本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種通過離體枝條低溫接菌培養(yǎng)后再提高培養(yǎng)溫度，根據(jù)接菌后的枝條是否產(chǎn)生愈傷或萌芽的方法判別獼猴桃潰瘍病抗性種質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
獼猴桃潰瘍病是一種威脅世界獼猴桃生產(chǎn)的毀滅性病害，因其病原菌能侵染到植物組織內(nèi)部，一般農(nóng)藥很難起到作用，即使是各種措施綜合使用，效果仍不明顯。生產(chǎn)實(shí)踐證明，凡發(fā)生潰瘍病的獼猴桃果園，特別是品種較感病園，已基本毀園。通過多年的生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，人們發(fā)現(xiàn)選育抗病品種是目前防控獼猴桃潰瘍病的唯一有效辦法，但目前已知的獼猴桃潰瘍病抗性種質(zhì)十分有限，主要原因是獼猴桃潰瘍病抗性的鑒定方法不完善。以前人們對(duì)獼猴桃品種潰瘍病抗性的認(rèn)識(shí)大多是根據(jù)其田間感病狀態(tài)確定的，但由于獼猴桃抗病性田間觀察受病原菌的傳播情況及年度間氣候、地理環(huán)境等的影響較大，抗病品種的田間鑒定往往需要漫長(zhǎng)的觀察周期。針對(duì)此現(xiàn)象，部分科研人員發(fā)展了離體葉片和枝條的體外接種鑒定技術(shù)，在獼猴桃抗、感品種的鑒定上有一定的效果，但仍存在鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性不高，適用范圍窄等問題，缺乏系統(tǒng)性的鑒定和評(píng)價(jià)體系，導(dǎo)致對(duì)目前大部分的獼猴桃品種或野生種質(zhì)材料的潰瘍病抗性認(rèn)識(shí)不足，限制了優(yōu)異抗性品種或野生種質(zhì)材料的發(fā)掘和利用。本發(fā)明利用獼猴桃潰瘍病菌的寄生特性和獼猴桃對(duì)潰瘍病的抗性生理特點(diǎn)，建立了一種簡(jiǎn)單有效可操作性強(qiáng)的鑒別潰瘍病抗性種質(zhì)的方法，此方法對(duì)獼猴桃潰瘍病抗性種質(zhì)的鑒定準(zhǔn)確性高，適用于大部分獼猴桃種類。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明針對(duì)目前獼猴桃潰瘍病抗性鑒定和評(píng)價(jià)方法的缺點(diǎn)和不足，和大部分獼猴桃品種或種質(zhì)對(duì)潰瘍病的抗性不明的現(xiàn)象，通過對(duì)獼猴桃離體枝條接種潰瘍病菌后，先期通過低溫培養(yǎng)，后期提高培養(yǎng)溫度，根據(jù)枝條愈傷組織的形成或萌芽狀態(tài)來判別獼猴桃潰瘍病抗性種質(zhì)的方法。該方法簡(jiǎn)單、直觀、可操作性強(qiáng)，判別結(jié)果準(zhǔn)確性高。
本發(fā)明一種判別獼猴桃潰瘍病抗性種質(zhì)的方法，包括如下步驟：
（1）樣品采集：于獼猴桃休眠期采集落葉后的獼猴桃一年生枝條，截取中間部分約30cm長(zhǎng)，芽眼飽滿的枝條，每個(gè)品種或種類取5個(gè)枝條，設(shè)無菌水處理為對(duì)照；
（2）病原菌培養(yǎng)：從保存的固體培養(yǎng)基平板上挑取單克隆，加入50ml液體lb培養(yǎng)基，25℃，220rpm，震蕩培養(yǎng)48h，4000rpm離心獲得細(xì)菌沉淀，使用無菌水將病原菌懸浮液稀釋到1×109cfu/ml；
（3）樣品接菌：樣品取回實(shí)驗(yàn)室后，使用自來水將枝條沖洗干凈，晾干，然后使用75%酒精對(duì)枝條表面進(jìn)行快速消毒，時(shí)間20s；再用無菌水沖洗干凈后，晾干，使用消毒后的5mm打孔器在枝條中部位置打孔，打孔深度深入木質(zhì)部，用槍頭吸取10μl菌液注入孔內(nèi)，放置15min使菌液完全滲入枝條傷口內(nèi)；
