本發(fā)明屬新菌種篩選和應(yīng)用領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種具有頭孢抗性且高表達(dá)sir2蛋白的長(zhǎng)雙歧桿菌bifidobacteriumlongumbl16及其在相關(guān)食品或藥品中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

雙歧桿菌是一類(lèi)存在于動(dòng)物消化道中對(duì)宿主具有重要調(diào)節(jié)功能的專(zhuān)性厭氧菌，被認(rèn)為是一種革蘭氏陽(yáng)性益生菌，該菌在大腸中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，次之在小腸，口腔分布有少量。在1899年，由法國(guó)巴斯德研究院的tissier研究員第一次在母乳喂養(yǎng)的健康嬰兒糞便中分離出來(lái)，該菌類(lèi)屬于放線菌科雙歧桿菌屬，形態(tài)多樣，因生長(zhǎng)環(huán)境不同而表現(xiàn)出彎曲桿形、v形、l或y形等，除此外還發(fā)現(xiàn)有球形雙歧桿菌，當(dāng)固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，其菌落為凸?fàn)顖A形，乳白色，表面光滑完整，質(zhì)地柔軟；最適合的生長(zhǎng)溫度為37℃～41℃，可以生長(zhǎng)的ph值為5.0～8.0，最適為6.5～7.0；根據(jù)dna的同源性和糖發(fā)酵特性來(lái)分，總共分為24個(gè)種屬，而人類(lèi)來(lái)源的只有12個(gè)種屬，在這12個(gè)種屬中，用人類(lèi)健康事業(yè)并能在人體腸道內(nèi)定植的僅有5種，包括兩歧雙歧桿菌(bifido.bifidum)、青春雙歧桿菌(bifido.adolescentis)、嬰兒雙歧桿菌(bifido.infantis)、短雙歧桿菌(bifido.breve)以及長(zhǎng)雙歧桿菌(bifido.longum)。

雙歧桿菌在體內(nèi)不產(chǎn)生內(nèi)毒素，也不產(chǎn)生致病物質(zhì)和有害氣體，是一種公認(rèn)的對(duì)人體無(wú)害的腸道細(xì)菌，對(duì)人體發(fā)揮許多有益生理功能。

sir2(silenceinformationregulator)基因是一類(lèi)從細(xì)菌到高等真核生物都高度保守的nad+依賴(lài)的組蛋白/非組蛋白去乙酰化酶。sir2家族基因所編碼的sir2相關(guān)蛋白統(tǒng)一命名為sirtuin。sir2蛋白對(duì)細(xì)胞的存活、凋亡、衰老等生理活動(dòng)的調(diào)節(jié)具有重要作用。目前尚未有高表達(dá)sir2蛋白的雙歧桿菌的相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明進(jìn)一步對(duì)sir2蛋白和雙歧桿菌進(jìn)行研究，通過(guò)篩選具有頭孢抗性的雙歧桿菌，再通過(guò)免疫印跡篩選出高表達(dá)sir2蛋白的長(zhǎng)雙歧桿菌，使其在疾病治療或相關(guān)食品、保健品中發(fā)揮作用。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明篩選出一種具有頭孢抗性且高表達(dá)sir2蛋白的長(zhǎng)雙歧桿菌bifidobacteriumlongum，保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號(hào)為gdmccno.60191，保藏地址為廣東省廣州市越秀區(qū)先烈中路100號(hào)大院59號(hào)樓5樓，保藏日期為2017年5月24日。

