本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種云粳系列水稻品種dna分子標(biāo)簽的建立，應(yīng)用于品種分子鑒定及品種管理。

背景技術(shù)：

云南得天獨(dú)厚的自然環(huán)境為形成豐富的稻作資源創(chuàng)造了條件，同時(shí)多樣的民族文化又不斷促進(jìn)著稻作資源的豐富和發(fā)展，使云南成為中國栽培稻的遺傳多樣性中心，是同時(shí)擁有全國3種野生稻資源的兩個(gè)省份之一。豐富的水稻資源選育出大量的優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗逆品種，這些品種具有豐富的多樣性和高原特色。

云粳系列水稻品種是由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院粳稻育種創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)選育的一系列高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的水稻品種。云粳系列水稻品種(系)具有“高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病、抗倒伏”的特點(diǎn)，在云南省及周邊省份大面積推廣應(yīng)用，但隨著品種數(shù)目的急劇增多，種子市場中的“多、亂、雜”現(xiàn)象和“品種同質(zhì)化”現(xiàn)象并存，“同種異名”“同名異種”“假冒套牌”等現(xiàn)象屢禁不止，制假、售假事件時(shí)有發(fā)生，使國家和農(nóng)民利益受到很大的損害，給品種管理和產(chǎn)權(quán)保護(hù)帶來諸多困難。要解決這一問題，需建立起一種簡便、快速、準(zhǔn)確的品種識別及科學(xué)的種子管理方法。品種識別及科學(xué)的種子管理需要達(dá)到唯一性、可識別(鑒別)性、可追溯性的要求。

品種dna分子標(biāo)簽即品種dna身份信息標(biāo)簽，通過品種分子指紋描述，將指紋信息轉(zhuǎn)化為代碼信息標(biāo)注在種子標(biāo)簽上，可作為品種特異識別的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，是品種數(shù)字化管理的核心技術(shù)之一。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了能夠準(zhǔn)確、快速、方便地識別云粳系列品種，本發(fā)明提供一種建立云粳系列水稻品種dna分子標(biāo)簽的方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

1.一種建立云粳系列水稻品種dna分子標(biāo)簽的方法，包括(1)云粳系列水稻品種基因組dna提取、(2)pcr擴(kuò)增、(3)pcr產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳熒光檢測、(4)dna指紋數(shù)據(jù)的獲得、(5)云粳系列水稻品種基本商品信息數(shù)據(jù)的采集、(6)云粳系列水稻品種dna分子標(biāo)簽制作步驟，其特征在于：

在所述(2)pcr擴(kuò)增中每一個(gè)云粳系列水稻品種提取的基因組dna，分別用引物rm8277，rm551，rm190，rm336，rm219和rm432進(jìn)行擴(kuò)增，所述引物rm8277由rm8277正向引物和rm8277反向引物組成，所述的rm8277正向引物的堿基序列如seqidno：1所示，rm8277反向引物的堿基序列如seqidno：2所示；所述引物rm551由rm551正向引物和rm551反向引物組成，所述rm551正向引物的堿基序列如seqidno：3所示，rm551反向引物的堿基序列如seqidno：4所示；所述引物rm190由rm190正向引物和rm190反向引物組成，所述rm190正向引物的堿基序列如seqidno：5所示，rm190反向引物的堿基序列如seqidno：6所示；所述引物rm336由rm336正向引物和rm336反向引物組成，所述rm336正向引物的堿基序列如seqidno：7所示，rm336反向引物的堿基序列如seqidno：8所示；所述引物rm219由rm219正向引物和rm219反向引物組成，所述rm219正向引物的堿基序列如seqidno：9所示，rm219反向引物的堿基序列如seqidno：10所示；所述引物rm432由rm432正向引物和rm432反向引物組成，所述rm432正向引物的堿基序列如seqidno：11所示，rm432反向引物的堿基序列如seqidno：12所示；

在所述(4)dna指紋數(shù)據(jù)的獲得中每一個(gè)云粳系列水稻品種的dna指紋數(shù)據(jù)的獲得是根據(jù)毛細(xì)管熒光電泳讀出的該云粳系列水稻品種6個(gè)位點(diǎn)的等位變異片段大小數(shù)據(jù)，純合位點(diǎn)的等位變異記錄為x/x，以x/x的形式表示其dna指紋數(shù)據(jù)，雜合位點(diǎn)的等位變異記錄為x/y，以x/y的形式表示其dna指紋數(shù)據(jù)，其中x、y為該位點(diǎn)上兩個(gè)不同的等位變異片段大小數(shù)據(jù)，小片段在前，大片段在后，以兩個(gè)片段大小記錄；每一個(gè)云粳系列水稻品種的dna指紋數(shù)據(jù)x/y或x/y依次按引物rm8277、引物rm551、引物rm190、引物rm336、引物rm219、引順rm432的引物順序排列；

