本發(fā)明屬于腫瘤標志物領(lǐng)域，特別涉及一種胃癌分子標志物hsa_circ_0000705及其應用。

背景技術(shù)：

隨著高通量全基因組測序技術(shù)的普遍應用，人們驚奇地發(fā)現(xiàn)哺乳動物細胞中約98％的轉(zhuǎn)錄物為非編碼rna分子(noncodingrna,ncrna)。在這些非編碼rna分子中有包括目前人們所熟知的“看家(housekeeping)”非編碼rna(如transferrnas和ribosomalrnas等)、小非編碼rna(如micrornas和pirnas等)、長鏈非編碼rna(longnoncodingrna,lncrna)，而更多的則是尚待深入研究的環(huán)狀rna(circularrna,circrna)分子。

circrna是指一類由前體rna經(jīng)可變剪接產(chǎn)生、并以5'末端和3'末端反向共價鍵結(jié)合的內(nèi)源性環(huán)狀rna分子。國內(nèi)外初步研究結(jié)果顯示circrna是一類具有重要生物學功能的新型rna分子，它可通過與rna或蛋白質(zhì)相互作用，在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后多個水平參與基因表達調(diào)控。同時由于circrna序列高度保守，性質(zhì)穩(wěn)定，不易被核酸外切酶降解，并且具有組織、時序和疾病相對特異性，所以circrna具備成為臨床疾病精準診斷分子標志物的潛質(zhì)。

胃癌是世界最常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在所有惡性腫瘤中居第4位，死亡率排第2位。在我國，每年新發(fā)胃癌患者高達40萬，居世界首位；死亡人數(shù)30萬，占全球因胃癌死亡人數(shù)一半。胃癌的早期診斷是全球性的研究熱點，也是研究的難點。長期臨床實踐證明胃癌篩查是早期發(fā)現(xiàn)并診斷胃癌的有效辦法。然而遺憾的是，即使是目前臨床最先進的物理檢測手段(如：ct、核磁共振等)發(fā)現(xiàn)腫瘤的極限直徑僅為1cm，而常用腫瘤標志物的靈敏度和特異度亦不夠理想，如癌胚抗原(carcinoembryonicantigen，cea)篩查胃癌的靈敏度和特異性分別僅為36.0％和86.2％。因此，結(jié)合臨床成本效益原則，開發(fā)新型腫瘤標志物尤其是針對早期胃癌精準診斷分子標志物對于提高胃癌診斷率具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種胃癌分子標志物hsa_circ_0000705及其應用，該分子標志物具有極好的胃癌組織特異性和胃癌相關(guān)性，并且可通過rt-pcr方法實現(xiàn)定量檢測，為早期胃癌的發(fā)現(xiàn)和檢測提供了新的分子標志物，對進一步提高當前胃癌診治水平，具有一定的意義。

本發(fā)明提供了一種胃癌分子標志物hsa_circ_0000705，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

所述hsa_circ_0000705定位于人16號染色體58593707～58594266區(qū)域，由cnot1基因轉(zhuǎn)錄后經(jīng)剪切形成。hsa_circ_0000705本質(zhì)上是一種環(huán)狀rna分子。本發(fā)明利用消化內(nèi)科放大胃鏡、細胞顯微切割、circrna芯片技術(shù)檢測并比較了3對胃癌組織與癌旁組織circrna表達譜的差異，其中環(huán)狀rnahsa_circ_0000705在胃癌組織中顯著低表達。