本發(fā)明具有頭孢抗性且高表達(dá)sir2蛋白的長(zhǎng)雙歧桿菌bifidobacteriumlongumbl16可用于制備抗衰老、增強(qiáng)免疫功能、抗菌的食品或藥品。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明還提供了一種抗衰老食品，其包括有效劑量的作為活性成分的所述具有頭孢抗性且高表達(dá)sir2蛋白的長(zhǎng)雙歧桿菌bifidobacteriumlongumbl16。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明還提供了一種抗衰老藥品，其包括有效劑量的作為活性成分的所述具有頭孢抗性且高表達(dá)sir2蛋白的長(zhǎng)雙歧桿菌bifidobacteriumlongumbl16，以及藥學(xué)上可接受的載體。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明還提供了一種增強(qiáng)免疫功能的食品，其包括有效劑量的作為活性成分的所述具有頭孢抗性且高表達(dá)sir2蛋白的長(zhǎng)雙歧桿菌bifidobacteriumlongumbl16。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明還提供了一種增強(qiáng)免疫功能的藥品，其包括有效劑量的作為活性成分的所述具有頭孢抗性且高表達(dá)sir2蛋白的長(zhǎng)雙歧桿菌bifidobacteriumlongumbl16，以及藥學(xué)上可接受的載體。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明還提供了一種抗菌藥物，其包括有效劑量的作為活性成分的所述具有頭孢抗性且高表達(dá)sir2蛋白的長(zhǎng)雙歧桿菌bifidobacteriumlongumbl16，以及藥學(xué)上可接受的載體。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明還提供了一種調(diào)節(jié)腸道菌群的食品，其包括有效劑量的作為活性成分的權(quán)利要求1所述具有頭孢抗性且高表達(dá)sir2蛋白的長(zhǎng)雙歧桿菌bifidobacteriumlongumbl16和/或其菌體蛋白成分。該食品特別適用于因使用抗生素導(dǎo)致的腹瀉等腸道菌群紊亂的調(diào)節(jié)，使腸道菌群恢復(fù)平衡。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明還提供了一種調(diào)節(jié)腸道菌群的藥品，其包括有效劑量的作為活性成分的權(quán)利要求1所述具有頭孢抗性且高表達(dá)sir2蛋白的長(zhǎng)雙歧桿菌bifidobacteriumlongumbl16和/或其菌體蛋白成分，以及藥學(xué)上可接受的載體。該藥品特別適用于因使用抗生素導(dǎo)致的腹瀉等腸道菌群紊亂的調(diào)節(jié)，使腸道菌群恢復(fù)平衡。

相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，具有頭孢抗性且高表達(dá)sir2蛋白的長(zhǎng)雙歧桿菌bifidobacteriumlongumbl16具有一定的抑菌活性，還具有很強(qiáng)的頭孢抗性，可顯著提高器官中的mad含量，降低sod、gsh-px、no和nos的活性，因此本發(fā)明具有頭孢抗性且高表達(dá)sir2蛋白的長(zhǎng)雙歧桿菌bifidobacteriumlongumbl16可通過(guò)提高機(jī)體的抗氧化能力，清除衰老機(jī)體產(chǎn)生的過(guò)多自由基，抑制機(jī)體、組織、細(xì)胞的過(guò)氧化過(guò)程，最終起到延緩衰老和增強(qiáng)免疫的作用，可用于制備相關(guān)的食品或藥品，具有良好的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明長(zhǎng)雙歧桿菌sir2基因鑒定結(jié)果。

圖2為本發(fā)明長(zhǎng)雙歧桿菌蛋白電泳圖。

圖3為本發(fā)明長(zhǎng)雙歧桿菌sir2蛋白westernblot結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。

實(shí)施例1

1.益生菌初篩

收集3個(gè)正常人糞便樣品各1.0g，用lb培養(yǎng)基擴(kuò)增培養(yǎng)，蒸餾水稀釋至10^-8共9個(gè)稀釋度，取1ml，涂布到含有8～12g/l碳酸鈣的mrs分離固體培養(yǎng)基和改良mrs分離固體培養(yǎng)基上，置于厭氧培養(yǎng)箱中，37℃厭氧培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束后，取出平板挑選出具有可見(jiàn)溶鈣圈或藍(lán)色、淺藍(lán)色的菌落，并轉(zhuǎn)接至mrs增菌肉湯培養(yǎng)基中在37℃厭氧培養(yǎng)48h，并放入4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.菌株的形態(tài)學(xué)觀察。

將分離純化的菌株純培養(yǎng)物接種到增菌液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h復(fù)活后，經(jīng)革蘭氏染色操作后，在光學(xué)顯微鏡下觀察其細(xì)胞形態(tài)特征，并用帶有數(shù)字成像系統(tǒng)的顯微鏡選取合適視野進(jìn)行照相記錄。

