本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種糞腸球菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵工藝，適用于糞腸球菌的高密度發(fā)酵生產(chǎn)。

背景技術(shù)：

《飼料添加劑品種目錄(2013)》將糞腸球菌規(guī)定為可以添加到飼料中的菌種，其在動(dòng)物腸道內(nèi)可形成生物薄膜附著于動(dòng)物腸道粘膜上，并且發(fā)育、生長(zhǎng)和繁殖。糞腸球菌屬于人及動(dòng)物腸道中的正常菌群，進(jìn)入腸道后可有效定殖。糞腸球菌發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，有利于降低腸道環(huán)境ph，抑制有害菌的生長(zhǎng)。糞腸球菌代謝過程中還會(huì)產(chǎn)生過氧化氫，細(xì)菌素等物質(zhì)，對(duì)致病菌有一定的殺滅作用，而且能產(chǎn)生天然抗生素，有利于機(jī)體健康，目前在養(yǎng)殖業(yè)中應(yīng)用比較廣泛，但傳統(tǒng)的糞腸球菌發(fā)酵多選用mrs培養(yǎng)基，價(jià)格昂貴，發(fā)酵后的活菌數(shù)低，在益生菌有效使用劑量固定的情況下，低發(fā)酵水平等于變相的增加了成本。低成本的培養(yǎng)基，高效的可放大的發(fā)酵工藝對(duì)于推進(jìn)益生菌發(fā)酵的產(chǎn)業(yè)化有重大指導(dǎo)及實(shí)踐意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種比現(xiàn)有技術(shù)更加能有效發(fā)酵糞腸球菌獲得高菌體生物量的糞腸球菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)基。

本發(fā)明的另一目的在于提供了一種采用上述糞腸球菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)基，并在糞腸球菌發(fā)酵期間合理添加補(bǔ)料，從而能比現(xiàn)有技術(shù)獲得更高生物量的糞腸球菌高密度發(fā)酵工藝。

本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供上述糞腸球菌高密度發(fā)酵工藝在糞腸球菌發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng)用。

本發(fā)明的上述技術(shù)問題主要是通過下述技術(shù)方案得以解決的：本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明提供一種糞腸球菌(enterococcusfaecalis)高密度發(fā)酵培養(yǎng)基，該糞腸球菌高密度發(fā)酵的種子和發(fā)酵培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，其組分及其含量如下：甘油20～30g/l、豆粕10～15g/l、硫酸銨1～3g/l、三水合磷酸氫二鉀2～3g/l、三水合乙酸鈉3～8g/l、二水合檸檬酸鈉2～4g/l、七水合硫酸鎂0.3～0.8g/l、一水合硫酸錳0.1～0.3g/l。

本發(fā)明還提供了該糞腸球菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵工藝，主要步驟如下：

(1)將冷凍保存的糞腸球菌甘油菌種劃線于mrs瓊脂培養(yǎng)基上，放置32～39℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落；上述單菌落中挑取飽滿的單菌落接種于mrs液體試管，32～39℃，50～200r/min搖瓶培養(yǎng)10小時(shí)后；以1％接種量轉(zhuǎn)接于mrs液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)8～10小時(shí)后作為種子液；

(2)配制糞腸球菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基降至所需溫度時(shí)，接上溶氧電極，標(biāo)定溶氧為100％；

(3)以2％～8％的接種量將步驟(1)所得的種子液接種于步驟(2)的發(fā)酵培養(yǎng)基中；

(4)發(fā)酵參數(shù)設(shè)定為：溫度32～39℃；轉(zhuǎn)速50～300r/min；通氣比0.5～1.0vvm，維持溶氧20～30％；發(fā)酵過程中維持發(fā)酵液ph值為4.5～7.0，當(dāng)ph低于設(shè)定值時(shí)，自動(dòng)流加堿性中和劑(氨水、koh、naoh、caco3或na2co3中的任一種)維持在設(shè)定值。連續(xù)補(bǔ)加料液(補(bǔ)料培養(yǎng)基：甘油800g/l和硫酸銨80g/l)，保持甘油濃度維持在10g/l左右；

(5)當(dāng)補(bǔ)加料液ph不再降低或發(fā)酵液在600nm波長(zhǎng)下的吸光值大于35時(shí)，終止發(fā)酵，即得糞腸球菌活菌數(shù)達(dá)8×10¹⁰cfu/ml以上的發(fā)酵液。

其中，所述補(bǔ)加料液的主要組分及其含量為：甘油800g/l、硫酸銨80g/l。

優(yōu)選地，發(fā)酵參數(shù)中維持溶氧20～30％更利于糞腸球菌活的生長(zhǎng)。

優(yōu)選地，發(fā)酵參數(shù)中ph值為4.5～7.0更利于糞腸球菌活的生長(zhǎng)。

本發(fā)明的高密度發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵工藝適用于糞腸球菌(enterococcusfaecalis)，但為達(dá)到最好的發(fā)明效果，優(yōu)選適用于糞腸球菌(enterococcusfaecalis)cicc20419。糞腸球菌(enterococcusfaecalis)cicc20419購買于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

