本發(fā)明屬于食品安全領(lǐng)域，具體為一種乳制品中粘紅酵母的檢測探針及基因芯片和方法，將基因芯片技術(shù)應(yīng)用于乳品污染微生物的分類鑒定。
背景技術(shù)：
乳制品是一種營養(yǎng)豐富，容易被消化和吸收的天然食品，隨著人們生活水平的提高，已經(jīng)成為生活中常見的食品。但是營養(yǎng)豐富的乳制品也是各種微生物青睞的溫床，這導(dǎo)致乳制品的貨架期非常有限，比如經(jīng)巴氏滅菌的乳制品保質(zhì)期一般不超過7天（巴氏鮮奶占全球液態(tài)奶70%的市場份額），近些年市場占有量越來越大的發(fā)酵酸奶，其保質(zhì)期一般也只有21天。
另一方面，國家《食品安全法》和《企業(yè)生產(chǎn)乳制品許可條件審查細(xì)則（2010版）》中明確要求企業(yè)必須對所生產(chǎn)、加工的乳制品進(jìn)行出廠前微生物檢驗，包括5種指示菌和5種致病菌的檢測。目前乳制品企業(yè)基本都是采用傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法來檢測微生物，這種方法的檢測周期一般在3~4天左右，甚至有些致病菌不能僅憑菌落形態(tài)來判定，需要配合其他生化反應(yīng)試驗做進(jìn)一步鑒定，這無疑又增加了檢測周期。因此，較長的檢測周期（完成國標(biāo)要求檢測的10種微生物需要5~6天）和較短乳制品保質(zhì)期（營養(yǎng)物質(zhì)沒有被破壞的巴氏滅菌乳制品的貨架期只有7天）之間形成了矛盾，這一矛盾已成為制約乳制品企業(yè)發(fā)展的重要瓶頸，也成為制約市場終端能獲取到營養(yǎng)最全面乳制品的重要因素。
基因芯片是dna識別技術(shù)的一種體現(xiàn)，利用芯片高通量的優(yōu)勢，可以在一張芯片上同時對多個物種的多個dna條形碼進(jìn)行檢測，不僅極大地提高了鑒定的準(zhǔn)確性，而且還大大縮短了檢測周期，即利用基因芯片可以在短時間內(nèi)對微生物多個dna靶點進(jìn)行檢測。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明目的是提供一種乳制品中真菌粘紅酵母dna檢測芯片的制備方法，通過該基因芯片能夠在短時間內(nèi)對粘紅酵母的兩個dna片段進(jìn)行定性定量檢測。本發(fā)明內(nèi)容涉及乳制品中微生物核酸提取、pcr引物設(shè)計及擴(kuò)增、基因芯片的制備及雜交檢測。
本發(fā)明是采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
本發(fā)明技術(shù)方案之一為，乳制品中粘紅酵母的檢測探針，包括：
粘紅酵母its的檢測探針：
5’nh3—ttttttttttttcgctgcgttcttcatcgatgcgagagcc—3’；
粘紅酵母tubb的檢測探針：
5’nh3—ttttttttttttcagcgtgtcgcacgcctcggtctcgtg—3’。
本發(fā)明技術(shù)方案之二為，乳制品中粘紅酵母的檢測基因芯片，包括如上所述的2個檢測探針。
本發(fā)明技術(shù)方案之三為，乳制品中粘紅酵母的檢測方法，包括如下步驟：
（1）、靶序列的確定：
真菌粘紅酵母的特異性檢測靶序列分別為：
粘紅酵母its：
aaggatcattagtgaatctaggacgtccaacttaacttggagtccgaactctcactttctaaccctgtgcatctgttaattggactagtagctcttcggagtgaaccgccattcacttataaacacaaagtctatgaatgtatacaaatttataacaaaacaaaactttcaacaacggatctcttggctctcgcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgatacgtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcaccttgcgctccttggtattccgaggagcatgcctgtttgagtgtcatgaaatcttcaacccacctctttcttagtgaatctggtggtgcttggtttctgagcgctgctctgcttcggcttagctcgttcgtaatgcattagcatccgcaaccgaacttcggattgacttggcgtaatagactattcgctgaggattctagtttactagagccgagttgggttaaaggaagctcctaatcctaaagtctatttttttgattagatctcaaatcaggtaggactacccgctgaacttaa；
粘紅酵母tubb：
