本發(fā)明涉及病原菌的快速檢測(cè)方法技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種快速檢測(cè)副豬嗜血桿菌血清13型的方法。

背景技術(shù)：

副豬嗜血桿菌(haemophilusparasuis,hps)是一種重要的豬呼吸道病原菌，目前已至少鑒定出15個(gè)血清型，不同血清型菌株之間存在高毒力、中等毒力和無(wú)毒力等顯著差異，鑒定hps血清型對(duì)該病的診斷和防治具有重要意義。hps血清13型是高毒力菌株，又是我國(guó)目前流行最多、分布范圍最廣的血清型之一。目前該菌常規(guī)血清型鑒定方法為細(xì)菌分離培養(yǎng)和鑒定的基礎(chǔ)上，通過(guò)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)與hps所有血清型的陽(yáng)性血清進(jìn)行反應(yīng)來(lái)判定血清型，通常需要3-5天的時(shí)間，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且約有30％的hps分離菌株不能被準(zhǔn)確鑒定出血清型，嚴(yán)重影響副豬嗜血桿菌病的快速診斷和檢測(cè)。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(lamp，國(guó)際專利公開號(hào)wo00/28082)是2000年notomi等開發(fā)出的一種核酸擴(kuò)增新技術(shù)，即針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異性引物(如需要還可以添加環(huán)引物對(duì))，利用一種鏈置換dna聚合酶(bstdnapolymerase)在65℃左右恒溫條件保溫約60分鐘，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增結(jié)果可通過(guò)凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。用于lamp技術(shù)擴(kuò)增的2對(duì)引物是針對(duì)靶基因序列的6個(gè)區(qū)段，因而具有比pcr更高的特異性，同時(shí)也具備不需要熱循環(huán)、擴(kuò)增效率更高、不需要特殊儀器等優(yōu)點(diǎn)。

副豬嗜血桿菌感染的流行病學(xué)研究主要利用血清學(xué)分型方法開展，即在hps分離培養(yǎng)和鑒定的基礎(chǔ)上，通過(guò)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)與hps所有血清型的陽(yáng)性血清進(jìn)行反應(yīng)來(lái)判定血清型，通常需要3-5天的時(shí)間，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且約有30％的hps分離菌株不能被準(zhǔn)確鑒定出血清型，嚴(yán)重影響副豬嗜血桿菌病的快速診斷和檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的技術(shù)目的是建立一種簡(jiǎn)便、快速、高靈敏度、高特異性、高準(zhǔn)確度的hps血清13型lamp檢測(cè)方法。

為快速準(zhǔn)確地鑒定hps血清13型，本發(fā)明參考genbank發(fā)表的副豬嗜血桿菌血清13型ia-84-17975菌株的糖脂轉(zhuǎn)移蛋白(glycolipidtransferproteingene，gltp)基因序列(登錄號(hào)kc795500.1)，運(yùn)用引物設(shè)計(jì)軟件primerexplorer4.0，在線進(jìn)行l(wèi)amp引物設(shè)計(jì)。按照引物設(shè)計(jì)原則，針對(duì)其6個(gè)特定區(qū)域設(shè)計(jì)4條引物：兩條外引物分別為上游外引物(f3)和下游外引物(b3)；兩條內(nèi)引物分別為上游內(nèi)引物(fip)和下游內(nèi)引物(bip)，fip由f1的互補(bǔ)序列和正向序列f2構(gòu)成，bip由b1的互補(bǔ)序列和正向序列b2構(gòu)成，靶基因片段即為上游外引物f3與下游外引物b3之間的基因序列。依據(jù)primerexplorer4.0設(shè)計(jì)的引物，可獲得多個(gè)靶基因片段，然后運(yùn)用blast進(jìn)行序列比對(duì)，篩選出gltp基因特異性高且高度保守的靶基因片段(如seqidno.5所示)。創(chuàng)新性發(fā)現(xiàn)，此gltp基因特異性片段經(jīng)lamp方法擴(kuò)增，僅在恒溫條件下(62℃)反應(yīng)60分鐘，即可將目的dna從幾個(gè)拷貝擴(kuò)增到10⁹個(gè)拷貝，通過(guò)電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物來(lái)判定結(jié)果。故而可作為一種運(yùn)用lamp技術(shù)快速檢測(cè)hps血清13型方法的分子標(biāo)記使用。