用于所述hsa_circ_0000705檢測的特異性pcr反向引物為：

上游序列為5’-taactggggctcttcagctc-3’；

下游序列為5’-tggtggttgtctggccttat-3’。通過對該引物的pcr產(chǎn)物測序，驗證了引物擴增的特異性。

所述hsa_circ_0000705在胃癌前病變組織及胃癌組織中低表達。

本發(fā)明還提供了一種胃癌分子標志物hsa_circ_0000705的應用，應用于研究胃癌組織的表達情況。

本發(fā)明借助樣本rna提取、rna質(zhì)量鑒定與目標的定量rt-pcr檢測方法，大樣本驗證hsa_circ_0000705在胃癌組織表達情況，hsa_circ_0000705在79.2％胃癌患者癌組織中顯著低表達。進一步大樣本檢測并橫向比較hsa_circ_0000705分子在健康人胃組織、良性胃病變(胃潰瘍、胃炎)組織、胃癌前病變(異型增生)組織及各期胃癌組織中的水平及其變化規(guī)律，最終鑒定出hsa_circ_0000705只在胃癌前病變(異型增生)組織及胃癌組織中低表達，具有極好的胃癌組織特異性。

本發(fā)明通過構(gòu)建受試者工作特征(roc)曲線證明胃癌組織hsa_circ_0000705具有良好的敏感性與特異性。hsa_circ_0000705的roc曲線下面積為0.719(95％ci,0.648-0.791)。當其截斷值為9.125，敏感性和特異性分別為64.58％和69.79％(均超過現(xiàn)有胃癌標志物cea、ca19-9水平)。結(jié)合腫瘤臨床病理因素，本發(fā)明證明胃癌組織中hsa_circ_0000705的表達水平與腫瘤階段、borrmann分型、病理類型和組織ca19-9表達密切相關(guān)。本發(fā)明通過上述研究證明hsa_circ_0000705具有極好的胃癌相關(guān)性。

有益效果

本發(fā)明應用circrna芯片、定量pcr檢測等技術(shù)，確認hsa_circ_0000705只在胃癌前病變(異型增生)組織及胃癌組織中低表達，具有極好的胃癌組織特異性和胃癌相關(guān)性，并且可通過rt-pcr方法實現(xiàn)定量檢測，為早期胃癌的發(fā)現(xiàn)和檢測提供了新的分子標志物，對進一步提高當前胃癌診治水平具有一定的意義。

附圖說明

圖1為hsa_circ_0000705的pcr產(chǎn)物測序圖；

圖2為兩個組織標本中hsa_circ_0000705的擴增曲線圖；

圖3為兩個組織標本中hsa_circ_0000705的解鏈曲線圖；

圖4為兩個組織標本中g(shù)apdh的擴增曲線圖；

圖5為兩個組織標本中g(shù)apdh的解鏈曲線圖；

圖6為hsa_circ_0000705在胃癌組織及其配對癌旁組織中表達情況；

圖7為胃黏膜異型增生組織及其配對正常組織中hsa_circ_0000705的表達水平；

圖8為hsa_circ_0000705在健康人胃組織、良性胃病變(胃潰瘍、胃炎)組織、胃癌前病變(異型增生)組織及各期胃癌組織中的表達水平及其變化規(guī)律；

圖9為hsa_circ_0000705的roc曲線。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

實施例1

(一)樣本的采集與處理

對胃癌患者進行外科手術(shù)治療，切除病變組織。在胃癌病灶和遠離病灶部位3cm外分別切取黃豆樣大小組織一塊，用手術(shù)刀切成厚度不超過0.5cm的組織小塊，浸泡入1mlrnafixer非液氮型樣品rna保存液(北京百泰克)中，放入-80℃超低溫冰箱中備用。

(二)特異性pcr反向引物設計與合成

借助于primerpremier引物設計軟件，自主設計了用于hsa_circ_0000705檢測的特異性pcr反向引物(divergentprimer)，并委托上海生工生物工程股份有限公司合成。該引物上游引物序列為5’-taactggggctcttcagctc-3’，下游引物序列為5’-tggtggttgtctggccttat-3’。通過對該引物pcr產(chǎn)物測序，驗證了引物擴增的特異性(圖1)。

(三)總rna提取與hsa_circ_0000705的rcr檢測

1.將組織標本從-80℃超低溫冰箱中取出，室溫解凍。

2.從rnafixer非液氮型樣品rna保存液取出組織塊，用濾紙吸干后，多位點剪取50mg～100mg組織，置于2ml無rnase離心管中，加入trizol試劑(美國invitrogen)1ml，用手持式勻漿器充分勻漿至無可見固體后，室溫靜置10min。

