本發(fā)明屬于細(xì)胞免疫領(lǐng)域，涉及nk細(xì)胞，具體涉及一種提高nk細(xì)胞對(duì)胃癌殺傷力的化合物及其制劑。
背景技術(shù)：
：自然殺傷細(xì)胞(nk)是一群不同于t、b淋巴細(xì)胞的大顆粒淋巴細(xì)胞，分布于外周各淋巴器官及血液循環(huán)系統(tǒng)，無(wú)需抗原的預(yù)先刺激與活化即可發(fā)揮細(xì)胞毒效應(yīng)，并可分泌多種細(xì)胞因子及趨化因子。nk細(xì)胞表達(dá)一系列活化性受體及抑制性受體，兩者間的平衡是控制nk細(xì)胞是否被激活的重要機(jī)制。干擾素及巨噬細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞因子均是nk細(xì)胞極強(qiáng)的活化因子，nk細(xì)胞活化過(guò)程迅速，在趨化介質(zhì)的作用下離開(kāi)血液循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)入到外周組織部位，在病毒感染后2-3天nk細(xì)胞即可聚集于感染灶，殺傷被感染細(xì)胞；同時(shí)通過(guò)其分泌的可溶性因子如ifn、tnf、il-3，gm-csf、m-csf等招募活化中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞以及觸發(fā)獲得性免疫應(yīng)答。另外，活化的nk細(xì)胞能夠表達(dá)多種共刺激分子如cd80、cd86、cd70、ox40l、2b4等，直接與t細(xì)胞相互作用而促進(jìn)獲得性免疫應(yīng)答；活化的nk細(xì)胞亦可能具有apc樣表型，直接行駛抗原提呈功能從而促進(jìn)t細(xì)胞免疫應(yīng)答。胃癌是世界上排名第四的惡性腫瘤，全球每年約有70多萬(wàn)人死于胃癌，占全部惡性腫瘤死亡人數(shù)的10％左右。我國(guó)最新公布的腫瘤數(shù)據(jù)顯示，胃癌的發(fā)病率和死亡率分別位居全國(guó)第二和第三。胃癌常好發(fā)于50歲以上的中老年人并逐漸呈現(xiàn)年輕化的趨勢(shì)。胃癌的具體發(fā)病原因并不清楚，可能與個(gè)體遺傳、不健康飲食和環(huán)境以及幽門螺桿菌的長(zhǎng)期感染等因素相關(guān)。胃癌的發(fā)生發(fā)展和臨床轉(zhuǎn)歸受到胃癌微環(huán)境中各種細(xì)胞相互調(diào)控的影響，其中抗腫瘤效應(yīng)性免疫細(xì)胞受到抑制性的調(diào)控與胃癌的進(jìn)展及病人的臨床預(yù)后不良密切相關(guān)。因此，提高包括nk細(xì)胞在內(nèi)的免疫細(xì)胞對(duì)胃癌細(xì)胞的殺傷力對(duì)胃癌的治療，控制胃癌的進(jìn)展，以及病人的臨床預(yù)后具有重要意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種提高nk細(xì)胞對(duì)胃癌殺傷力的化合物及其制劑。本發(fā)明通過(guò)如下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)：如下結(jié)構(gòu)通式的吡咯化合物在制備提高nk細(xì)胞對(duì)胃癌殺傷力的藥物中的應(yīng)用：其中，r1和r2選自氫、烷基、鹵素。優(yōu)選地，所述吡咯化合物選自如下結(jié)構(gòu)：一種藥物制劑，含有上述吡咯化合物。優(yōu)選地，所述藥物制劑還含有藥學(xué)上可以接受的載體，制備成藥學(xué)上可以接受的劑型。上述藥物制劑在制備提高nk細(xì)胞對(duì)胃癌殺傷力的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明提供的吡咯化合物可以顯著提高nk細(xì)胞對(duì)胃癌細(xì)胞的殺傷力，可以用于制備治療胃癌的藥物。附圖說(shuō)明圖1為不同處理nk細(xì)胞對(duì)胃癌bgc-823細(xì)胞的殺傷活性；圖2為各吡咯化合物對(duì)裸鼠胃癌移植瘤的體內(nèi)抑瘤作用。具體實(shí)施方式為了更好地解釋本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步介紹。實(shí)施例中未特別強(qiáng)調(diào)的實(shí)驗(yàn)材料均為常規(guī)實(shí)驗(yàn)材料，屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員易于獲得的范疇。實(shí)施例1：細(xì)胞水平試驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)材料scgm培養(yǎng)基為德國(guó)cellgenix品牌；人ab血漿由南京市血站提供；胃癌bgc-823細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所；10％胎牛血清和rpmi-1640培養(yǎng)液購(gòu)于gibco公司；乳酸脫氫酶(ldh)細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)于biovision公司；編號(hào)為吡咯a-1、a-2、a-3、a-4、b-1、b-2的化合物均為已知化合物，委外合成。二、實(shí)驗(yàn)方法1、nk細(xì)胞培養(yǎng)及表型鑒定取健康成年志愿者外周靜脈血20ml，低分子肝素鈉抗凝后加入淋巴細(xì)胞分離液，離心2000r/min×13min(離心半徑為10cm)。玻璃吸管吸取單個(gè)核細(xì)胞層，pbs洗滌2次，將細(xì)胞加入含有rhil-2和人ab血漿的scgm培養(yǎng)基中，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收集培養(yǎng)10d的nk細(xì)胞，pbs洗滌后將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106/ml。在細(xì)胞懸液中加入fitc-anti-cd56和pe-anti-cd3，室溫下避光孵育15min，pbs洗滌并重懸細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)nk細(xì)胞表型。2、胃癌細(xì)胞株bgc-823的培養(yǎng)取復(fù)蘇后的胃癌bgc-823細(xì)胞加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，隨后加入含10％胎牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)液15ml，于37℃、5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況進(jìn)行換液。