在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明進(jìn)一步提供一組環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物，其可特異性環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增所述的分子標(biāo)記。根據(jù)一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述引物組包括上游外引物f3和下游外引物b3，其核苷酸序列如seqidno.1-2所示；以及上游內(nèi)引物fip和下游內(nèi)引物bip，其核苷酸序列如seqidno.3-4所示。

更進(jìn)一步，本發(fā)明提供一種快速檢測(cè)副豬嗜血桿菌血清13型的方法，以待測(cè)樣品細(xì)胞基因組dna為模板，利用權(quán)利要求3或4所述的特異性引物組進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)。所述待測(cè)樣品細(xì)胞基因組dna可以將待測(cè)樣品經(jīng)常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)后提取細(xì)菌基因組dna。

所述的方法，還包括步驟：設(shè)置陰性對(duì)照模板和陽(yáng)性對(duì)照模板，陰性對(duì)照模板為超純水，陽(yáng)性對(duì)照模板為hps血清13型參考菌株hs1079基因組dna；利用凝膠電泳對(duì)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，電泳結(jié)果出現(xiàn)特征性梯度狀電泳條帶判定為陽(yáng)性，若無(wú)任何擴(kuò)增產(chǎn)物則為陰性。

優(yōu)選的，所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體系包括：10×lampbufffer：2.5μl；10mmol/l的dntps：3.0μl；0.25mol/l的mgso4：0.2μl；5mol/l的betaine：0.5μl；10μmol/l的fip引物：2.0μl；10μmol/l的bip引物：2.0μl；10μmol/l的f3引物：0.5μl；10μmol/l的b3引物：0.5μl；8u/μl的bstdna聚合酶：0.7μl；模板dna：1.0μl；用滅菌超純水補(bǔ)足體系至25μl；

其中10×lampbufffer組成：200mmol/ltris-hcl，100mmol/lkcl，20mmol/lmgso4，100mmol/l(nh4)2so4，1.0％tritonx-100。

所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)條件如下：95℃變性5min，取出樣品冰浴，加入bstdna聚合酶，然后62℃反應(yīng)60min，最后80℃反應(yīng)10min終止反應(yīng)。

所述方法中使用的試劑優(yōu)選制作為快速檢測(cè)副豬嗜血桿菌血清13型的試劑盒，包括所述特異性引物組。

優(yōu)選的包括：

10×lampbufffer：2.5μl；10mmol/l的dntps：3.0μl；0.25mol/l的mgso4：0.2μl；5mol/l的betaine：0.5μl；10μmol/l的fip引物：2.0μl；10μmol/l的bip引物：2.0μl；10μmol/l的f3引物：0.5μl；10μmol/l的b3引物：0.5μl；8u/μl的bstdna聚合酶：0.7μl；模板dna：1.0μl；使用時(shí)用滅菌超純水補(bǔ)足體系至25μl；

其中10×lampbufffer組成：200mmol/ltris-hcl，100mmol/lkcl，20mmol/lmgso4，100mmol/l(nh4)2so4，1.0％tritonx-100。