ggcgccgagctcgtcgactcgatcctcgaccagctgcaccacgagaccgaggcgtgcgacacgctgcagggcttccagatggtgcactcggtcggcggcgggaccgggtcggagctcgggacgctcatcctcagcaagatccgcgaggaggtgcgtctctgcggctctctctcgcttatctctctgctgttccccgtcgatggtcgatcggtgacgctctagcactcgcctgcagttccccgaccgcatgctcgcgacctactcgggtgtgccgtcgcccaaggtgtgcgagaccgtcgtcgagccgtacacagccatcctgtcgtaccaccagctcatcgagaaccgcgacatggtctttgcgttcgacaacgaggcgctgtacgacatcatggcgcgcaccgtcaaggtgtcaaacccggcgtacgcgcagctcaacggcctcatcacaaaggtcatgagcggcatcacgacgccgttgcggttcccgggccagctcaactc。
（2）、引物與探針的設(shè)計：
靶序列確定后，根據(jù)引物與探針設(shè)計原則，設(shè)計引物與探針如下：
粘紅酵母its：
引物1：5’cy3—aaggatcattagtgaatctagg—3’
引物2：5’—gttcagcgggtagtcctacctg—3’
檢測探針：
5’nh3—ttttttttttttcgctgcgttcttcatcgatgcgagagcc—3’；
粘紅酵母tubb：
引物1：5’cy3—ggcgccgagctcgtcgactcg—3’
引物2：5’—gagttgagctggcccgggaac—3’
檢測探針：
5’nh3—ttttttttttttcagcgtgtcgcacgcctcggtctcgtg—3’。
（3）、模板提?。簩⑷槠分糜?80℃速凍15min，取出后置于研磨中，在液氮環(huán)境下將其整體研磨成粉末狀，用ctab方法提取粉末中的核酸。
（4）、rt-pcr擴(kuò)增及熒光標(biāo)記：
用已經(jīng)熒光標(biāo)記的引物對步驟（3）所提取的模板進(jìn)行rt-pcr擴(kuò)增。
（5）、芯片制備：
將氨基化的探針點在醛基片基上，室溫放置過夜，先后用洗脫液i、洗脫液ii洗脫，將沒有固定上的探針洗脫掉，然后離心甩干備用；
進(jìn)一步的，為了驗證所制備芯片的準(zhǔn)確性，在片基上固定另外兩種乳制品污染真菌羅倫氏隱球酵母、煙曲霉相關(guān)基因的檢測探針，以作為陰性對照使用。
（6）、分子雜交：將步驟（4）的pcr產(chǎn)物與步驟（5）制備好的芯片進(jìn)行原位雜交，在42℃下保持40min，用洗脫液i、洗脫液ii洗脫。
（7）、結(jié)果分析：用激光共聚焦掃描儀檢測雜交結(jié)果。
本發(fā)明具有對乳制品常見感染真菌粘紅酵母進(jìn)行dna檢測的基因芯片，利用基因芯片的特異性、時效性在短時期內(nèi)對粘紅酵母進(jìn)行檢測和鑒定，針對同一種微生物設(shè)計2個檢測靶點，解決了微生物種間親緣關(guān)系近、dna序列同源性高而導(dǎo)致的檢測特異性低的問題，提高了種間微生物檢測的準(zhǔn)確性。
本發(fā)明具有對羅倫氏隱球酵母、煙曲霉、粘紅酵母三種乳制品常見感染真菌進(jìn)行dna檢測的基因芯片，利用基因芯片的高通量檢測特點。
本發(fā)明具有的有益效果如下：
1、準(zhǔn)確性：基于dna和rna的檢測，結(jié)果更可靠。
2、時效性：相比于傳統(tǒng)培養(yǎng)法鑒定耗時3~4天，本發(fā)明只需要6小時即可完成3種乳制品感染微生物的鑒定。
3、可靠性：每種污染微生物設(shè)計兩個檢測靶點，提供了檢測的準(zhǔn)確性。
本發(fā)明公開了乳制品中真菌dna檢測芯片的制備方法，通過該基因芯片能夠在短時間內(nèi)粘紅酵母rhodotorulaglutinis進(jìn)行定性定量檢測。本發(fā)明方法適用于奶源樣品、生產(chǎn)中間品、成品等全工藝鏈上的乳品檢測，在大幅縮短乳品貨架期的同時還可以提供一種生產(chǎn)過程質(zhì)控的新型檢測方法。
附圖說明
圖1表示為粘紅酵母的雙重靶點檢測結(jié)果圖。
具體實施方式
下面對本發(fā)明的具體實施例進(jìn)行詳細(xì)說明。
一種乳制品中粘紅酵母的檢測方法，包括如下步驟：
（1）、靶序列的確定：
根據(jù)報道的粘紅酵母its和tubb基因序列，各選擇一段特異性較好、片段長度適合的基因序列作為檢測的靶序列，如下：
粘紅酵母its：
