本發(fā)明涉及病毒和細(xì)菌的核酸提取和檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種用于提取病毒、細(xì)菌核酸的裂解液及采用該裂解液進(jìn)行熒光定量pcr的檢測方法。
背景技術(shù)：
：在現(xiàn)有技術(shù)中，血清、血漿中病毒提取方法主要有以下幾種：一、煮沸法：向血清或血漿等病毒、細(xì)菌樣本中加入裂解液，水浴或者干浴煮沸，高速離心取上清作為pcr模板，其優(yōu)點(diǎn)是操作簡單，缺點(diǎn)是提取的核酸雜質(zhì)含量高，容易抑制后期pcr擴(kuò)增，另外由于煮沸產(chǎn)生局部高壓，容易造成氣溶膠污染，導(dǎo)致檢測結(jié)果陰陽不分。二、離心柱提取法：血清或血漿等病毒、細(xì)菌樣本通過加入高鹽低ph的裂解液，然后使用核酸吸附膜吸附，再使用洗滌液洗滌2-3次，最后使用低鹽高ph值的洗脫液將核酸洗脫下來作為pcr模板。該方法提取的核酸純度高，但是缺點(diǎn)是需要多次高速離心，手工操作繁雜，效率低，而且無法實(shí)現(xiàn)自動化。三、磁珠法：磁珠法可以視為離心柱法的改進(jìn)，將吸附膜同功能物包裹在磁性納米微粒上，血清或血漿等病毒、細(xì)菌樣本通過加入高鹽低ph值的裂解液，然后使用包裹了核酸吸附膜的納米磁性微粒吸附，再使用洗滌液洗滌2-3次，最后使用低鹽高ph值的洗脫液將核酸洗脫下來作為pcr模板。該方法提取的核酸純度高，而且可以實(shí)現(xiàn)自動化提取，但是該技術(shù)需要操作人員具有較高的實(shí)驗(yàn)技能，不易推廣，如果配備自動化設(shè)備，則會增加檢測成本。上述幾種提取方法中，采用了化學(xué)方法實(shí)現(xiàn)細(xì)胞破裂、核酸釋放，再基于核酸比蛋白質(zhì)、多糖、脂肪等其他生物大分子物質(zhì)更具親水性的特性將核酸進(jìn)行分離、純化，純化步驟操作時(shí)間長、成本高。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡單、成本低廉的病毒/細(xì)菌的裂解液及熒光定量pcr檢測方法，其能滿足絕大多數(shù)臨床常見病毒、細(xì)菌無需核酸純化直接進(jìn)行熒光定量pcr檢測的要求，用以解決現(xiàn)有核酸提取過程中純化時(shí)間長、操作繁瑣、成本高的問題。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明方法采用一種快速裂解病毒、細(xì)菌外殼蛋白釋放出其遺傳物質(zhì)的裂解液，直接將其加入相應(yīng)的pcr反應(yīng)液中，即可實(shí)現(xiàn)針對待測病原微生物的定量或者定性檢測。具體地，該病毒/細(xì)菌的裂解液，由nacl、tritonx-100、十二烷基硫酸鋰和edta-2na與純化水混勻而成，各組分的終濃度：nacl為0.8～1.2m，tritonx-100為10v.％～15v.％，十二烷基硫酸鋰為0.01％～0.05％w/v(即質(zhì)量體積比)，edta-2na為5～10mm。優(yōu)選的，各組分的終濃度配比：nacl為1m，tritonx-100為10v.％，十二烷基硫酸鋰為0.02％，edta-2na為5mm。優(yōu)選的，各組分的終濃度配比：nacl為1m，tritonx-100為12v.％，十二烷基硫酸鋰為0.04％，edta-2na為8mm。上述技術(shù)方案中，采用高濃度氯化鈉有利于蛋白鹽析變性從而與核酸分離；tritonx-100和十二烷基硫酸鋰分別屬于非離子型和離子型表面活性劑，利于病毒外殼蛋白裂解以及核酸與蛋白的分離，其中非離子型表面活性劑對后期pcr不會產(chǎn)生明顯抑制，因此使用體積濃度優(yōu)選10～15v.％，更優(yōu)選10v.％，離子型活性劑在高劑量時(shí)會抑制掉pcr，因此優(yōu)選使用0.01～0.05％w/v(質(zhì)量體積比)，更優(yōu)選0.04％w/v。edta-2na可以與樣品中二價(jià)金屬離子形成螯合物，從而使得dna酶沒有催化劑，從而間接保護(hù)dna不受降解。上述各組分之間協(xié)同作用，將病毒或細(xì)菌裂解后可以直接進(jìn)行pcr擴(kuò)增，繞開核酸提純過程。