本發(fā)明通過(guò)提供一種副豬嗜血桿菌血清13型的特異性基因片段及具有特異性的引物組，及其用包含有上述引物組的試劑盒檢測(cè)樣品中是否存在副豬嗜血桿菌血清13型特異性基因片段進(jìn)而確定樣品是否為副豬嗜血桿菌血清13型。本發(fā)明檢測(cè)試劑和檢測(cè)方法具有敏感性高(對(duì)hps血清13型基因組dna的檢測(cè)敏感度為2.5pg，對(duì)hps血清13型菌液的檢測(cè)敏感度為20cfu/ml)、特異性強(qiáng)(僅檢測(cè)hps血清13型參考菌株和分離菌株為陽(yáng)性，而對(duì)hps其它血清型參考和分離菌株、以及其它種屬的細(xì)菌檢測(cè)均為陰性)、方便快捷(整個(gè)檢測(cè)在3小時(shí)內(nèi)完成，與現(xiàn)有的瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)血清型相比省時(shí)2-3天)、不需要特殊儀器(在恒溫水浴鍋中就可反應(yīng))、適用范圍廣(適用于獸醫(yī)科研檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室、檢驗(yàn)檢疫部門、養(yǎng)殖企業(yè)等)等優(yōu)點(diǎn)，可解決副豬嗜血桿菌血清13型的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)和基層普及應(yīng)用的難題。

附圖說(shuō)明

圖1：lamp檢測(cè)hps不同血清型菌株的特異性結(jié)果，其中m：dl2000dnamarker；1-18孔所用模板對(duì)應(yīng)的菌株與表3中的菌株序號(hào)一致，其中15孔出現(xiàn)陽(yáng)性條帶，為hps血清13型參考菌株hs1079。

圖2：lamp檢測(cè)其它種屬細(xì)菌菌株的特異性結(jié)果，其中m：dl2000dnamarker；1-19孔所用模板對(duì)應(yīng)的菌株與表4中的菌株序號(hào)一致，20孔為hps血清13型參考菌株hs1079作為陽(yáng)性對(duì)照。

圖3：lamp檢測(cè)hps血清13型基因組dna的敏感性結(jié)果，其中m：dl2000dnamarker；模板dna的量分別標(biāo)注于泳道上面，檢測(cè)結(jié)果顯示本發(fā)明的檢測(cè)限為2.5pg。

圖4：lamp檢測(cè)hps血清13型菌液的敏感性結(jié)果，其中m：dl2000dnamarker；泳道上面的標(biāo)注為菌液的稀釋度，檢測(cè)結(jié)果顯示本發(fā)明的檢測(cè)限0.5個(gè)菌，敏感性為0.02cfu/μl(20cfu/ml)。

圖5：lamp檢測(cè)臨床分離hps菌株結(jié)果，其中m：dl2000；1-22孔所用模板對(duì)應(yīng)的菌株與表5中的菌株序號(hào)一致，結(jié)果顯示只有孔道18、19、20、21、22這5株hps血清13型菌株出現(xiàn)典型的梯狀條帶，其它血清型菌株均為陰性。