aaggatcattagtgaatctaggacgtccaacttaacttggagtccgaactctcactttctaaccctgtgcatctgttaattggactagtagctcttcggagtgaaccgccattcacttataaacacaaagtctatgaatgtatacaaatttataacaaaacaaaactttcaacaacggatctcttggctctcgcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgatacgtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcaccttgcgctccttggtattccgaggagcatgcctgtttgagtgtcatgaaatcttcaacccacctctttcttagtgaatctggtggtgcttggtttctgagcgctgctctgcttcggcttagctcgttcgtaatgcattagcatccgcaaccgaacttcggattgacttggcgtaatagactattcgctgaggattctagtttactagagccgagttgggttaaaggaagctcctaatcctaaagtctatttttttgattagatctcaaatcaggtaggactacccgctgaacttaa；
粘紅酵母tubb：
ggcgccgagctcgtcgactcgatcctcgaccagctgcaccacgagaccgaggcgtgcgacacgctgcagggcttccagatggtgcactcggtcggcggcgggaccgggtcggagctcgggacgctcatcctcagcaagatccgcgaggaggtgcgtctctgcggctctctctcgcttatctctctgctgttccccgtcgatggtcgatcggtgacgctctagcactcgcctgcagttccccgaccgcatgctcgcgacctactcgggtgtgccgtcgcccaaggtgtgcgagaccgtcgtcgagccgtacacagccatcctgtcgtaccaccagctcatcgagaaccgcgacatggtctttgcgttcgacaacgaggcgctgtacgacatcatggcgcgcaccgtcaaggtgtcaaacccggcgtacgcgcagctcaacggcctcatcacaaaggtcatgagcggcatcacgacgccgttgcggttcccgggccagctcaactc。
（2）、引物與探針的設(shè)計：
靶序列確定后，根據(jù)引物與探針設(shè)計原則，設(shè)計引物與探針如下：
粘紅酵母its：
引物1：5’cy3—aaggatcattagtgaatctagg—3’
引物2：5’—gttcagcgggtagtcctacctg—3’
檢測探針：
5’nh3—ttttttttttttcgctgcgttcttcatcgatgcgagagcc—3’
粘紅酵母tubb：
引物1：5’cy3—ggcgccgagctcgtcgactcg—3’
引物2：5’—gagttgagctggcccgggaac—3’
檢測探針：
5’nh3—ttttttttttttcagcgtgtcgcacgcctcggtctcgtg—3’。
（3）、模板提?。?/p>
將2ml乳品置于-80℃速凍15min，取出后置于研磨中，在液氮環(huán)境下將其整體研磨成粉末狀，用ctab方法提取粉末中的核酸。
（4）、rt-pcr擴(kuò)增及熒光標(biāo)記：
用已經(jīng)熒光標(biāo)記的引物對步驟（3）所提取的模板進(jìn)行rt-pcr擴(kuò)增，采用天根生化科技有限公司的一步法rt-pcr進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系如下：
pcr反應(yīng)條件為：42℃保溫30min，95℃預(yù)變性3min，重復(fù)95℃變性30sec，55℃復(fù)性30sec，72℃延伸30sec這變性—復(fù)性—延伸三個過程36個循環(huán)，最后在72℃保溫5min。
（5）、芯片制備：將氨基化的探針按一定濃度（濃度為50pmol/ul）點在醛基片基上，室溫放置過夜，先后用洗脫液i（5×ssc，1%sds）、洗脫液ii（0.25×ssc，1%sds）各洗脫5min，將沒有固定上的探針洗脫掉，然后離心甩干備用。
為了驗證所制備芯片的準(zhǔn)確性，在片基上固定了另外兩種乳制品污染真菌羅倫氏隱球酵母、煙曲霉相關(guān)基因的檢測探針，以作為陰性對照使用。
探針固定方法同上，具體探針如下：
羅倫氏隱球酵母its的檢測探針：
5’nh3—tttttttttttgatgcgagagccaagagatccgttgttg—3’；
羅倫氏隱球酵母rpb
5’nh3—ttttttttttttgcttcaaacgatgttgcggcttgatctg—3’；
煙曲霉its的檢測探針：
5’nh3—ttttttttttggaaccaagagatccgttgttgaaag—3’；
煙曲霉abr
5’nh3—ttttttttttttgccacagtgcactattccctcgacctg—3’；