本發(fā)明還提供了一種病毒/細(xì)菌的熒光定量pcr檢測方法，包括以下步驟：a、按照上述病毒/細(xì)菌的裂解液的配比，配制裂解液；b、提取病毒/細(xì)菌核酸：向pcr反應(yīng)管中加入步驟a中所得裂解液和待檢測血清或血漿樣本，混勻、靜置5～15min，得病毒/細(xì)菌的dna樣本；c、pcr擴(kuò)增：向步驟b中所得dna樣本的pcr反應(yīng)管中加入pcr反應(yīng)液，置于熒光定量pcr儀上，設(shè)置循環(huán)參數(shù)，進(jìn)行pcr擴(kuò)增和熒光檢測。步驟a中配制裂解液的方法如下：向容器中加入46.8～70.2克(即0.8～1.2mol)氯化鈉，100～150mltritonx-100，1～5克的十二烷基硫酸鋰，0.5mph值為8.0的edta-2na10～20ml，然后加純化水600ml，混勻后，定容到1000ml。步驟b中所述pcr反應(yīng)液包括：pcr緩沖溶液(pcrbuffer)、mgcl2、dntps、檢測病毒/細(xì)菌的引物對和對應(yīng)探針以及taqdna聚合酶或酶混合液。本發(fā)明方法具有如下優(yōu)點(diǎn)：采用本發(fā)明的裂解液，在pcr反應(yīng)的過程中可以省略提純dna的步驟，樣本的核酸提取和擴(kuò)增檢測在一個(gè)反應(yīng)管中進(jìn)行，無需加熱，離心，震蕩等分離或純化操作，操作過程簡單、方便、成本低廉，對操作人員要求極低，大幅度壓縮了檢測時(shí)間，特別適用于重大疾病的床邊診斷和爆發(fā)重大疫情時(shí)的現(xiàn)場檢驗(yàn)檢疫工作。附圖說明圖1是實(shí)施例2中4個(gè)梯度大腸桿菌的擴(kuò)增曲線，其中橫坐標(biāo)表示循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)表示熒光強(qiáng)度。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1以豬圓環(huán)病毒2型(pcv-2)的熒光定量pcr檢測為例，說明本發(fā)明裂解液的應(yīng)用。a、配制裂解液：向容器中加入58.5克氯化鈉，100mltritonx-100(聚乙二醇辛基苯基醚)，2克的十二烷基硫酸鋰，濃度為0.5m、ph值為8.0的edta-2na溶液10ml，然后加純化水600ml，混勻后，轉(zhuǎn)移至容量瓶中，定容到1000ml。b、提取病毒/細(xì)菌核酸：向pcr反應(yīng)管中加入步驟a中配制的裂解液5μl和待檢測血清或血漿樣本5μl，使用移液器反復(fù)吹打3次混勻，靜置10min，得細(xì)菌的dna樣本；c、pcr擴(kuò)增：向步驟b中所得dna樣本的pcr反應(yīng)管中加入配制好的pcr反應(yīng)液40μl，將pcr反應(yīng)管置于熒光定量pcr儀上，設(shè)置循環(huán)參數(shù)，進(jìn)行pcr擴(kuò)增和熒光檢測，pcr擴(kuò)增反應(yīng)程序參見表1。本實(shí)施例采用型號為宏石slan-48p的熒光定量pcr儀進(jìn)行檢測。同時(shí)以純化水作為陰性對照，以含有豬圓環(huán)病毒2型細(xì)菌的培養(yǎng)液作為陽性對照，分別按照上述條件進(jìn)行pcr擴(kuò)增和熒光檢測。表1pcr反應(yīng)程序和條件其中，pcr反應(yīng)液的組分和濃度參見表2。表2pcr反應(yīng)液的組分和濃度組分單人份用量(μl)5×pcrbuffer10mgcl2(1m)0.5dntps(25mm)0.5pcv-2-f(50pmol/μl)0.4pcv-2-r(50pmol/μl)0.4pcv-2-p(50pmol/μl)0.2taqdna聚合酶(5u/μl)1純化水補(bǔ)足到40上述pcrbuffer的組分及濃度為：250mmtrishcl、ph值為8.0,375mmkcl，25％(體積比)甘油，25％硫酸銨(體積比)。用于擴(kuò)增豬圓環(huán)病毒2型的上游引物pcv-2-f、下游引物pcv-2-r和檢測擴(kuò)增豬圓環(huán)病毒2型的探針pcv-2-p采用現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)成熟的核苷酸序列即可，本實(shí)施例采用的核苷酸序列參見表3。表3用于檢測豬圓環(huán)病毒2型的引物和探針序列按照上述的方法對54例豬圓環(huán)病毒2型血清樣品進(jìn)行檢測。同時(shí)作為對照，對每例樣品按照離心柱提取法進(jìn)行核酸提純，具體方法如下：在血清樣本中加入高鹽低ph值的裂解液，然后使用核酸吸附膜吸附，再使用洗滌液洗滌2-3次，最后使用低鹽高ph值的洗脫液將核酸洗脫下來作為pcr模板，加入表2中配制好的pcr反應(yīng)液，按照表1的pcr反應(yīng)程序和條件進(jìn)行擴(kuò)增和檢測。