圖6：lamp反應(yīng)中dntps濃度的優(yōu)化結(jié)果。

圖7：lamp反應(yīng)中bstdna聚合酶用量的優(yōu)化結(jié)果。

圖8：lamp反應(yīng)中mg²⁺濃度的優(yōu)化結(jié)果。

圖9：lamp反應(yīng)中betaine濃度的優(yōu)化結(jié)果。

圖10：lamp反應(yīng)中反應(yīng)溫度的優(yōu)化結(jié)果。

圖11：lamp反應(yīng)中反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。

若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

實(shí)施例1lamp引物的設(shè)計(jì)和合成

參考genbank發(fā)表的副豬嗜血桿菌血清13型ia-84-17975菌株的糖脂轉(zhuǎn)移蛋白(glycolipidtransferproteingene，gltp)基因序列(登錄號(hào)kc795500.1)，運(yùn)用引物設(shè)計(jì)軟件primerexplorer4.0，在線進(jìn)行l(wèi)amp引物設(shè)計(jì)。按照引物設(shè)計(jì)原則，針對(duì)其6個(gè)特定區(qū)域設(shè)計(jì)4條引物：兩條外引物分別為上游外引物(f3)和下游外引物(b3)；兩條內(nèi)引物分別為上游內(nèi)引物(fip)和下游內(nèi)引物(bip)，fip由f1的互補(bǔ)序列和正向序列f2構(gòu)成，bip由b1的互補(bǔ)序列和正向序列b2構(gòu)成，靶基因片段即為上游外引物f3與下游外引物b3之間的基因序列。依據(jù)primerexplorer4.0設(shè)計(jì)的引物，可獲得多個(gè)靶基因片段，然后運(yùn)用blast進(jìn)行序列比對(duì)，篩選出gltp基因特異性高且高度保守的靶基因片段(如seqidno.5所示)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物名稱和序列見表1。

表1lamp所用引物名稱及序列

實(shí)施例2用作模板的hps細(xì)菌基因組dna提取

取分離培養(yǎng)的hps菌株，劃線培養(yǎng)于添加終濃度100μg/mlnad的胰酶大豆瓊脂(tsa)平板上，于37℃溫箱中培養(yǎng)過(guò)夜。自培養(yǎng)平板上挑取單菌落接種于5ml添加終濃度100μg/mlnad的胰酶大豆肉湯(tsb)培養(yǎng)基中，于37℃搖床中振搖培養(yǎng)過(guò)夜。取過(guò)夜培養(yǎng)的菌液1ml，離心后棄上清液，菌沉淀重懸于50μl超純水中，煮沸5min裂解細(xì)菌后，離心取上清液1.0μl用于lamp反應(yīng)模板。

實(shí)施例3lamp反應(yīng)體系的建立

lamp反應(yīng)體系總量為25μl，反應(yīng)組分見表2。

表2lamp反應(yīng)體系的組分及添加量

lamp反應(yīng)在pcr儀中進(jìn)行，首先95℃變性5min，取出樣品冰浴，加入bstdna聚合酶，然后62℃反應(yīng)60min，最后80℃反應(yīng)10min終止反應(yīng)。利用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)lamp擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，電泳結(jié)果出現(xiàn)特征性梯度狀電泳條帶判定為陽(yáng)性，若無(wú)任何擴(kuò)增產(chǎn)物則為陰性。

實(shí)施例4lamp反應(yīng)體系中主要影響因子的篩選和優(yōu)化

對(duì)lamp反應(yīng)體系中主要影響因子如dntps濃度、bstdna聚合酶用量、鎂離子濃度、betaine濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間等分別篩選優(yōu)化的基礎(chǔ)上建立本發(fā)明lamp反應(yīng)體系。

(1)dntps濃度的優(yōu)化

反應(yīng)體系中dntps的濃度依次為0.4mmol/l、0.8mmol/l、1.2mmol/l、1.6mmol/l、2.0mmol/l、2.4mmol/l、2.8mmol/l，從而確定dntps最小的適宜添加濃度。結(jié)果如圖6所示，dntps濃度在0.8mmol/l～2.8mmol/l時(shí)均出現(xiàn)梯形條帶，當(dāng)濃度處于2.4～2.8mmol/l時(shí)擴(kuò)增條帶較亮。

(2)bstdna聚合酶用量的優(yōu)化

反應(yīng)體系中bstdna聚合酶以0.5μl、0.7μl、0.9μl、1.1μl、1.3μl、1.5μl的用量依次加入，從而在節(jié)約的原則下確定bstdna聚合酶的最佳用量。結(jié)果如圖7所示，bstdna聚合酶加入量在0.5μl～1.5μl范圍內(nèi)均能產(chǎn)生梯形條帶，且0.7μl～1.3μl范圍內(nèi)的酶加入量反應(yīng)條帶較亮，因此從較經(jīng)濟(jì)的角度認(rèn)為0.7μlbstdna聚合酶為最佳添加量。