在所述(5)云粳系列水稻品種基本商品信息數(shù)據(jù)的采集中每一個(gè)云粳系列水稻品種所采集的基本商品信息數(shù)據(jù)包括作物種類、品種植物學(xué)類型、品種繁殖類型、品種名稱、單元識別代碼、審定區(qū)域和審定的年份，所述的單元識別代碼是用1、2、3……自然數(shù)中的任意數(shù)表示，且不同的云粳系列水稻品種的單元識別代碼均不相同；

所述(6)云粳系列水稻品種dna分子標(biāo)簽制作是將同一云粳系列水稻品種在步驟(4)獲得的dna指紋數(shù)據(jù)和在步驟(5)所采集的基本商品信息數(shù)據(jù)輸入二維碼生成器生成二維碼圖形即為云粳系列水稻品種dna分子標(biāo)簽。

2.根據(jù)技術(shù)方案1所述的一種建立云粳系列水稻品種dna分子標(biāo)簽的方法，其特征在于：在步驟(5)云粳系列水稻品種基本商品信息數(shù)據(jù)的采集中所采集的基本商品信息數(shù)據(jù)還包括生產(chǎn)經(jīng)營者名稱。

3.根據(jù)技術(shù)方案2所述的一種建立云粳系列水稻品種dna分子標(biāo)簽的方法，其特征在于：在步驟(5)云粳系列水稻品種基本商品信息數(shù)據(jù)的采集中所采集的基本商品信息數(shù)據(jù)還包括追溯網(wǎng)址。

4.根據(jù)技術(shù)方案1或2或3所述的一種建立云粳系列水稻品種dna分子標(biāo)簽的方法構(gòu)建的云粳系列水稻品種dna分子標(biāo)簽。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效益：

1、本發(fā)明提出了6對鑒別云粳系列水稻品種的特異性引物，實(shí)現(xiàn)了以廣泛基因組覆蓋度的最少引物鑒定云粳系列水稻品種。能夠用最少的引物構(gòu)建所有云粳系列水稻品種的dna分子標(biāo)簽，減少了繁復(fù)的工作量和高昂的檢測成本，能夠把云粳系列水稻品種與其它云南高原粳稻品種鑒別開，同時(shí)還可以把云粳系列水稻品種一一區(qū)分開。

2、本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了云粳系列水稻品種和其種子的雙重防偽，達(dá)到品種識別及科學(xué)的種子管理的唯一性、可識別(鑒別)性、可追溯性,標(biāo)識于商品種子包裝上，用于水稻優(yōu)良品種種子的防偽和溯源,實(shí)現(xiàn)了云粳系列水稻品種的dna分子標(biāo)簽真實(shí)性鑒別。

