵單糖生產乙醇效率方面的研究則長期被忽視。在傳統(tǒng)同步糖化發(fā)酵過程中，利用木質纖維素作為底物同步糖化發(fā)酵生產乙醇，由于酵母量低，致使酵母利用葡萄糖生產乙醇速率低，延長了發(fā)酵時間，使得生產成本增加。提高同步糖化發(fā)酵體系中初始酵母量，以提高單糖發(fā)酵成乙醇速率方面的研究，在國內外尚屬空白。

另外，在傳統(tǒng)的同步糖化發(fā)酵過程中，生產酵母種子液和同步糖化發(fā)酵分別在兩個生物反應器中進行。一般地，在一個生物反應器中生產酵母種子液后，將酵母接種到另外一個生物反應器中進行同步糖化發(fā)酵。而在這種方式中，由于使用兩個生物反應器，因此生產成本較高。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是在于解決同步糖化發(fā)酵過程中酵母量不足的問題，提出在生物反應器中，先在好氧條件下高密度發(fā)酵生產酵母，然后向生物反應器中添加木質纖維素和酶制劑，在厭氧條件下同步糖化發(fā)酵生產乙醇的方法。采用本方法，乙醇產率大幅度提高，發(fā)酵時間大幅度縮短。

本發(fā)明的另一個目的是針對傳統(tǒng)同步糖化發(fā)酵方式的不足，即生產酵母種子液與同步糖化發(fā)酵分別在兩個生物反應器中進行。使用兩個生物反應器，成本高，過程繁瑣。而采用本發(fā)明，培養(yǎng)酵母種子液和同步糖化發(fā)酵在一個生物反應器中完成，減少了設備投資，提高了生產效率。

本發(fā)明提供了一種酵母高密度發(fā)酵耦合同步糖化發(fā)酵制備乙醇的方法(見圖1)，所述方法包括如下步驟：

①酵母高密度發(fā)酵

向生物反應器中加入含有10-100克/升葡萄糖的培養(yǎng)基，滅菌后，按2％-10％接種量接種酵母。通氣，28-37℃發(fā)酵培養(yǎng)酵母，當培養(yǎng)基中葡萄糖濃度降低到2克/升以下后，流加50-800克/升的葡萄糖溶液，高密度發(fā)酵生產酵母。

②同步糖化發(fā)酵

當發(fā)酵液中酵母濃度達到5-150克干重/升后，向發(fā)酵液中加入10-300克木質纖維素/(升發(fā)酵液)以及酶制劑。停止通氣，進行厭氧同步糖化發(fā)酵，發(fā)酵12-144小時，生產乙醇。

本發(fā)明所述通氣為通入空氣或氧氣。

本發(fā)明所述葡萄糖是商品葡萄糖或由木質纖維素水解所得的葡萄糖水解液。

本發(fā)明所述木質纖維素為秸稈、木片、稻草、棉花、紙漿、蘆葦、微晶纖維素或羧甲基纖維素的一種或多種。

本發(fā)明所述酶制劑含有5-100iu纖維素酶/(克纖維素)，5-300u木聚糖酶/(克纖維素)，1-300u果膠酶/(克纖維素)，1-300uβ-葡萄糖苷酶/(克纖維素)。

本發(fā)明的有益效果是采用酵母高密度發(fā)酵耦合同步糖化發(fā)酵生產乙醇的方法，乙醇產率達到理論產率的99％以上，乙醇峰值時間從傳統(tǒng)同步糖化發(fā)酵的72小時提前到24小時，極大地縮短了發(fā)酵時間。而且，在本發(fā)明中，將生產酵母種子液和同步糖化發(fā)酵生產乙醇在一個生物反應器中進行，減少了生產環(huán)節(jié)，降低了生產成本。

附圖說明：

圖1為酵母高密度發(fā)酵耦合同步糖化發(fā)酵生產乙醇與傳統(tǒng)同步糖化發(fā)酵工藝的比較圖

具體實施方式：

下述非限制性實施例可以使本領域的普通技術人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。

下述實施例和對比例中，所使用試劑制備方法如下：

1、本實施例所用培養(yǎng)基為每升含有：酵母粉10克，蛋白胨20克。

2、本實施例所用木質纖維素為玉米秸稈。

3、本實施例所用酵母為哈爾濱馬利酵母有限公司生產的酵母。

實施例1：

一種酵母高密度發(fā)酵耦合同步糖化發(fā)酵生產乙醇的方法，所述方法包括如下步驟：

1)酵母高密度發(fā)酵

向生物反應器中加入含有10克/升葡萄糖的培養(yǎng)基，滅菌后，按5％接種量接種酵母。通氣，28℃發(fā)酵培養(yǎng)酵母，當培養(yǎng)基中葡萄糖濃度降低到1克/升后，流加500克/升的葡萄糖溶液，高密度發(fā)酵生產酵母。