(3)鎂離子濃度的優(yōu)化

向反應(yīng)體系中單獨(dú)加入mg²⁺的濃度依次為0.0mmol/l、0.5mmol/l、1.0mmol/l、1.5mmol/l、2.0mmol/l、2.5mmol/l、3.0mmol/l、4.0mmol/l，在這幾個(gè)梯度濃度中優(yōu)化出適宜的mg²⁺濃度。結(jié)果如圖8所示，反應(yīng)體系中添加mg²⁺濃度為0～4.0mmol/l時(shí)，均能擴(kuò)增出梯形條帶，mg²⁺添加濃度為1.5～3.0mmol/l時(shí)條帶較亮。(4)betaine(甜菜堿)濃度的優(yōu)化

向反應(yīng)體系中加入betaine的濃度依次為0.0mol/l、0.1mol/l、0.2mol/l、0.4mol/l、0.8mol/l、1.6mol/l，在這幾個(gè)梯度濃度中優(yōu)化出適宜的betaine濃度。結(jié)果如圖9所示，反應(yīng)體系中添加betaine濃度為0或高濃度1.6mol/l時(shí)無(wú)梯形條帶產(chǎn)生，0.1～0.8mol/l時(shí)均能擴(kuò)增出梯形條帶，其中以0.4～0.8mol/l時(shí)擴(kuò)增梯形條帶較亮。(5)反應(yīng)溫度的優(yōu)化

為了分析溫度對(duì)lamp試驗(yàn)的影響，設(shè)計(jì)梯度溫度依次為60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃，其他反應(yīng)條件不變，在這幾個(gè)反應(yīng)溫度中優(yōu)化出適宜溫度。結(jié)果如圖10所示，60.0～61.0℃時(shí)無(wú)梯形條帶，61.0～65.0℃下均能擴(kuò)增出梯形條帶，而以62℃條件下擴(kuò)增產(chǎn)物較亮。

(6)反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化

反應(yīng)體系相同，按30min、35min、40min、45min、50min、55min、60min、65min不同時(shí)間進(jìn)行l(wèi)amp擴(kuò)增，從而確定出適宜的反應(yīng)時(shí)間。結(jié)果如圖11所示，反應(yīng)時(shí)間為30min時(shí)無(wú)梯形條帶產(chǎn)生，35～65min范圍內(nèi)均可產(chǎn)生梯形條帶，且60-65min時(shí)擴(kuò)增條帶較亮。

實(shí)施例5具體檢測(cè)方法的建立

(1)細(xì)菌培養(yǎng)。取擬鑒定血清型的hps分離菌株，接種于5ml添加終濃度100μg/ml煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)的胰酶大豆肉湯(tsb)培養(yǎng)基中，于37℃搖床中振搖培養(yǎng)過(guò)夜。

(2)細(xì)菌基因組dna的提取。取過(guò)夜培養(yǎng)的菌液1ml，離心后棄上清液，菌沉淀重懸于50μl超純水中，煮沸5min裂解細(xì)菌后，離心取上清液1.0μl作為lamp反應(yīng)模板。

(3)hps分離株的lamp檢測(cè)。按照表2中的lamp反應(yīng)體系將除bstdna聚合酶外的其它組分加入0.2ml反應(yīng)管中，放入pcr儀中，95℃變性5min，取出樣品冰浴，加入bstdna聚合酶，然后62℃反應(yīng)60min，最后80℃反應(yīng)10min終止反應(yīng)。同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。

(4)lamp擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)。利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)：取9μllamp擴(kuò)增產(chǎn)物加1μl10×上樣緩沖液混勻，以dl2000dnamarker作為相對(duì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，用含核酸染色劑的1.5％瓊脂糖凝膠在100v電壓下電泳約30min，于凝膠成像系統(tǒng)中拍照分析結(jié)果。電泳圖片顯示lamp特征性梯度狀條帶，則結(jié)果為陽(yáng)性；如無(wú)任何條帶則結(jié)果為陰性。

實(shí)施例6特異性實(shí)驗(yàn)