3.三氯甲烷提?。杭尤?.2ml三氯甲烷，漩渦振蕩10秒，室溫下靜置5分鐘后，4℃下，12000rpm離心15分鐘，吸取上層水相(寧少勿濫原則，一般可取到400μl)移入一新無rnase離心管中。

4.異丙醇沉淀：在上一步無rnase離心管中加入與所述上層水相等體積的異丙醇，混勻，4℃條件下靜置20分鐘后，4℃下12000rpm離心10分鐘，棄上清得沉淀。

5.75％乙醇洗滌：在上述沉淀中加入質(zhì)量分數(shù)為75％的乙醇1ml(-20度預冷)，顛倒數(shù)次，4℃下12000rpm離心5分鐘，棄上清，再用75％乙醇重復洗滌一次，4℃下12000rpm離心5分鐘，棄上清。

6.干燥rna：上一步棄上清后，再次4℃下12000rpm離心1分鐘，可見管壁殘余液體匯集于管底，用100μl移液器緩慢吸除殘余液體后，見一針尖大小半透明白色rna沉淀，室溫條件下干燥1分鐘，加10μl無rnase水溶解，反復吹打，得到rna提取液，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

7.rna逆轉(zhuǎn)錄：用goscript逆轉(zhuǎn)錄(reversetranscription,rt)試劑盒(購于美國promega公司)對上一步的rna提取液進行逆轉(zhuǎn)錄反應，得到cdna溶液，置-20℃保存?zhèn)溆?，具體操作依該試劑盒說明書進行：在0.5ml離心管中加入9.5μlrna提取液、1μlrandomprimers、1μlpcrnucleotidemix、2μlmgcl2、1μlreversetranscriptase、4μlreactionbuffer和0.5μlribonucleaseinhibitor；然后在25℃保溫5分鐘，42℃1小時，再在70℃保溫15分鐘，加入80μl無rnase水，就得到cdna溶液。

8.pcr檢測：用qpcrmastermix檢測試劑盒(購于美國promega公司)對上步的cdna溶液進行熒光定量pcr(儀器購于美國stratagene公司)，擴增的引物為hsa_circ_0000705特異性擴增上下游引物(上游序列為5’-taactggggctcttcagctc-3’，下游序列為5’-tggtggttgtctggccttat-3’)，具體操作依檢測試劑盒和熒光定量pcr儀說明書進行：在薄壁透明熒光定量pcr反應管中分別加入hsa_circ_0000705特異性擴增上下游引物各1μl，12.5μlqpcrmastermix，5.5μl無rnase水和5μlcdna；pcr反應條件為：95℃預變性5分鐘；然后94℃變性15秒，55℃退火30秒，70℃延伸30秒，共45個循環(huán)；解鏈曲線分析：95℃1分鐘，55℃30秒；然后緩慢升溫至95℃，升溫速率為0.2℃/秒。最后得到如圖2所示的hsa_circ_0000705擴增曲線和如圖3所示的hsa_circ_0000705解鏈曲線，從擴增曲線可以得到所檢測的二個標本的ct值分別為24.24和33.18，從解鏈曲線中可以了解到該曲線為較窄的單一峰，可以看出每個標本的hsa_circ_0000705均被特異性擴增，沒有引物二聚體和雜帶的干擾。通過hsa_circ_0000705的pcr產(chǎn)物測序，驗證了引物擴增的特異性(圖1)。