待細(xì)胞鋪滿瓶底時(shí)，用2.5g/l胰蛋白酶消化細(xì)胞使其脫壁，收集細(xì)胞后離心800r/min×3min，棄去上清，使用生理鹽水反復(fù)吹打混勻細(xì)胞，計(jì)數(shù)后用于實(shí)驗(yàn)。3、nk細(xì)胞對(duì)胃癌bgc-823細(xì)胞的殺傷活性采用ldh釋放法測(cè)定nk細(xì)胞對(duì)胃癌bgc-823細(xì)胞的殺傷活性，步驟如下：取培養(yǎng)10d的nk細(xì)胞鋪入6孔板，實(shí)驗(yàn)組加入不同的吡咯化合物(編號(hào)吡咯a-1、a-2、a-3、a-4、b-1、b-2，終濃度為5μm、10μm)，對(duì)照組加入等體積溶劑dmso，繼續(xù)培養(yǎng)24h，收集nk細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期胃癌bgc-823細(xì)胞作為靶細(xì)胞，將效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞分別配成1.5×106/ml和1.5×105/ml的細(xì)胞懸液，效靶細(xì)胞等體積混合(效靶細(xì)胞數(shù)比例為10:1)。將混合后的效靶細(xì)胞置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱中孵育4h后，離心1500r/min×10min，取上清液。按乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作，340nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值(a)，每檢測(cè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)管，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。nk細(xì)胞的殺傷活性(％)＝(a實(shí)驗(yàn)組-a效應(yīng)細(xì)胞自然釋放組)/(a靶細(xì)胞最大釋放組-a靶細(xì)胞自然釋放組)×100％。4、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用spss13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，多組間比較采用單因素方差分析，p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、人nk細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定nk細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果顯示，人nk細(xì)胞在體外擴(kuò)增培養(yǎng)10d后，可見(jiàn)大的集落和散在的細(xì)胞生長(zhǎng)，單個(gè)細(xì)胞呈橢圓形或梭形生長(zhǎng)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，pbmc未培養(yǎng)前nk細(xì)胞cd3-cd56+比例為6.35％，培養(yǎng)10d后nk細(xì)胞比例增加到85.41％。2、吡咯化合物對(duì)nk細(xì)胞殺傷胃癌bgc-823細(xì)胞的影響表1和圖1為不同處理nk細(xì)胞對(duì)胃癌bgc-823細(xì)胞的殺傷活性。表1不同處理nk細(xì)胞對(duì)胃癌bgc-823細(xì)胞的殺傷活性(％，n＝3)表1和圖1可以看出，與對(duì)照組相比，本發(fā)明提供的吡咯化合物可以有效增強(qiáng)nk細(xì)胞對(duì)胃癌細(xì)胞的殺傷活性，且呈一定的濃度依賴性。實(shí)施例2：動(dòng)物水平試驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)材料balb/c裸鼠，均選用雌性裸鼠，鼠齡6-7周，體重18-23g，在spf條件下的裸鼠室內(nèi)飼養(yǎng)，由南京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。胃癌bgc-823細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。二、實(shí)驗(yàn)方法在無(wú)菌條件下，在雌性裸鼠右側(cè)腋部皮下注射1×106/0.2ml的人胃腺癌bgc-823細(xì)胞。裸鼠在接種腫瘤細(xì)胞次日按照體重隨機(jī)分成給藥組(分別給予吡咯a-1、a-2、a-3、a-4、b-1、b-2)和對(duì)照組(給予等體積生理鹽水)。當(dāng)移植瘤長(zhǎng)到第15天時(shí)開(kāi)始，分別給予腹腔注射等體積生理鹽水、8mg/kg吡咯化合物。各組均每天給藥1次，連續(xù)20天。停藥后將裸鼠拉頸處死，小心剝離皮下腫瘤，并稱重，按下述公式計(jì)算抑瘤率(％)：抑瘤率(％)＝(對(duì)照組瘤重-給藥組瘤重)/對(duì)照組瘤重×100％。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果表2和圖2為各組吡咯化合物對(duì)裸鼠胃癌移植瘤的體內(nèi)抑瘤率(％)。表2各吡咯化合物對(duì)裸鼠胃癌移植瘤的體內(nèi)抑瘤率(％，n＝6)吡咯化合物編號(hào)抑瘤率(％)吡咯a-158.4±4.1吡咯a-276.2±5.3吡咯a-351.3±5.7吡咯a-458.5±3.6吡咯b-162.4±3.3吡咯b-265.7±5.2從表2和圖2可以看出，本發(fā)明提供的吡咯化合物對(duì)裸鼠胃癌移植瘤具有顯著的體內(nèi)抑制作用，結(jié)合細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果，吡咯化合物很有可能是通過(guò)提高nk細(xì)胞對(duì)胃癌移植瘤殺傷作用而實(shí)現(xiàn)體內(nèi)抑瘤效果的。本發(fā)明提供的吡咯化合物可以顯著提高nk細(xì)胞對(duì)胃癌細(xì)胞的殺傷力，可以用于制備治療胃癌的藥物。上述實(shí)施例僅用于進(jìn)一步解釋本發(fā)明的技術(shù)方案，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白，任何簡(jiǎn)單替換或修改均不脫離本發(fā)明，本發(fā)明的保護(hù)范圍并不受限于上述具體實(shí)施例。當(dāng)前第1頁(yè)12