（6）、分子雜交：
將步驟（4）的pcr產(chǎn)物與步驟（5）制備好的芯片進(jìn)行原位雜交，在42℃下保持40min，用洗脫液i（5×ssc，1%sds）、洗脫液ii（0.25×ssc，1%sds）各洗脫5min。
（7）、結(jié)果分析：
用激光共聚焦掃描儀檢測雜交結(jié)果，結(jié)果如圖1所示。
圖中，cl-its為羅倫氏隱球酵母的its檢測位點，顯示為陰性；cl-rpb
圖中，af-its為煙曲霉的its檢測位點，顯示為陰性；af-abr
圖中，rg-its為粘紅酵母的its檢測位點，顯示為陽性；rg-tubb為粘紅酵母的tubb基因檢測位點，顯示為陽性。
以上僅為本發(fā)明的具體實施例，但并不局限于此。任何以本發(fā)明為基礎(chǔ)解決基本相同的技術(shù)問題，或?qū)崿F(xiàn)基本相同的技術(shù)效果，所作出地簡單變化、等同替換或者修飾等，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
說明書核苷酸和氨基酸序列表
粘紅酵母its：
aaggatcattagtgaatctaggacgtccaacttaacttggagtccgaactctcactttctaaccctgtgcatctgttaattggactagtagctcttcggagtgaaccgccattcacttataaacacaaagtctatgaatgtatacaaatttataacaaaacaaaactttcaacaacggatctcttggctctcgcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgatacgtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcaccttgcgctccttggtattccgaggagcatgcctgtttgagtgtcatgaaatcttcaacccacctctttcttagtgaatctggtggtgcttggtttctgagcgctgctctgcttcggcttagctcgttcgtaatgcattagcatccgcaaccgaacttcggattgacttggcgtaatagactattcgctgaggattctagtttactagagccgagttgggttaaaggaagctcctaatcctaaagtctatttttttgattagatctcaaatcaggtaggactacccgctgaacttaa；
粘紅酵母tubb：
ggcgccgagctcgtcgactcgatcctcgaccagctgcaccacgagaccgaggcgtgcgacacgctgcagggcttccagatggtgcactcggtcggcggcgggaccgggtcggagctcgggacgctcatcctcagcaagatccgcgaggaggtgcgtctctgcggctctctctcgcttatctctctgctgttccccgtcgatggtcgatcggtgacgctctagcactcgcctgcagttccccgaccgcatgctcgcgacctactcgggtgtgccgtcgcccaaggtgtgcgagaccgtcgtcgagccgtacacagccatcctgtcgtaccaccagctcatcgagaaccgcgacatggtctttgcgttcgacaacgaggcgctgtacgacatcatggcgcgcaccgtcaaggtgtcaaacccggcgtacgcgcagctcaacggcctcatcacaaaggtcatgagcggcatcacgacgccgttgcggttcccgggccagctcaactc。
粘紅酵母its：
引物1：5’cy3—aaggatcattagtgaatctagg—3’
引物2：5’—gttcagcgggtagtcctacctg—3’
檢測探針：
5’nh3—ttttttttttttcgctgcgttcttcatcgatgcgagagcc—3’
粘紅酵母tubb：
引物1：5’cy3—ggcgccgagctcgtcgactcg—3’
引物2：5’—gagttgagctggcccgggaac—3’
檢測探針：
5’nh3—ttttttttttttcagcgtgtcgcacgcctcggtctcgtg—3’
羅倫氏隱球酵母its的檢測探針：
5’nh3—tttttttttttgatgcgagagccaagagatccgttgttg—3’
羅倫氏隱球酵母rpbi的檢測探針：
5’nh3—ttttttttttttgcttcaaacgatgttgcggcttgatctg—3’
煙曲霉its的檢測探針：
5’nh3—ttttttttttggaaccaagagatccgttgttgaaag—3’
煙曲霉abrii的檢測探針：
5’nh3—ttttttttttttgccacagtgcactattccctcgacctg—3’