序列表中seqidno：1所示的是rm8277正向引物的堿基序列。

序列表中seqidno：2所示的是rm8277反向引物的堿基序列。

序列表中seqidno：3所示的是rm551正向引物的堿基序列。

序列表中seqidno：4所示的是rm551反向引物的堿基序列。

序列表中seqidno：5所示的是rm190正向引物的堿基序列。

序列表中seqidno：6所示的是rm190反向引物的堿基序列。

序列表中seqidno：7所示的是rm336正向引物的堿基序列。

序列表中seqidno：8所示的是rm336反向引物的堿基序列。

序列表中seqidno：9所示的是rm219正向引物的堿基序列。

序列表中seqidno：10所示的是rm219反向引物的堿基序列。

序列表中seqidno：11所示的是rm432正向引物的堿基序列。

序列表中seqidno：12所示的是rm432反向引物的堿基序列。

附圖說明

圖1是實(shí)施例1中采用本發(fā)明方法對云粳系列水稻品種云粳26號品種構(gòu)建的dna分子標(biāo)簽。

具體實(shí)施方式

術(shù)語：

追溯網(wǎng)址：是指云粳系列水稻品種的生產(chǎn)經(jīng)營者的網(wǎng)址。

本發(fā)明針對云粳系列水稻品種，選取多態(tài)性高、區(qū)分度好、數(shù)據(jù)容易統(tǒng)計(jì)、擴(kuò)增重復(fù)性好、引物位點(diǎn)在染色體上均勻分布的ssr引物作為核心引物。采用20個(gè)不同遺傳背景的云南水稻品種對325對水稻ssr引物進(jìn)行篩選，篩選出48對多態(tài)性高、區(qū)分度好、數(shù)據(jù)容易統(tǒng)計(jì)、擴(kuò)增重復(fù)性好、引物位點(diǎn)在染色體上均勻分布的ssr引物。48對引物對200個(gè)云南水稻品種進(jìn)行擴(kuò)增檢測，得到dna指紋圖譜，通過數(shù)據(jù)分析確定24對核心引物就可鑒別該200個(gè)品種。再對35個(gè)云粳系列水稻品種的指紋圖譜進(jìn)行分析，最后確定6對引物作為核心引物鑒別云粳系列水稻品種，dna指紋數(shù)據(jù)以6個(gè)位點(diǎn)的等位變異片段大小數(shù)據(jù)表示，dna指紋數(shù)據(jù)通過毛細(xì)管熒光電泳讀取。

表1用于構(gòu)建云粳系列水稻品種dna分子標(biāo)簽的引物信息

實(shí)例1建立云粳系列水稻品種云粳26號(滇審稻2010003號)品種dna分子標(biāo)簽的方法

(1)云粳系列水稻品種基因組dna提?。?/p>

取云粳26號水稻葉片約200-300mg置于2.0ml離心管，加液氮充分研磨。每管加入700μl經(jīng)65℃預(yù)熱的ctab提取液，充分混合，65℃水浴60min并2-3顛倒混勻。每管加入等體積的三氯甲烷和異戊醇混合液，三氯甲烷：異戊醇的體積比為24：1，充分混合后靜置10min，在12,000rpm離心15min。吸取上清液轉(zhuǎn)移至一新管，加入等體積0℃預(yù)冷的異丙醇，顛倒混勻，-20℃放置30min后在4℃、12,000rpm離心10min，棄上清液，加入70％v/v乙醇，旋轉(zhuǎn)2-3次后棄去乙醇溶液，并倒立于墊有濾紙的實(shí)驗(yàn)臺上，室溫放置10min以上。加入100μl超純水或100μlte緩沖液，充分溶解后得基因組dna，備用。

ctab提取液：81.7g氯化鈉和20.0gctab溶于適量水中，然后加入1mol/ltris-hcl100ml，0.5mol/ledta40ml，定容至1000ml，4℃貯存。

(2)pcr擴(kuò)增

取步驟(1)獲得的基因組dna樣品進(jìn)行擴(kuò)增，pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系為：10μl的反應(yīng)體積，其中1μl10×pcr反應(yīng)緩沖液、0.6μl25mmol/lmgcl2、0.8μl2.5mmol/ldntp溶液、1μl5μmol/l正向引物，1μl5μmol/l反向引物(各引物對合成時(shí)用熒光基團(tuán)修飾)，0.25μl2u/μltaqdna聚合酶，4.35μl超純水，1μl樣品dna。

pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4min；94℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。

分別采用引物rm8277、引物rm551、引物rm190、引物rm336、引物rm219、引物rm432進(jìn)行擴(kuò)增，所述引物rm8277由rm8277正向引物和rm8277反向引物組成，所述rm8277正向引物的堿基序列如seqidno：1所示，rm8277反向引物的堿基序列如seqidno：2所示；所述引物rm551由rm551正向引物和rm551反向引物組成，所述rm551正向引物的堿基序列如seqidno：3所示，rm551反向引物的堿基序列如seqidno：4所示；所述引物rm190由rm190正向引物和rm190反向引物組成，所述rm190正向引物的堿基序列如seqidno：5所示，rm190反向引物的堿基序列如seqidno：6所示；所述引物rm336由rm336正向引物和rm336反向引物組成，所述引物rm336正向引物的堿基序列如seqidno：7所示，引物rm336反向引物的堿基序列如seqidno：8所示；所述引物rm219由rm219正向引物和rm219反向引物組成，所述rm219正向引物的堿基序列如seqidno：9所示，rm219反向引物的堿基序列如seqidno：10所示；所述引物rm432由rm432正向引物和rm432反向引物組成，所述rm432正向引物的堿基序列如seqidno：11所示，rm432反向引物的堿基序列如seqidno：12所示；