（4）枝條低溫培養(yǎng)：取一消毒后的40cm長(zhǎng)芽苗盤，在上層瀝水盤內(nèi)鋪兩張無菌濾紙，在底層托盤內(nèi)加入無菌水，加水高度至與上層瀝水盤底部齊平，不要沒過濾紙，使濾紙可以吸取水分保持濕度；將接菌后的枝條傷口朝上，擺放于濾紙上，每個(gè)枝條的擺放方向一致，當(dāng)芽苗盤擺滿一層后，上面覆蓋另外兩張無菌濾紙，并噴無菌水使其浸透為止；最后將要培養(yǎng)的芽苗盤至于無菌氣候室內(nèi)，控制溫度10℃以下，每3天檢查一次，如果發(fā)現(xiàn)濾紙部分變干則及時(shí)噴淋無菌水保濕，低溫培養(yǎng)時(shí)間為35天；
（5）提高培養(yǎng)溫度：低溫培養(yǎng)35天后，提高培養(yǎng)溫度到20℃，繼續(xù)培養(yǎng)15天；
（6）抗性種質(zhì)鑒別：枝條接菌培養(yǎng)50天后，觀察枝條剪口是否形成愈傷組織或枝條是否萌芽，如果存在這兩種現(xiàn)象的任何一種或同時(shí)存在，則判定其為抗性種質(zhì)。
本發(fā)明通過接菌后離體枝條愈傷和萌芽狀態(tài)判別獼猴桃潰瘍病抗性種質(zhì)的方法，其優(yōu)點(diǎn)和積極效果在于：
針對(duì)目前大部分獼猴桃品種或野生種質(zhì)的潰瘍病抗性不明和獼猴桃潰瘍病鑒定和評(píng)價(jià)體系不健全的現(xiàn)象，本發(fā)明充分利用獼猴桃潰瘍病菌的寄生特性和獼猴桃對(duì)潰瘍病的抗性生理特點(diǎn)，使用獼猴桃離體枝條接菌和通過在先期和后期控制溫度分別使?jié)儾【瞳J猴桃枝條處于較適宜的寄生或生理狀態(tài)，根據(jù)獼猴桃枝條最終能否產(chǎn)生愈傷組織或萌芽來判定其是否為抗性種質(zhì)。該方法簡(jiǎn)單、直觀，準(zhǔn)確性高。因?yàn)樵谑覂?nèi)操作，避免了傳播潰瘍病菌的風(fēng)險(xiǎn)。該發(fā)明將推動(dòng)對(duì)現(xiàn)有獼猴桃各品種或種質(zhì)的潰瘍病抗性的認(rèn)識(shí)，鑒別出一系列優(yōu)異的潰瘍病抗性種質(zhì)材料，用于獼猴桃生產(chǎn)和進(jìn)一步開發(fā)利用，減少潰瘍病的危害，促進(jìn)獼猴桃產(chǎn)業(yè)健康、可持續(xù)發(fā)展。
附圖說明
圖1為獼猴桃枝條無菌水處理對(duì)照?qǐng)D。
圖2為獼猴桃枝條感病種質(zhì)接菌對(duì)照?qǐng)D。
圖3為西選12號(hào)獼猴桃枝條抗性種質(zhì)使用本發(fā)明方法進(jìn)行鑒定的愈傷或萌芽情況圖。
圖4為華特獼猴桃枝條抗性種質(zhì)使用本發(fā)明方法進(jìn)行鑒定的愈傷或萌芽情況圖。
圖5為徐香獼猴桃枝條抗性種質(zhì)使用本發(fā)明方法進(jìn)行鑒定的愈傷或萌芽情況圖。
圖6為秋明獼猴桃枝條抗性種質(zhì)使用本發(fā)明方法進(jìn)行鑒定的愈傷或萌芽情況圖。
圖7為大籽獼猴桃枝條抗性種質(zhì)使用本發(fā)明方法進(jìn)行鑒定的愈傷或萌芽情況圖。
圖8為對(duì)萼獼猴桃枝條抗性種質(zhì)使用本發(fā)明方法進(jìn)行鑒定的愈傷或萌芽情況圖。
圖9為軟棗獼猴桃枝條抗性種質(zhì)使用本發(fā)明方法進(jìn)行鑒定的愈傷或萌芽情況圖。
圖10為中華×毛花獼猴桃枝條抗性種質(zhì)使用本發(fā)明方法進(jìn)行鑒定的愈傷或萌芽情況圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明內(nèi)容作進(jìn)一步的說明，但不是對(duì)本發(fā)明的限定。
實(shí)施例1
1、實(shí)驗(yàn)材料：
本試驗(yàn)選用已知的獼猴桃潰瘍病感病種質(zhì)紅陽、hort16a、袖珍珠、金豐、毛葉硬齒和中感/中抗種質(zhì)華優(yōu)、魁蜜、海沃德、山梨（野生種）及抗性種質(zhì)西選12號(hào)、華特、徐香、秋明、大籽（野生種）、對(duì)萼（野生種）、軟棗（野生種）、f1-r48（中華×毛花）為驗(yàn)證對(duì)象；潰瘍病菌為分離于廣西的一個(gè)強(qiáng)致病3型psa菌株。