3.分子生物學(xué)-16srdna鑒定：

16srdna全長(zhǎng)通用引物：引物1如seqidno：1所示；引物2如seqidno：2所示。

pcr反應(yīng)體系(25μl)：引物1/1.0μl；引物2/1.0μl；10×pcrbuffer/2.5μl；dntpmix/2.0μl；taq酶/0.3μl；dna模板/1.0μl；超純水/25μl。

pcr反應(yīng)條件為：先94℃-4min；再94℃-30s，55℃-40s，72℃-90s下循環(huán)30次，最后72℃-10min。

以無(wú)菌去離子水替代模板作為陰性對(duì)照。擴(kuò)增結(jié)束后取3.0μl擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)束后，切割待測(cè)膠帶送上海生工進(jìn)行序列測(cè)定。將測(cè)定菌株的序列結(jié)果與ncbi中已知的16srdna序列進(jìn)行blast對(duì)比分析得到最相近的菌株，以確定實(shí)驗(yàn)所分離細(xì)菌的種屬。

4.抑菌活性測(cè)定

待測(cè)菌為上述獲得的菌，對(duì)照菌株為鼠李糖乳桿菌，分別取各菌100μl于100ml的乳酸菌mrs增菌肉湯培養(yǎng)基中進(jìn)行活化復(fù)蘇。指示菌為escherichiacoliatcc11105、clostridiumdifficileny-5、staphylococcusaureusnt-12。

5.藥敏試驗(yàn)

選擇10種抗菌藥物藥敏紙片：頭孢吡肟(fep，20μg)，頭孢噻肟(ctx，20μg)，利福平(rf，10μg)，氨芐西林(am，10μg)，四環(huán)素(te，20μg)，氯霉素(chl，20μg)，環(huán)丙沙星(cip，10μg)，阿米卡星(ak，20μg)，慶大霉素(gm，10μg)，甲氧芐氨嘧啶(tmp，10μg)，均購(gòu)自廣州市宜康生物科技有限公司(oxoid)。

根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)頒布的kb法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。首先用無(wú)菌鑷子分別夾取含有不同抗生素的藥敏紙片，分別貼在已接種待測(cè)菌的各平板(200μl待測(cè)菌菌懸液含菌數(shù)為3.0×10⁸cfu/ml，分別加入到溫度為50℃左右的乳酸菌mrs增菌肉湯瓊脂培養(yǎng)基)中，迅速混合均勻，倒平板。每個(gè)平板貼大約5張藥敏紙片，各紙片間距離大致相等，并做好標(biāo)記。在37℃厭氧過(guò)夜培養(yǎng)，觀察平板抑菌情況，游標(biāo)卡尺測(cè)定抑菌圈的大小并記錄

6.sir2基因的鑒定

以待測(cè)菌的基因組dna為模板，長(zhǎng)雙歧桿菌sir2引物：上游引物如seqidno：3所示，下游引物如seqidno：4所示

pcr反應(yīng)體系：模板-1μl；上游引物-0.5μl；下游引物-0.5μl；dntp(10mm)-0.5μl；lataq(5u/μl)-0.5μl；10×pcrbuffer-2.5μl；滅菌水-19.5μl。

7.tricine-sds-page

a.蛋白多肽粗提

(a)收取dmem緩沖培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜之后的菌液100ml，10000rpm離心10min，分別收集菌體沉淀及上清液；

(b)菌體沉淀轉(zhuǎn)移至破壁管中，機(jī)械破壁，系數(shù)為4.0，時(shí)間為1min，重復(fù)6次，加入適量去離子水，10000rpm離心10min，除去沉淀，收集上清；

(c)用無(wú)菌蒸餾水清洗過(guò)濾膜組件3次，洗干凈保護(hù)液，流盡清洗液，將10kda中空纖維濾膜裝上，安裝好膜組件，再用pbs緩沖液沖洗組件3次；

(d)將離心后收集的上清液通過(guò)過(guò)濾膜組件，壓力為0.15mpa，溫度為37℃，時(shí)間為2h，得到的殘?jiān)?，用適量的無(wú)菌水溶解，重復(fù)過(guò)濾二次；

(e)取過(guò)濾液，加入固體硫酸銨至飽和度為40％，靜置30min，離心除去沉淀，離心后得到的上清液繼續(xù)加入固體硫酸銨至飽和度為60％，于0℃下靜放3h，12000rpm離心10min，棄去上清，收集沉淀物，

(f)使用0.1m的醋酸銨甲醇溶液清洗沉淀兩次，再用80％已預(yù)冷的的丙酮溶液潤(rùn)洗三次，加入100％冷凍丙酮洗一次，低溫干燥30min，加入適量蒸餾水溶解干燥物，備用。

b.電泳

(a)先注入分離膠，待分離膠凝固45min后，再注入夾層膠，約45min待夾層膠凝固，最后加入濃縮膠，凝固45min；

(b)在電泳槽底部加入正極緩沖液，把制好的膠板同其制膠裝置一起放入電泳槽內(nèi)，在膠層間加入負(fù)極緩沖液，將整個(gè)電泳裝置置于冰上，用60v的電壓先電泳30min；