本實(shí)施例采用的是濟(jì)凡生物科技(北京)有限公司提供的finepure病毒dna/rna柱式提取試劑盒。將本實(shí)施例和對照例的檢測結(jié)果進(jìn)行比對，參見表4。表4實(shí)施例1與對照例的檢測結(jié)果比對以上結(jié)果表明：采用本實(shí)施例的裂解劑和相應(yīng)的方法與經(jīng)典離心柱提取檢測陽性率接近，而且本實(shí)施例操作簡單，可以規(guī)避離心柱提取過程中產(chǎn)生的失誤導(dǎo)致假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。實(shí)施例2a、配制裂解液：向容器中加入58.5克氯化鈉，150mltritonx-100，4克的十二烷基硫酸鋰，濃度為0.5m、ph為8.0的edta-2na溶液16ml，然后加純化水600ml，混勻后，轉(zhuǎn)移至容量瓶中，定容到1000ml。b、制備待測樣本：將已知濃度的大腸桿菌菌液稀釋到1×107cfu/ml、1×106cfu/ml、1×105cfu/ml、1×104cfu/ml四個(gè)10倍稀釋梯度濃度。取多個(gè)pcr反應(yīng)管，分別加入步驟a中配制的裂解液5μl，并依次加入上述四個(gè)濃度的大腸桿菌菌液5μl，使用移液器反復(fù)吹打3次混勻、靜置10min，得病毒裂解體系；c、pcr擴(kuò)增：向步驟b中所述病毒裂解體系中加入配制好的pcr反應(yīng)液40μl，按照表1中pcr反應(yīng)程序和條件進(jìn)行擴(kuò)增，檢測。其中以純化水作為陰性對照。本實(shí)施例pcr反應(yīng)液的組分和濃度參見表5。表5pcr反應(yīng)液的組分和濃度組分單人份用量(μl)5×pcrbuffer10mgcl2(1m)0.5dntps(25mm)0.5ec-f(50pmol/μl)0.2ec-r(50pmol/μl)0.2ec-p(50pmol/μl)0.1taqdna聚合酶(5u/μl)1rox(50μm)0.1純化水補(bǔ)足到40本實(shí)施例中5×pcrbuffer的濃度和組分與實(shí)施例1相同。用于檢測大腸桿菌上游引物ec-f、下游引物ec-r和探針ec-p是現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)成熟的技術(shù)。本實(shí)施例中所采用的核苷酸序列參見表6。表6用于擴(kuò)增環(huán)病毒2型的引物和探針序列擴(kuò)增結(jié)果參見圖1，測得的ct值見表7。表7大腸桿菌的檢測結(jié)果大腸桿菌溶液檢測結(jié)果(ct值)1×107cfu/ml20.011×106cfu/ml23.111×105cfu/ml26.731×104cfu/ml29.88以上結(jié)果表明：本實(shí)施例的裂解液針對細(xì)菌樣本具有良好的靈敏性，并且ct值隨濃度減少呈梯度改變。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施例對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。sequencelisting<110>濟(jì)凡生物科技（北京）有限公司<120>一種病毒/細(xì)菌的裂解液及熒光定量pcr檢測方法<130>2010<160>6<170>patentinversion3.3<210>1<211>19<212>dna<213>artificalsequence<400>1cccgcagtattctgattac19<210>2<211>23<212>dna<213>artificalsequence<400>2gacagcagttgaggagtaccatt23<210>3<211>22<212>dna<213>artificalsequence<400>3gaccccgttggaatggtactcc22<210>4<211>19<212>dna<213>artificalsequence<400>4ggttgattgaacgccgctc19<210>5<211>22<212>dna<213>artificalsequence<400>5gtgagacgctgaataaggagtg22<210>6<211>25<212>dna<213>artificalsequence<400>6tccgcgactatcgtcgttaatcacc25當(dāng)前第1頁12