2、通過接菌后離體枝條愈傷和萌芽狀態(tài)判別獼猴桃潰瘍病抗性種質(zhì)的方法，包括以下步驟：
（1）樣品采集：于獼猴桃休眠期采集落葉后的上述獼猴桃一年生枝條，截取中間部分約30cm長(zhǎng)、芽眼飽滿的枝條，每個(gè)品種或種類取5個(gè)枝條；
（2）病原菌培養(yǎng)：從保存的固體培養(yǎng)基平板上挑取單克隆，加入50ml液體lb培養(yǎng)基，25℃，220rpm，震蕩培養(yǎng)48h，4000rpm離心獲得細(xì)菌沉淀，使用無菌水將病原菌懸浮液稀釋到1×109cfu/ml；
（3）樣品接菌：樣品取回實(shí)驗(yàn)室后，使用自來水將枝條沖洗干凈，晾干，然后使用75%酒精對(duì)枝條表面進(jìn)行快速消毒，時(shí)間20s。無菌水沖洗干凈后，晾干，使用消毒后的5mm打孔器在枝條中部位置打孔，打孔深度深入木質(zhì)部，用槍頭吸取10μl菌液注入孔內(nèi)，放置15min使菌液完全滲入枝條傷口內(nèi)；
（4）枝條低溫培養(yǎng)：取一消毒后的40cm長(zhǎng)芽苗盤，在上層瀝水盤內(nèi)鋪兩張無菌濾紙，在底層托盤內(nèi)加入無菌水，加水高度至與上層瀝水盤底部齊平（不要沒過濾紙），使濾紙可以吸取水分保持濕度。將接菌后的枝條傷口朝上，擺放于濾紙上，每個(gè)枝條的擺放方向一致。當(dāng)芽苗盤擺滿一層后，上面覆蓋另外兩張無菌濾紙，并噴無菌水使其浸透為止。最后將要培養(yǎng)的芽苗盤至于無菌氣候室內(nèi)，控制溫度10℃以下，每3天檢查一次，如果發(fā)現(xiàn)濾紙部分變干則及時(shí)噴淋無菌水保濕。低溫培養(yǎng)時(shí)間為35天；
（5）提高培養(yǎng)溫度：低溫培養(yǎng)35天后，提高培養(yǎng)溫度到20℃，繼續(xù)培養(yǎng)15天；
（6）抗性種質(zhì)鑒別：枝條接菌培養(yǎng)50天后，觀察枝條剪口是否形成愈傷組織或枝條是否萌芽，如果存在這兩種現(xiàn)象的任何一種或同時(shí)存在，則判定其為抗性種質(zhì)。鑒定結(jié)果詳見表1。
參照附圖1-2，由表1可見，參試的所有感病和中感/中抗種質(zhì)的枝條剪口均未出現(xiàn)愈傷組織，枝條也未出現(xiàn)萌牙現(xiàn)象，而所有的抗性種質(zhì)均出現(xiàn)了剪口處愈傷或枝條萌芽現(xiàn)象，有些種質(zhì)（如大籽、對(duì)萼、軟棗等）兩種現(xiàn)象均有出現(xiàn)。由此可見枝條在經(jīng)過較長(zhǎng)時(shí)間的潰瘍病菌侵染后再恢復(fù)適宜生長(zhǎng)溫度培養(yǎng)一段時(shí)間，枝條剪口出現(xiàn)愈傷或是出現(xiàn)萌芽現(xiàn)象是抗性種質(zhì)的獨(dú)有現(xiàn)象，可作為抗性種質(zhì)的鑒定標(biāo)準(zhǔn)。潰瘍病菌在入侵獼猴桃枝條后，會(huì)打破枝條細(xì)胞內(nèi)原有的激素平衡或?qū)χl內(nèi)組織造成嚴(yán)重破壞甚至直接摧毀整個(gè)枝條，在恢復(fù)培養(yǎng)溫度后，對(duì)于感病或中等抗性種類來說，即使恢復(fù)溫度后抑制了病原菌的繼續(xù)侵染，但因其生理結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞或是影響了生長(zhǎng)類激素的代謝或傳遞機(jī)制，導(dǎo)致其無法在傷口處形成愈傷或產(chǎn)生萌芽。而抗性種質(zhì)則能抵御潰瘍病菌的侵染，或是潰瘍病菌對(duì)其的危害不足以影響其正常生理或造成較嚴(yán)重的激素紊亂，在恢復(fù)到適宜溫度后，枝條又得以正常產(chǎn)生愈傷和萌芽。因不同品種或種類其產(chǎn)生愈傷的難易程度或是萌芽的所需的時(shí)間長(zhǎng)短不同，所以綜合考慮產(chǎn)生愈傷和萌芽?jī)煞N條件作為其抗性指標(biāo)更為科學(xué)。8份獼猴桃抗性種質(zhì)使用本發(fā)明方法進(jìn)行鑒定的愈傷或萌芽情況見附圖3-10。