(c)取少量分離得到的蛋白樣品，用樣品緩沖液稀釋至5ml，開(kāi)始加樣電泳，當(dāng)染料從夾層膠進(jìn)入分離膠后，電壓加到120v，繼續(xù)電泳，直至染料到達(dá)分離膠頂端，停止電泳；

(d)取出電泳槽中的膠板，即刻置于固定液中浸泡固定1.5h，再將膠板取出，于45℃的染色液中浸泡1.5h，然后用無(wú)菌蒸餾水將膠板洗滌兩次，最后用變換脫色液，清洗多次，當(dāng)看到明顯的條帶和清晰的背景則停止沖洗；

(e)洗脫后，用凝膠成像儀成像，觀察目的蛋白的表達(dá)，并拍照保存。

8.westernblotting

(1)制膠：配置12％的分離膠并注入玻璃板間隙至離上邊緣1.5cm處，上層加適量75％乙醇；待凝固，倒掉上層液體，注入5％濃縮膠，插入梳子，自然晾干。

(2)上樣：將蛋白質(zhì)樣品100℃水浴3min，在電泳槽中倒入新配置的電泳液，分別在兩邊泳道加入8μl和5μl蛋白maker，用1×蛋白上樣緩沖液補(bǔ)足體積到10μl，其余泳道各加10μl樣品，50v恒壓跑電泳。

(3)轉(zhuǎn)膜：電泳結(jié)束后，剪取11cm×8cm濾紙和合適大小的0.22μm的pvdf膜，用甲醇活化5min，按照“海綿-6層濾紙-凝膠-pvdf膜-6層濾紙-海綿”組裝轉(zhuǎn)印夾層，夾板組裝后轉(zhuǎn)移至轉(zhuǎn)膜槽，200ma恒流轉(zhuǎn)移60min。

(4)孵育抗體：轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，tbs液洗膜5min，5％的脫脂奶粉封閉1h，tbst液洗膜3次，每次5min，加一抗兔抗人sirt3多克隆抗體稀釋液4℃過(guò)夜孵育；tbst液洗膜3次，每次5min，加二抗兔抗稀釋液室溫孵育1h。

(5)發(fā)光檢測(cè)：tbst液洗膜，加發(fā)光液孵育3min，用濾紙吸干發(fā)光液，將膠片和pvdf膜放入壓片盒中壓片1min，取出膠片定影30s，用水清洗，烘干，掃描。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1.菌體的生長(zhǎng)情況的檢查結(jié)果見(jiàn)表1。

表1菌體生長(zhǎng)情況檢查結(jié)果

2.16srdna鑒定結(jié)果

進(jìn)入ncbi核酸數(shù)據(jù)庫(kù)http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi，輸入待測(cè)菌株的16srdna序列，點(diǎn)擊blast進(jìn)入比對(duì)。

比對(duì)結(jié)果顯示，有三種菌株的16srdna序列與其它多株長(zhǎng)雙歧桿菌的16srdna序列有99％的相似性，初步判斷為長(zhǎng)雙歧桿菌(bifidobacteriumlongum)，將其命名為bifidobacteriumlongumbl12，bifidobacteriumlongumbl14，bifidobacteriumlongumbl16。

3.抑菌活性測(cè)定

抑菌活性的試驗(yàn)結(jié)果，見(jiàn)表2，三株長(zhǎng)雙歧桿菌都有一定的抑菌能力。

表2b.longum抑菌活性的試驗(yàn)結(jié)果

4.藥敏試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3所示。篩選到的三株長(zhǎng)雙歧桿菌都具有很強(qiáng)的頭孢抗性。

表3b.longum的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

注：s-敏感；r-耐藥；i-中度耐藥。

5.sir2基因pcr鑒定結(jié)果

如圖1所示，在651bp處分別擴(kuò)增出三條長(zhǎng)雙歧桿菌sir2基因條帶。

6.tricine-sds-page結(jié)果

如圖2所示，三株長(zhǎng)雙歧桿菌sir2蛋白分別在2.7kd處有一條明亮的條帶。

7.westernblotting

如圖3westernblot結(jié)果顯示，長(zhǎng)雙歧桿菌中b.longumbl16的sir2蛋白表達(dá)量最高。因此，成功篩選到帶有頭孢抗性且高表達(dá)sir2蛋白的長(zhǎng)雙歧桿菌b.longumbl16。