取甘油保存的hps不同血清型菌株，劃線培養(yǎng)于添加終濃度100μg/mlnad的胰酶大豆瓊脂(tsa)平板上，于37℃溫箱中培養(yǎng)過(guò)夜。自培養(yǎng)平板上挑取單菌落接種于5ml添加終濃度100μg/mlnad的胰酶大豆肉湯(tsb)培養(yǎng)基中，于37℃搖床中振搖培養(yǎng)過(guò)夜。針對(duì)用于鑒定lamp菌種間特異性試驗(yàn)所用的其它種屬細(xì)菌菌株，同樣取適量甘油保存的相應(yīng)菌株，劃線培養(yǎng)于tsa平板，于37℃溫箱中培養(yǎng)過(guò)夜。自培養(yǎng)平板上挑取單菌落接種于5mltsb培養(yǎng)基中，于37℃搖床中振搖培養(yǎng)過(guò)夜。利用promega公司的細(xì)菌全基因組dna提取試劑盒抽提細(xì)菌基因組dna，操作步驟簡(jiǎn)述為：取2ml培養(yǎng)12～16h的菌液至1.5ml離心管；13,000rpm離心2min，棄凈上清，留取菌體沉淀；加入600μlnucleilysissolution，輕輕吹打至沉淀重懸；80℃培養(yǎng)5min，使菌體裂解，然后使其冷卻至室溫；加入3μlrnasesolution，顛倒2～5次，混勻；水浴37℃培養(yǎng)30min，并冷卻至室溫；加入200μlproteinprecipitationsolution，高速渦旋振蕩20s；將樣品在冰上放置5min；13,000rpm離心10min；將含有dna的上清液轉(zhuǎn)移至一個(gè)干凈的的裝有600μl異丙醇的1.5ml離心管；輕輕顛倒混勻直至出現(xiàn)線狀dna；13,000rpm離心5min；輕輕倒出上清液，并用干凈的吸水紙將管內(nèi)殘液吸干；加入600μl70％乙醇，輕輕顛倒幾次；13,000rpm離心2min，小心吸出乙醇；將離心管在空氣中晾10～15min，至乙醇完全蒸發(fā)；加入100μldnarehydrationsolution，65℃培養(yǎng)1h水化dna，并定期敲打離心管，也可在4℃過(guò)夜水化dna；將提取的dna保存于-20℃。提取的模板dna通過(guò)凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)分析其質(zhì)量和濃度。核酸濃度測(cè)定：用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定核酸在260nm和280nm處的紫外吸收值，以260nm和280nm處的紫外吸收值的比值計(jì)算純度，高質(zhì)量dna的od260/280的值在1.8左右。細(xì)菌基因組dna完整性測(cè)定：取3μl提取的模板dna溶液電泳，選用的電泳膠為1.0％的瓊脂糖凝膠，在紫外投射儀下檢測(cè)dna的大小，根據(jù)其亮度和擴(kuò)散管程度來(lái)判斷dna的完整性。

(1)lamp檢測(cè)hps不同血清型菌株的特異性

分別以表3中的18株副豬嗜血桿菌不同血清型的參考菌株基因組dna作為模板，利用優(yōu)化后的lamp反應(yīng)體系和程序進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳鑒定hps血清型特異性。檢測(cè)結(jié)果見表3和圖1，hps血清13型參考菌株hs1079的孔內(nèi)有明顯的階梯狀條帶，其它血清型孔內(nèi)無(wú)條帶出現(xiàn)，表明本發(fā)明的lamp反應(yīng)體系對(duì)hps不同血清型菌株具有高特異性。

(2)lamp檢測(cè)其它種屬細(xì)菌菌株的特異性

分別以表4中的19株其它種屬細(xì)菌菌株基因組dna作為模板，利用優(yōu)化后的lamp反應(yīng)體系和程序進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳鑒定lamp方法對(duì)其它種屬細(xì)菌的特異性。檢測(cè)結(jié)果見表4和圖2，hps血清13型參考菌株hs1079的孔內(nèi)有明顯的階梯狀條帶，其它種屬細(xì)菌菌株孔內(nèi)無(wú)條帶出現(xiàn)，表明本發(fā)明的lamp反應(yīng)體系對(duì)其它種屬細(xì)菌菌株具有高特異性。

