本發(fā)明涉及一種柑橘黃龍病菌的檢測(cè)方法，尤指一種檢測(cè)柑橘黃龍病菌（candidatusliberibacterspp.）的pcr（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）方法。

背景技術(shù)：

柑橘黃龍?。?i>candidatusliberibacterspp.）是世界范圍內(nèi)最具毀滅性的柑橘病害之一，目前正嚴(yán)重威脅亞洲、非洲、大洋洲、南美洲和北美洲的近50個(gè)國(guó)家和地區(qū)柑橘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。我國(guó)最初是在廣東、廣西等地區(qū)報(bào)道發(fā)生，隨著全球氣候變暖，柑橘木虱越冬地區(qū)界線(xiàn)北移，柑橘黃龍病的疫區(qū)有不斷擴(kuò)大的趨勢(shì)。黃龍病菌是由昆蟲(chóng)介體傳播，局限于韌皮部的革蘭氏陰性細(xì)菌，暫定為韌皮部桿菌屬(candidatusliberibacter)的3個(gè)種，分別為亞洲種(ca.l.asiaticus)、非洲種(ca.l.africanus)和美洲種(ca.l.americanus)，其中ca.l.asiaticus在世界范圍內(nèi)分布最為廣泛，引起柑橘產(chǎn)業(yè)損失最為嚴(yán)重，在中國(guó)分布的黃龍病原菌也為該種。柑橘黃龍病引起植株生長(zhǎng)受阻，枝梢黃化，其最典型的癥狀葉片斑駁型黃化和“紅鼻果”可做為初步田間診斷的依據(jù)。

目前該病菌已經(jīng)被列為我國(guó)進(jìn)境和國(guó)內(nèi)檢疫性有害生物。美國(guó)、巴西、阿根廷、土耳其、伊朗、西班牙、意大利等全球30多個(gè)許多國(guó)家和地區(qū)，都將其列為檢疫性有害生物，對(duì)柑橘黃龍病菌實(shí)施檢疫，并禁止其出口和輸入。

商業(yè)化生產(chǎn)中，柑橘黃龍病近距離和中距離傳播的主要途徑是柑橘木虱取食產(chǎn)生的。此外，在果園管理維護(hù)中的嫁接等人為活動(dòng)也有利于柑橘黃龍病在植株間的傳播。其遠(yuǎn)距離傳播則主要通過(guò)種苗、接穗、砧木的運(yùn)輸交易來(lái)實(shí)現(xiàn)。因此，建立快速、高效的柑橘黃龍病菌檢測(cè)技術(shù)，是防治柑橘黃龍病的重要基礎(chǔ)。目前，通過(guò)pcr技術(shù)檢測(cè)柑橘黃龍病菌，主要是根據(jù)柑橘黃龍病16srrna區(qū)域篩選出的特異性oi1/oi2（oi1：5’-gcgcgtattttacgagcgca-3’；oi2：5’-gcctcgcgagttcgcaacccat-3’,pcr產(chǎn)物大小為1160bp左右）（sandrinejagoueix,josephmariebové,moniquegarnier,pcrdetectionofthetwo?candidatus?liberobacterspeciesassociatedwithgreeningdiseaseofcitrus,molecularandcellularprobes,volume10,issue1,1996,pages43-50,issn0890-8508,）。柑橘黃龍病菌檢測(cè)方法雖然具有較高的特異性，但靈敏度不夠時(shí)常出現(xiàn)假陰性，影響了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

16srrna序列在目前使用比較廣泛，但是其不足處也逐漸顯露，16srdna存在于所有細(xì)菌染色體基因中，16srrna基因序列比gyrb基因序列所攜帶的信息量較大，長(zhǎng)度適中，但其分辨率較低。因此，需要找到更有效的檢測(cè)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

yrb基因其顯著優(yōu)點(diǎn)是基因進(jìn)化率較大，堿基替換率較高，在相似細(xì)菌的檢測(cè)和鑒定方面比16srrna基因更具有優(yōu)勢(shì)。柑橘黃龍病gyrb基因含2460個(gè)核苷酸，在ncbi中搜索到18條柑橘黃龍病gyrb基因系列，通過(guò)dnaman比對(duì)找到一些保守區(qū)域，設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物在序列1953-2414pb之間。在實(shí)驗(yàn)中通過(guò)凝膠電泳的條帶斷定，gyrb引物比16srrna更加靈敏。