實(shí)施例2

本實(shí)施例通過(guò)長(zhǎng)雙歧桿菌bifidobacteriumlongumbl16(下稱(chēng)b16)喂飼用d-半乳糖所致亞急性衰老小鼠為衰老動(dòng)物模型，對(duì)小鼠各器官的指數(shù)和生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定和比較，探討b16的作用。

1.動(dòng)物分組

昆明種小鼠40只，雌雄各半，體重(20±2)g，暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。適應(yīng)性飼養(yǎng)1w后，隨機(jī)分為四組，每組10只。第一組為空白對(duì)照組、第二組為模型對(duì)照組，第三組為雙歧桿菌組。

2.藥品及試劑

b16為實(shí)施例1所得；d-半乳糖購(gòu)至北京鼎國(guó)生物有限公司，sod、mda、gsh-px、no、nos試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

3.模型建立及給藥方案

模型對(duì)照組和給藥組小鼠每日接受頸背部皮下注射d-半乳糖0.15mg/g體重(生理鹽水配制)，對(duì)照組注射等量的生理鹽水；同時(shí)給藥組小鼠每日分別灌胃b16液(雙歧桿菌濃度到10¹⁰，每日灌胃給藥1ml)，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組小鼠灌胃等量的生理鹽水，共40d。

4.檢測(cè)指標(biāo)

各組動(dòng)物經(jīng)連續(xù)處理40d后稱(chēng)重，斷頸處死，取出腦，胸腺、脾、肝、腎，用0.9％生理鹽水洗凈殘留血液后精確稱(chēng)重，計(jì)算器官指數(shù)。用于切片的腦組織置于10％甲醛中固定，其余臟器組織用錫箔紙包好，置-80℃超低溫冰箱保存待用。

5.各臟器指數(shù)的測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取小鼠全腦、胸腺、脾臟濕重后，計(jì)算各臟器指數(shù)(mg/g)〔胸腺重量(mg)/體重(g)〕。

6.腦組織中生化指標(biāo)的測(cè)定

將凍存的腦組織放入組織勻漿機(jī)配用的玻璃管中，加入9倍體積預(yù)冷的生理鹽水(蒸餾水)，充分研磨后，制成10％腦組織勻漿。采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定腦組織勻漿中總蛋白含量；硫代巴比妥酸反應(yīng)物法測(cè)定mda含量；酶法檢測(cè)gsh-px的活性；硝酸還原法檢測(cè)no具體檢測(cè)方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均以x±s表示，多組間比較采用spss13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析。

表4實(shí)驗(yàn)組對(duì)衰老小鼠臟器指數(shù)的影響

表5實(shí)驗(yàn)組對(duì)腦組織中生化指標(biāo)的影響

結(jié)果：

1.bl16對(duì)衰老小鼠臟器指數(shù)的影響(見(jiàn)表4)。與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠腦、胸腺、脾，肝、腎指數(shù)均減小(p＜0.05)，實(shí)驗(yàn)組小鼠各器官指數(shù)明顯升高。

組織器官的重量，特別是腦、胸腺、脾、肝、腎等重要器官的重量變化是反映生物體衰老程度的重要指標(biāo)。免疫器官衰變最明顯的是胸腺和脾，胸腺和脾重量的降低、萎縮、功能衰退可使免疫功能降低，導(dǎo)致老年動(dòng)物(人)惡性疾病發(fā)生率增高，加速老化進(jìn)程。本結(jié)果顯示d-半乳糖誘導(dǎo)的亞急性衰老小腦、胸腺、脾臟、肝、腎指數(shù)均顯著下降，bl16治療明顯提高了衰老小鼠腦、胸腺、脾臟、肝、腎重量，說(shuō)明bl16能夠有效對(duì)抗小鼠腦的衰老，保持機(jī)體的免疫功能，提高抗病能力，從而對(duì)延緩衰老和增強(qiáng)免疫力具有積極的意義。