(3)pcr產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳熒光檢測

將熒光標(biāo)記的pcr產(chǎn)物用超純水稀釋30倍，分別從中吸取1μl加入到dna分析儀專用深孔板孔中。板中各孔分別加入0.1μlliz500分子量內(nèi)標(biāo)和8.9μl去離子甲酰胺。將深孔板在pcr儀上95℃變性5min，取出，立即置于碎冰上，冷卻10min以上。瞬時(shí)1000rpm離心10s后置放到dna分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳。對采集的數(shù)據(jù)采用genemapperv3.2數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行分析。讀出每個(gè)位點(diǎn)每份樣品的等位變異大小數(shù)據(jù)。

(4)dna指紋數(shù)據(jù)的獲得

每一個(gè)云粳系列水稻品種的dna指紋數(shù)據(jù)的獲得是根據(jù)毛細(xì)管熒光電泳讀出的該云粳系列水稻品種在6個(gè)位點(diǎn)上的等位變異片段大小數(shù)據(jù)，純合位點(diǎn)的等位變異記錄為x/x，以x/x的形式表示其dna指紋數(shù)據(jù)，雜合位點(diǎn)的等位變異記錄為x/y，以x/y的形式表示其dna指紋數(shù)據(jù)，其中x、y為該位點(diǎn)上兩個(gè)不同的等位變異片段大小數(shù)據(jù)，小片段在前，大片段在后，以兩個(gè)片段大小記錄；每一個(gè)云粳系列水稻品種的dna指紋數(shù)據(jù)x/y或x/y依次按引物rm8277、引物rm551、引物rm190、引物rm336、引物rm219、引物rm432依次排列。

云粳26號在6個(gè)位點(diǎn)上的擴(kuò)增片段大小(bp)分別為(按引物順序排列)：

212/212、187/187、121/121、166/166、204/204、181/181，即為云粳26號的dna指紋數(shù)據(jù)：212/212、187/187、121/121、166/166、204/204、181/181。

分子標(biāo)記數(shù)據(jù)為可替換或擴(kuò)展項(xiàng)，有多態(tài)性更好的位點(diǎn)可以替換或補(bǔ)充。

(5)云粳系列水稻品種基本商品信息數(shù)據(jù)的采集

云粳26號品種的基本商品信息數(shù)據(jù)如下：

作物種類：水稻

品種植物學(xué)類型：粳稻

品種繁殖類型：常規(guī)種

品種名稱：云粳26號

單元識別代碼：1

審定區(qū)域和審定的年份：云南，2010年

生產(chǎn)經(jīng)營者名稱：云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所

追溯網(wǎng)址：http://www.ynifc.org/

(6)云粳系列水稻品種dna分子標(biāo)簽制作

將步驟(4)獲得的云粳26號的dna指紋數(shù)據(jù)和步驟(5)采集的云粳26號品種的基本商品信息數(shù)據(jù)輸入微微二維碼生成器生成二維碼圖形即為云粳26號品種dna分子標(biāo)簽，如圖1所示。該分子標(biāo)簽實(shí)現(xiàn)了使用者用普通設(shè)備(手機(jī))快速識別種子真?zhèn)巍?/p>

sequencelisting

<110>云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所

<120>一種建立云粳系列水稻品種dna分子標(biāo)簽的方法

<130>/

<160>12

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>rm8277正向引物

<400>1

agcacaagtaggtgcatttc20

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>rm8277反向引物

<400>2

atttgcctgtgatgtaatagc21

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>rm551正向引物

<400>3

agcccagactagcatgattg20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>rm551反向引物

<400>4

gaaggcgagaaggatcacag20

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>rm190正向引物

<400>5

ctttgtctatctcaagacac20

<210>6

<211>21

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>rm190反向引物

<400>6

ttgcagatgttcttcctgatg21

<210>7

<211>20

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>rm336正向引物

<400>7

cttacagagaaacggcatcg20

<210>8

<211>20

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>rm336反向引物

<400>8

gctggtttgtttcaggttcg20

<210>9

<211>20

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>rm219正向引物

<400>9

cgtcggatgatgtaaagcct20

<210>10

<211>18

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>rm219反向引物

<400>10

catatcggcattcgcctg18

<210>11

<211>20

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>rm432正向引物

<400>11

ttctgtctcacgctggattg20

<210>12

<211>20

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>rm432反向引物

<400>12

agctgcgtacgtgatgaatg20