因此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是：針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能準(zhǔn)確鑒定柑橘黃龍病的pcr快速檢測(cè)方法。該方法所使用的一對(duì)引物是基于柑橘黃龍病菌的促旋酶b亞單位基因(gyrasesubunitb)的核苷酸序列，本檢測(cè)技術(shù)所使用的這對(duì)引物有別于其它檢測(cè)技術(shù)。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種柑橘黃龍病的pcr檢測(cè)方法，該方法是以柑橘黃龍病菌的特異性引物對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行pcr擴(kuò)增，最后電泳鑒定。該特異性引物為：

正向引物（gyr1）：5’-tctcgcttctaaattggc-3’

反向引物（gyr2）：5’-ggctctacttcatcaccc-3’

上述特異性引物的設(shè)計(jì)是基于柑橘黃龍病菌的促旋酶b亞單位基因(gyrasesubunitb)的核苷酸序列，pcr產(chǎn)物大小為461bp左右。本發(fā)明是以柑橘黃龍病菌特異性引物對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行pcr擴(kuò)增，最后電泳鑒定；該特異性引物是基于柑橘黃龍病菌的促旋酶b亞單位基因(gyrasesubunitb)的核苷酸序列。本檢測(cè)技術(shù)所使用的這對(duì)引物有別于其它檢測(cè)技術(shù)，可以用于快速和準(zhǔn)確檢測(cè)出柑橘黃龍病。

附圖說(shuō)明

圖1用本發(fā)明的特異性引物作pcr的電泳結(jié)果。

圖中：從左至右的電泳帶依次為：m-marker、+-陽(yáng)性對(duì)照（來(lái)自宜章縣已確定的陽(yáng)性菌）、--陰性對(duì)照（清水）、1-6為病株（來(lái)自江永縣以確定的陽(yáng)性菌）；從上往下的電泳帶依次為：柑橘黃龍病菌的dna模板量為稀釋10倍、100倍、1000倍。

圖2oi1/oi2特異性引物作pcr的電泳結(jié)果圖。

圖中：從左至右的電泳帶依次為：m-marker、+-陽(yáng)性對(duì)照（來(lái)自宜章縣已確定的陽(yáng)性菌）、--陰性對(duì)照（清水）、1-6為病株（來(lái)自江永縣以確定的陽(yáng)性菌）；從上往下的電泳帶依次為：柑橘黃龍病菌的dna10¹、10²、10³倍稀釋。

具體實(shí)施方式

一、引物設(shè)計(jì)：

本發(fā)明人利用原核生物進(jìn)化過(guò)程中核酸序列的保守性，從ncbi搜索并下載柑橘黃龍病菌（candidatusliberibacterspp）的促旋酶b亞單位基因(gyrasesubunitb)的核苷酸序列（ap014595.1），運(yùn)用premier軟件得到一些候選引物，最后通過(guò)篩選，設(shè)計(jì)出一對(duì)引物：

正向引物（gyr1）：5’-tctcgcttctaaattggc-3’

反向引物（gyr2）：5’-ggctctacttcatcaccc-3’

將引物oi1/oi2和引物gyr1/gyr2分別經(jīng)blast檢索，見(jiàn)下表1及表2，結(jié)果表明，與引物oi1/oi2和引物gyr1/gyr2的序列100%覆蓋且100%相同的全部是柑橘黃龍病菌的核苷酸序列。

表1柑橘黃龍病菌引物oi1/oi2的blast結(jié)果

表2柑橘黃龍病菌引物gyr1/gyr2的blast結(jié)果

由此，在ncbi中搜索candidatusliberibacter，找到gryb基因并下載，利用dnaman處理且比對(duì)，尋找其保守區(qū)域，利用primer5設(shè)計(jì)并且評(píng)估設(shè)計(jì)的引物。），設(shè)計(jì)出一對(duì)特異性引物：

正向引物（gyr1）：5’-tctcgcttctaaattggc-3’

反向引物（gyr2）：5’-ggctctacttcatcaccc-3’

上述引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，預(yù)期pcr產(chǎn)物為461個(gè)左右堿基。