2.bl16對(duì)衰老小鼠組織sod、mad、gsh-px、no、nos的影響(見(jiàn)表5)。與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠腦組織mad含量顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意(p＜0.01)，sod、gsh-px、no、nos活性明顯降低(p＜0.01)，差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。

生物體存在抗氧化系統(tǒng)，其中sod是最關(guān)鍵的酶之一。此酶能清除超氧陰離子自由基、保護(hù)細(xì)胞免受損傷，其活性高低間接反映了機(jī)體的抗氧化能力。美國(guó)巴樂(lè)的摩老年醫(yī)學(xué)研究中心研究證明，哺乳動(dòng)物體內(nèi)sod含量與其壽命之間呈明顯正相關(guān)關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：bl16能明顯增強(qiáng)d-半乳糖誘導(dǎo)衰老小鼠的腦組織sod活性，提高腦組織對(duì)自由基的清除能力，阻斷自由基應(yīng)答。

自由基是機(jī)體正常代謝產(chǎn)生，但過(guò)多的自由基可侵犯細(xì)胞，特別是腦組織中的不飽和脂肪酸，引起脂質(zhì)過(guò)氧化，形成代謝產(chǎn)物mda，繼而形成脂褐素，通過(guò)與蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子交聯(lián)，破壞正常細(xì)胞的功能。因此，mda含量常?？煞从硻C(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，間接反映細(xì)胞的損傷程度，是老化的重要指標(biāo)。

no由nos利用左旋精氨酸內(nèi)源性合成，是具有廣泛的生物學(xué)作用的小分子物質(zhì)，能溶于水和脂質(zhì)，可通過(guò)旁分泌快速擴(kuò)散至鄰近細(xì)胞，與細(xì)胞內(nèi)鳥(niǎo)氨酸環(huán)化酶上的血紅素基因結(jié)合激活該酶，由鳥(niǎo)氨酸環(huán)化酶催化鳥(niǎo)氨酸生成環(huán)鳥(niǎo)營(yíng)(cgmp)。cgmp作為第二信使，通過(guò)信號(hào)級(jí)聯(lián)放大作用，引起一系列生物學(xué)效應(yīng)。no在神經(jīng)系統(tǒng)中的主要作用為介導(dǎo)神經(jīng)元對(duì)興奮性氨基酸的反應(yīng)和增強(qiáng)機(jī)體的學(xué)習(xí)記憶能力等，其含量降低與衰老及許多老年性疾病如老年性癡呆、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等的發(fā)生有關(guān)。nos是no合成的限速酶，含有nos的神經(jīng)元在中樞神經(jīng)系統(tǒng)許多部位存在，包括大腦皮層、海馬、下丘腦等，no在這些部位的神經(jīng)元活動(dòng)調(diào)控中起重要作用。生理性衰老與腦組織內(nèi)nos活性降低密切相關(guān)。nos活性降低，使腦中no含量下降，從而可導(dǎo)致巨噬細(xì)胞吞噬能力下降；使有活性的鳥(niǎo)昔酸環(huán)化酶含量降低，調(diào)節(jié)多種代謝的能力減弱，可進(jìn)一走加速衰老。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：模型衰老小鼠的nos活性和no含量顯著下降，bl16能明顯提高衰老模型小鼠的nos活性和no含量。上述結(jié)果提示bl16能通過(guò)增強(qiáng)nos活性，使no生成量增多，其生物學(xué)效應(yīng)能持久發(fā)揮，從而可延緩機(jī)體衰老。

gsh-px是廣泛存在于機(jī)體內(nèi)的一種重要的催化過(guò)氧化分解的酶，它特異性地催化gsh對(duì)過(guò)氧化氫的還原反應(yīng)，抑制煙酸胺腺嘌呤二核苷酸(nadh)形成oh-，削弱對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化作用的損傷，從而起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明bl16可顯著提高d-半乳糖致衰老小鼠腦組gsh-px活性，提高體內(nèi)抗氧化酶活性，減輕自由基對(duì)生物大分子的傷害，而起到延緩衰老的作用。

綜上，本實(shí)驗(yàn)表明雙歧桿菌能提高sod、gsh-px、no和nos的水平，降低mda的含量，提示雙歧桿菌可能是通過(guò)提高機(jī)體抗氧化能力，清除衰老機(jī)體產(chǎn)生過(guò)多的自由基，抑制機(jī)體、組織、細(xì)胞的過(guò)氧化過(guò)程，而起到延緩衰老作用。

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