(四)hsa_circ_0000705表達水平的計算

與hsa_circ_0000705檢測方法基本相同，所不同的只是將擴增的上下游引物由gapdh特異性擴增上下游引物代替hsa_circ_0000705，檢測得到樣本中g(shù)apdh表達水平的擴增曲線(圖4)和解鏈曲線(圖5)，從擴增曲線可以得到所檢測的二個標本的ct值分別為29.87和26.25；從解鏈曲線中可以了解到該曲線為較窄的單一峰，可以看出每個標本的gapdh均被特異性擴增，沒有引物二聚體和雜帶的干擾。本實施例樣本cdna的ctgapdh值≤30，rna(即cdna)質(zhì)量合格。所用的gapdh特異性擴增上下游引物序列為：上游序列為5’-acccactcctccacctttgac-3’；下游序列為5’-tgttgctgtagccaaattcgtt-3’。

利用同一標本中hsa_circ_0000705和gapdh的ct值，就可根據(jù)公式δct＝ctcircrna-ctgapdh計算出該hsa_circ_0000705的δct值，根據(jù)δct值的大小就可判斷該hsa_circ_0000705的相對表達水平；δct值小者，其對應circrna的表達水平高；而δct值大者，其對應circrna的表達水平低。

(五)胃癌組織hsa_circ_0000705表達情況驗證分析

借助上述qrt-pcr技術(shù)，大樣本驗證hsa_circ_0000705在胃癌組織及其配對癌旁組織中表達情況，結(jié)果表明hsa_circ_0000705在79.2％胃癌患者癌組織中顯著低表達(圖6)。胃黏膜異型增生(gastricdysplasia，gd)是目前公認的胃癌前病變，具有明顯的惡變傾向。為了揭示組織hsa_circ_0000705是否與胃癌前病變相關(guān)，通過qrt-pcr檢測并比較了胃黏膜異型增生組織及其配對正常組織中hsa_circ_0000705的表達水平。結(jié)果顯示，hsa_circ_0000705表達水平除了在胃癌組織明顯減少外，在胃癌前病變階段其表達就有了顯著降低(圖7)。結(jié)合臨床病理資料，進一步分析了胃癌組織hsa_circ_0000705表達水平與胃癌臨床病理因素的潛在關(guān)系。如表1顯示，胃癌組織的hsa_circ_0000705表達水平與腫瘤階段(p＝0.024)、borrmann分型(p＝0.005)、病理類型(p＝0.045)和組織ca19-9表達(p＝0.010)等密切相關(guān)。

表1胃癌組織hsa_circ_0000705表達水平(δct)與患者臨床病理因素相關(guān)性分析

(六)不同組別患者hsa_circ_0000705表達情況分析

胃癌的發(fā)生是一個多階段、多步驟并逐級演進的過程。為了揭示hsa_circ_0000705是否參與了胃癌的逐級演進過程，使用qrt-pcr技術(shù)檢測并比較hsa_circ_0000705分子在健康人胃組織、良性胃病變(胃潰瘍、胃炎)組織、胃癌前病變(異型增生)組織及各期胃癌組織中的水平及其變化規(guī)律(圖8)。結(jié)果顯示，hsa_circ_0000705表達水平除了在胃癌組織和癌前病變組織(異性增生組織)中有顯著降低外，在胃良性病變(胃潰瘍和胃炎)組織中并沒有明顯改變(圖8)，提示hsa_circ_0000705作為胃癌篩查標志物可能具有良好的特異性。通過構(gòu)建受試者工作特征(roc)曲線進一步證明胃癌組織hsa_circ_0000705具有良好的敏感性與特異性(圖9)。hsa_circ_0000705的roc曲線下面積為0.719(95％ci,0.648-0.791)(圖9)。當其截斷值為9.125，敏感性和特異性分別為64.58％和69.79％(均超過現(xiàn)有胃癌標志物cea、ca19-9水平)。

本實施例通過上述研究證明hsa_circ_0000705只在胃癌前病變(異型增生)組織及胃癌組織中低表達，具有極好的胃癌組織特異性和胃癌相關(guān)性，并且可通過qrt-pcr方法實現(xiàn)定量檢測。

sequencelisting

<110>寧波大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院

<120>一種胃癌分子標志物hsa_circ_0000705及其應用

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