二、pcr過(guò)程：

用上述gyr1/gyr2和oi1/oi2引物對(duì)對(duì)柑橘黃龍病菌進(jìn)行pcr檢測(cè)，pcr反應(yīng)體系為20μl，具體見(jiàn)下表3：

表3pcr反應(yīng)體系各主要成分及用量

gyr1/gyr2引物反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，然后95℃變性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，在此條件下進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃再延伸10min。

oi1/oi2引物反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，然后95℃變性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸1min，在此條件下進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃再延伸10min。

將冷卻至50-60℃的1.0%瓊脂糖膠液倒入制膠板內(nèi)，待膠完全凝固后撥出梳子，然后向槽內(nèi)加入1×tbe稀釋緩沖液至液面恰好沒(méi)過(guò)膠板上表面。

取反應(yīng)產(chǎn)物5μl與2μlloadingbuffer和sybrgreen核酸凝膠染液按3:6:3混合，取10μl混合液進(jìn)行電泳進(jìn)行檢測(cè)，以2000bpdnaladder作為標(biāo)準(zhǔn)分子。采用電壓110v，電泳時(shí)間30min，用紫外凝膠成像系統(tǒng)觀(guān)察，結(jié)果擴(kuò)增出461bp的條帶，與預(yù)期的大小相符。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：本方法所使用的引物對(duì)是柑橘黃龍病菌的轉(zhuǎn)促旋酶b亞單位基因(gyrasesubunitb)的核苷酸序列，該引物對(duì)有別于其它檢測(cè)技術(shù)，可以用于快速檢測(cè)柑橘黃龍病。

應(yīng)用實(shí)施例

用本發(fā)明中的特異性引物對(duì)來(lái)自湖南省江永縣允山鎮(zhèn)和日供銷(xiāo)社（e111°15′37″；n25°15′54″）的柑橘黃龍病菌株上分離到的病原菌進(jìn)行pcr，對(duì)已確定的6個(gè)陽(yáng)性病菌的dna進(jìn)行10¹、10²、10³稀釋?zhuān)瑫r(shí)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增出461個(gè)堿基的條帶。見(jiàn)圖1，結(jié)果檢測(cè)出10¹稀釋的1-6號(hào)陽(yáng)性菌的條帶都與陽(yáng)性對(duì)照條帶一致；10²稀釋的1-6號(hào)陽(yáng)性菌的條帶都與陽(yáng)性對(duì)照一致；10³稀釋的1、2、3、5、6號(hào)陽(yáng)性菌與陽(yáng)性對(duì)照一致，4號(hào)陽(yáng)性菌的特征和陰性對(duì)照一致。說(shuō)明本發(fā)明的這對(duì)特異性引物對(duì)柑橘黃龍病菌是特異的和高的靈敏度，可快速檢測(cè)出柑橘黃龍病。

比較實(shí)施例

用本oi1/oi2特異性引物對(duì)來(lái)自湖南省江永縣允山鎮(zhèn)和日供銷(xiāo)社（e111°15′37″；n25°15′54″）的柑橘黃龍病菌株上分離到的病原菌進(jìn)行pcr，對(duì)已確定的6個(gè)陽(yáng)性病菌的dna進(jìn)行10¹、10²、10³稀釋?zhuān)瑫r(shí)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增出1161個(gè)堿基的條帶。見(jiàn)圖2，結(jié)果檢測(cè)出10¹稀釋的1、2、3、4、6號(hào)陽(yáng)性菌的條帶都與陽(yáng)性對(duì)照條帶一致，5號(hào)陽(yáng)性菌的特征和陰性對(duì)照一致；10²稀釋的1、2、4、6號(hào)陽(yáng)性菌的條帶都與陽(yáng)性對(duì)照一致，3、5號(hào)陽(yáng)性菌的特征和陰性對(duì)照一致；10³稀釋的1、2、4號(hào)陽(yáng)性菌跑出1161pb的條帶，+、3、5、6號(hào)陽(yáng)性菌的特征和陰性對(duì)照一致。說(shuō)明oi1/oi2這對(duì)特異性引物對(duì)柑橘黃龍病菌是有特異的，但快速檢測(cè)出柑橘黃龍病的靈敏度不高，出現(xiàn)假陰性居多，不能準(zhǔn)確的檢測(cè)出柑橘黃龍病。