2)同步糖化發(fā)酵

當發(fā)酵液中酵母濃度達到30克干重/升后，向發(fā)酵液中加入3％纖維素含量的秸稈，15fpu/(克纖維素)的纖維素酶，10u/(克纖維素)的木聚糖酶，5u/(克纖維素)果膠酶和30u/(克纖維素)的β-葡萄糖苷酶。停止通氣，進行厭氧同步糖化發(fā)酵。在發(fā)酵24小時后，乙醇濃度達到最大16.81g/l，相當于理論產率的99％。

實施例2：

一種酵母高密度發(fā)酵耦合同步糖化發(fā)酵生產乙醇的方法，所述方法包括如下步驟：

1)酵母高密度發(fā)酵

向生物反應器中加入含有20克/升葡萄糖的培養(yǎng)基，滅菌后，按10％接種量接種酵母。通氣，30℃發(fā)酵培養(yǎng)酵母，當培養(yǎng)基中葡萄糖濃度降低到1克/升后，流加600克/升的葡萄糖溶液，高密度發(fā)酵生產酵母。

2)同步糖化發(fā)酵

當發(fā)酵液中酵母濃度達到35克干重/升后，向發(fā)酵液中加入3％纖維素含量的秸稈、25fpu/(克纖維素)的纖維素酶，50u/(克纖維素)的木聚糖酶，20u/(克纖維素)果膠酶和50u/(克纖維素)的β-葡萄糖苷酶。停止通氣，進行厭氧同步糖化發(fā)酵。在發(fā)酵24小時后，乙醇濃度達到最大16.98g/l，相當于理論產率的100％。

實施例3：

一種酵母高密度發(fā)酵耦合同步糖化發(fā)酵生產乙醇的方法，所述方法包括如下步驟：

1)酵母高密度發(fā)酵

向生物反應器中加入終濃度為10克/升葡萄糖的秸稈水解液和培養(yǎng)基，滅菌后，按5％接種量接種酵母。通氣，30℃發(fā)酵培養(yǎng)酵母，當培養(yǎng)基中葡萄糖濃度降低到1克/升后，流加500克/升的葡萄糖溶液，高密度發(fā)酵生產酵母。

2)同步糖化發(fā)酵

當發(fā)酵液中酵母濃度達到40克干重/升后，向發(fā)酵液中加入3％纖維素含量的秸稈，15fpu/(克纖維素)的纖維素酶，10u/(克纖維素)的木聚糖酶，5u/(克纖維素)果膠酶和30u/(克纖維素)的β-葡萄糖苷酶。停止通氣，進行厭氧同步糖化發(fā)酵。在發(fā)酵24小時后，乙醇濃度達到最大16.98g/l，相當于理論產率的100％。

對比例1：

一種傳統(tǒng)同步糖化發(fā)酵生產乙醇的方法，所述方法包括如下步驟：

(1)將酵母按5％接種量接種到生物反應器a中，28℃培養(yǎng)酵母，生產酵母種子液。

(2)向生物反應器b中加入3％纖維素含量的秸稈，15fpu/(克纖維素)的纖維素酶，10u/(克纖維素)的木聚糖酶，5u/(克纖維素)果膠酶，30u/(克纖維素)的β-葡萄糖苷酶和ph5.0檸檬酸緩沖液。從生物反應器a中取酵母種子液，按10％接種量接種到生物反應器b中，酵母濃度為1克干重/升。進行厭氧同步糖化發(fā)酵。在發(fā)酵72小時后，乙醇濃度達到最大11.01g/l，相當于理論產率的65％。

結論：

由實施例1和對比例1的結果可以看出，與傳統(tǒng)同步糖化發(fā)酵生產乙醇相比，采用高密度發(fā)酵耦合同步糖化發(fā)酵明顯地增加了乙醇的濃度，使得乙醇濃度增加了34％。此外，采用高密度發(fā)酵耦合同步糖化發(fā)酵使得產乙醇的峰值時間由傳統(tǒng)同步糖化發(fā)酵的72h提前到24h，明顯地縮短了發(fā)酵時間。

對比例2：

一種傳統(tǒng)同步糖化發(fā)酵生產乙醇的方法，所述方法包括如下步驟：

(1)將酵母按5％接種量接種到生物反應器a中，30℃培養(yǎng)酵母，生產酵母種子液。

(2)向生物反應器b中加入3％纖維素含量的秸稈、25fpu/(克纖維素)的纖維素酶，50u/(克纖維素)的木聚糖酶，20u/(克纖維素)果膠酶，50u/(克纖維素)的β-葡萄糖苷酶和ph5.0檸檬酸緩沖液。從生物反應器a中取酵母種子液，按10％接種量接種到生物反應器b中，酵母濃度為1克干重/升。進行厭氧同步糖化發(fā)酵。在發(fā)酵72小時后，乙醇濃度達到最大13.12g/l，相當于理論產率的77％。

由實施例2和對比例2的結果可以看出，與傳統(tǒng)同步糖化發(fā)酵生產乙醇相比，采用高密度發(fā)酵耦合同步糖化發(fā)酵明顯地增加了乙醇的濃度，使得乙醇濃度增加了23％。此外，采用高密度發(fā)酵耦合同步糖化發(fā)酵使得產乙醇的峰值時間由傳統(tǒng)同步糖化發(fā)酵的72h提前到24h，明顯地縮短了發(fā)酵時間。