表3lamp檢測(cè)hps不同血清型菌株的特異性

注：檢測(cè)結(jié)果中“-”為陰性；“+”為陽(yáng)性。

表4lamp檢測(cè)其它種屬細(xì)菌菌株的特異性

注：檢測(cè)結(jié)果中“-”為陰性。

實(shí)施例7敏感性實(shí)驗(yàn)

(1)lamp檢測(cè)hps血清13型基因組dna的敏感性

取甘油保存的hps血清13型參考菌株hs1079，劃線培養(yǎng)于添加終濃度100μg/mlnad的胰酶大豆瓊脂(tsa)平板上，于37℃溫箱中培養(yǎng)過(guò)夜。自培養(yǎng)平板上挑取單菌落接種于5ml添加終濃度100μg/mlnad的胰酶大豆肉湯(tsb)培養(yǎng)基中，于37℃搖床中振搖培養(yǎng)過(guò)夜。利用promega公司的細(xì)菌全基因組dna提取試劑盒抽提細(xì)菌基因組dna，操作步驟簡(jiǎn)述為：取2ml培養(yǎng)12～16h的菌液至1.5ml離心管；13,000rpm離心2min，棄凈上清，留取菌體沉淀；加入600μlnucleilysissolution，輕輕吹打至沉淀重懸；80℃培養(yǎng)5min，使菌體裂解，然后使其冷卻至室溫；加入3μlrnasesolution，顛倒2～5次，混勻；水浴37℃培養(yǎng)30min，并冷卻至室溫；加入200μlproteinprecipitationsolution，高速渦旋振蕩20s；將樣品在冰上放置5min；13,000rpm離心10min；將含有dna的上清液轉(zhuǎn)移至一個(gè)干凈的的裝有600μl異丙醇的1.5ml離心管；輕輕顛倒混勻直至出現(xiàn)線狀dna；13,000rpm離心5min；輕輕倒出上清液，并用干凈的吸水紙將管內(nèi)殘液吸干；加入600μl70％乙醇，輕輕顛倒幾次；13,000rpm離心2min，小心吸出乙醇；將離心管在空氣中晾10～15min，至乙醇完全蒸發(fā)；加入100μldnarehydrationsolution，65℃培養(yǎng)1h水化dna，并定期敲打離心管，也可在4℃過(guò)夜水化dna；將提取的dna保存于-20℃。提取的模板dna通過(guò)凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)分析其質(zhì)量和濃度。核酸濃度測(cè)定：用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定核酸在260nm和280nm處的紫外吸收值，以260nm和280nm處的紫外吸收值的比值計(jì)算純度，高質(zhì)量dna的od260/280的值在1.8左右。細(xì)菌基因組dna完整性測(cè)定：取3μl提取的模板dna溶液電泳，選用的電泳膠為1.0％的瓊脂糖凝膠，在紫外投射儀下檢測(cè)dna的大小，根據(jù)其亮度和擴(kuò)散管程度來(lái)判斷dna的完整性。

以濃度為100ng/μl的hps血清13型參考菌株hs1079基因組dna為初始模板，分別以超純水進(jìn)行系列稀釋，每個(gè)梯度各取1μl加入反應(yīng)管中，反應(yīng)體系中細(xì)菌基因組dna的量分別為100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、5pg、2.5pg、1pg、0.5pg、0.1pg、0.01pg、0.001pg，以超純水作為陰性對(duì)照，擴(kuò)增后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳鑒定敏感性結(jié)果。結(jié)果如圖3所示，從第8泳道至第14泳道均出現(xiàn)lamp反應(yīng)典型的階梯狀電泳條帶，而且隨著模板dna濃度的增加，條帶亮度逐漸增強(qiáng)。結(jié)果表明，本發(fā)明建立的lamp方法最低限度能檢測(cè)到2.5pg的hps血清13型參考菌株hs1079基因組dna，且隨著模板dna濃度的增加，lamp擴(kuò)增產(chǎn)物量也隨之增多。