本發(fā)明的糞腸球菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵工藝具有以下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明優(yōu)化了糞腸球菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)基，通過高溶氧結(jié)合甘油為碳源，并在發(fā)酵過程中采用ph反饋控制和甘油硫酸銨耦合流加策略，降低了發(fā)酵液中乳酸濃度，從而解除乳酸的反饋抑制，使用本發(fā)明的高密度發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵工藝發(fā)酵的糞腸球菌，菌體密度較普通發(fā)酵顯著提高，活菌數(shù)在8×10¹⁰cfu/ml以上，這是現(xiàn)有的技術(shù)難以達(dá)到的發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)，是現(xiàn)行采用分批補(bǔ)料發(fā)酵方式獲得高密度發(fā)酵糞腸球菌活菌數(shù)的2.78倍；較普通mrs培養(yǎng)基分批補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)活菌數(shù)2.2×10⁹cfu/ml，提高40倍以上，實(shí)現(xiàn)了糞腸球菌的高密度發(fā)酵；可以減小生物量的分離費(fèi)用，縮短生產(chǎn)周期，從而降低生產(chǎn)成本、提高生產(chǎn)效率。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為本發(fā)明的實(shí)施例1中不同碳源對(duì)糞腸球菌高密度發(fā)酵的影響的柱狀圖。

圖2為本發(fā)明的實(shí)施例1中不同碳源對(duì)糞腸球菌高密度發(fā)酵產(chǎn)乳酸的影響的柱狀圖。

圖3為本發(fā)明的實(shí)施例2中不同ph對(duì)糞腸球菌高密度發(fā)酵的影響的柱狀圖。

圖4為本發(fā)明的實(shí)施例3中不同堿性ph中和劑對(duì)糞腸球菌高密度發(fā)酵的影響的柱狀圖。

圖5為本發(fā)明的實(shí)施例4中恒定溶氧對(duì)糞腸球菌高密度發(fā)酵的影響的柱狀圖。

圖6為本發(fā)明的實(shí)施例5甘油-硫酸銨耦合流加補(bǔ)料分批發(fā)酵試驗(yàn)中的柱狀圖。

圖7為本發(fā)明的實(shí)施例6中糞腸球菌高密度發(fā)酵及比較的折線圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖1-7對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)闡述，以使本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特征能更易于被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，從而對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍做出更為清楚明確的界定。

通過下列實(shí)施例將更具體的說明本發(fā)明，但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是為了說明本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

本實(shí)施例中，糞腸球菌來源于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)為cicc20419。

實(shí)施例1利用不同碳源進(jìn)行糞腸球菌高密度發(fā)酵

發(fā)酵培養(yǎng)基：豆粕10g/l、硫酸銨2g/l、三水合磷酸氫二鉀2g/l、三水合乙酸鈉5g/l、二水合檸檬酸鈉2g/l、七水合硫酸鎂0.3g/l、一水合硫酸錳0.2g/l、甘油/葡萄糖/蔗糖/淀粉20g/l,用25％氨水調(diào)至ph7.0。

種子液制備：將在﹣80℃保存的糞腸球菌甘油菌種劃線于mrs(葡萄糖20g/l；蛋白胨10g/l；酵母粉5g/l；檸檬酸氫二銨2g/l；乙酸鈉5g/l；磷酸氫二鉀2g/l；硫酸鎂0.58g/l；硫酸錳0.25g/l)瓊脂培養(yǎng)基上，放置32℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落；挑取飽滿的單菌落接入裝有mrs液體試管，37℃，50r/min搖瓶培養(yǎng)10小時(shí)后；以1％接種量轉(zhuǎn)接于mrs液體培養(yǎng)基，37℃，100r/min震蕩培養(yǎng)8小時(shí)后作為種子液。

發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng):標(biāo)定溶氧電極，配制發(fā)酵罐培養(yǎng)基3l，加入5l發(fā)酵罐中121℃、15min高壓滅菌待用。調(diào)節(jié)罐體溫度至37℃，使用25％氨水調(diào)節(jié)ph至7.0，并接種種子液90ml，啟動(dòng)發(fā)酵程序。發(fā)酵參數(shù)設(shè)定為：溫度37℃，初始轉(zhuǎn)速150r/min；調(diào)節(jié)通氣量和轉(zhuǎn)速，維持的恒定溶氧分別為5％、10％、15％、20％；分析不同碳源(甘油、葡萄糖、蔗糖、淀粉)對(duì)糞腸球菌發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)的影響。