(2)lamp檢測(cè)hps血清13型菌液的敏感性

取甘油保存的副豬嗜血桿菌13型參考菌株hs1079，劃線培養(yǎng)于添加終濃度100μg/mlnad的tsa平板上，于37℃溫箱中培養(yǎng)過(guò)夜。自培養(yǎng)平板上挑取單菌落接種于5ml添加終濃度100μg/mlnad的tsb培養(yǎng)基中，于37℃搖床中振搖培養(yǎng)過(guò)夜。經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)得菌液濃度od600為0.6，將菌液用超純水倍比稀釋至10^-12，從10^-4、10^-6和10^-8管中各取出100μl分別涂在tsa平板上，過(guò)夜培養(yǎng)后計(jì)算細(xì)菌的菌落數(shù)。同時(shí)從每個(gè)稀釋度管中取出1μl作為模板dna進(jìn)行l(wèi)amp擴(kuò)增，擴(kuò)增后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳鑒定敏感性結(jié)果。結(jié)果如圖4所示，從第10泳道至第15泳道均有典型的梯狀條帶，最低限度至少能檢測(cè)到10^-5。平板計(jì)數(shù)結(jié)果顯示在10^-6培養(yǎng)基中是50cfu/ml、10^-4培養(yǎng)基中是4000cfu/ml，倍比計(jì)算得到10^-5約500cfu/ml，模板取量為1μl，所以該lamp反應(yīng)檢測(cè)的最低含菌量為0.5個(gè)菌，即靈敏性為0.02cfu/μl(20cfu/ml)。

實(shí)施例8lamp檢測(cè)臨床分離hps菌株

取表5中的20株hps臨床分離株(已利用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)鑒定血清型)，分別過(guò)夜培養(yǎng)后取菌液1ml，離心后棄上清液，菌沉淀重懸于50μl超純水中，煮沸5min裂解細(xì)菌后，離心取上清液1.0μl用于lamp反應(yīng)用模板dna。以優(yōu)化后的lamp反應(yīng)體系及程序進(jìn)行擴(kuò)增，核酸電泳觀察lamp擴(kuò)增結(jié)果。lamp檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，在所有hps分離菌株中，只有5株血清13型菌株出現(xiàn)典型的梯狀條帶，其它血清型菌株均為陰性反應(yīng)，提示本發(fā)明建立的lamp檢測(cè)方法可用于臨床hps分離株血清13型的檢測(cè)和鑒定。

表5lamp檢測(cè)臨床分離hps不同血清型菌株的結(jié)果

注：檢測(cè)結(jié)果中“-”為陰性；“+”為陽(yáng)性。

序列表

<110>北京市農(nóng)林科學(xué)院

<120>一種快速檢測(cè)副豬嗜血桿菌血清13型的方法

<130>p1710106

<160>5

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

tgtatcgaagttcttctgtgta22

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

aaaagtaagataaagccttggat23

<210>3

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

aggaagcccaaaagagattgcgtcttcacgatttgaggga40

<210>4

<211>48

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

catttgattgttatatgggacccgcactcaatattttctggttcacat48

<210>5

<211>198

<212>dna

<213>gltp基因片段

<400>5

tgtatcgaagttcttctgtgtattgtatgtcttcacgatttgagggacttccattggtgt60

taattgaagcaatctcttttgggcttcctgttgtttcatttgattgttatatgggacccg120

ctgaaattatcaaaaactcaggaatactatgtgaaccagaaaatattgagtctttatcca180

aggctttatcttactttt198