結(jié)果：如圖1、圖2所示，糞腸球菌在溶氧控制20％的條件下利用甘油作為碳源時(shí)生長(zhǎng)狀態(tài)最好，呈s型曲線增長(zhǎng)，在0～3h處于滯留期，3h～14h呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，而在14h后增殖緩慢，開始進(jìn)入平臺(tái)期。甘油作為碳源，降低發(fā)酵液中乳酸的濃度，解除乳酸的反饋抑制作用，隨著維持的溶氧含量增加，提高了甘油轉(zhuǎn)化為能量的效率，促進(jìn)了菌體的進(jìn)一步生長(zhǎng)，提高發(fā)酵液的活菌數(shù)。發(fā)酵過程中在糞腸球菌高密度發(fā)酵的活菌數(shù)達(dá)到1.82×10¹⁰cfu/ml，而蔗糖和葡萄糖作為碳源能達(dá)到的菌體濕重較之甘油相對(duì)較低，為0.96×10¹⁰cfu/ml左右，但仍實(shí)現(xiàn)了超過1.1×10¹⁰cfu/ml的高密度發(fā)酵。

實(shí)施例2控制不同ph對(duì)糞腸球菌高密度發(fā)酵的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基：豆粕15g/l、甘油25g/l、硫酸銨2g/l、三水合磷酸氫二鉀3g/l、三水合乙酸鈉5g/l、二水合檸檬酸鈉3g/l、七水合硫酸鎂0.5g/l、一水合硫酸錳0.25g/l。

種子液制備：將在﹣80℃保存的糞腸球菌甘油菌種劃線于mrs(葡萄糖20g/l；蛋白胨10g/l；酵母粉5g/l；檸檬酸氫二銨2g/l；乙酸鈉5g/l；磷酸氫二鉀2g/l；硫酸鎂0.58g/l；硫酸錳0.25g/l)瓊脂培養(yǎng)基上，放置33℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落；挑取飽滿的單菌落接入裝有mrs液體試管，32℃，150r/min搖瓶培養(yǎng)10小時(shí)后；以1％接種量轉(zhuǎn)接于mrs液體培養(yǎng)基，37℃，100r/min震蕩培養(yǎng)8小時(shí)后作為種子液。

發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng):配制發(fā)酵罐培養(yǎng)基3l，加入5l發(fā)酵罐中121℃、15min高壓滅菌待用。調(diào)節(jié)罐體溫度至32℃，使用25％氨水調(diào)節(jié)ph至7.0；接種種子液240ml，啟動(dòng)發(fā)酵程序。發(fā)酵參數(shù)設(shè)定為：發(fā)酵溫度39℃、轉(zhuǎn)速300r/min；通風(fēng)比0.1～0.5vvm；以25％的氨水為中和劑，選定流加過程維持的恒定ph值分別為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，當(dāng)ph降至設(shè)定值以下時(shí)，自動(dòng)補(bǔ)堿功能進(jìn)行自動(dòng)控制流加，使ph維持在設(shè)定值，發(fā)酵16h后停止發(fā)酵。每種恒定ph條件做3個(gè)批次的平行試驗(yàn)。

結(jié)果分析：如圖3，恒定ph為5.5的條件下發(fā)酵活菌數(shù)明顯高于恒定其他ph下，達(dá)到2.3×10¹⁰cfu/ml。

實(shí)施例3最適堿性ph中和劑的優(yōu)化

發(fā)酵培養(yǎng)基：豆粕10g/l、甘油20g/l、硫酸銨1g/l、三水合磷酸氫二鉀2g/l、三水合乙酸鈉8g/l、二水合檸檬酸鈉2g/l、七水合硫酸鎂0.4g/l、一水合硫酸錳0.25g/l。

種子液制備：將在﹣80℃保存的糞腸球菌甘油菌種劃線于mrs(葡萄糖20g/l；蛋白胨10g/l；酵母粉5g/l；檸檬酸氫二銨2g/l；乙酸鈉5g/l；磷酸氫二鉀2g/l；硫酸鎂0.58g/l；硫酸錳0.25g/l)瓊脂培養(yǎng)基上，放置34℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落；挑取飽滿的單菌落接入裝有mrs液體試管，39℃，200r/min搖瓶培養(yǎng)10小時(shí)后；以1％接種量轉(zhuǎn)接于mrs液體培養(yǎng)基，37℃，100r/min震蕩培養(yǎng)10小時(shí)后作為種子液。

發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng):配制發(fā)酵罐培養(yǎng)基3l，加入5l發(fā)酵罐中121℃、15min高壓滅菌待用。調(diào)節(jié)罐體溫度至37℃，并接種種子液120ml，啟動(dòng)發(fā)酵程序。發(fā)酵參數(shù)設(shè)定為：溫度37℃；轉(zhuǎn)速50r/min；通風(fēng)比0.1～0.5vvm；發(fā)酵液ph值下限設(shè)定為5.5。分別選擇氨水、koh、naoh、na2co3作為堿性ph中和劑，當(dāng)ph降至設(shè)定值以下時(shí)，利用發(fā)酵系統(tǒng)的自動(dòng)補(bǔ)堿系統(tǒng)功能進(jìn)行自動(dòng)控制流加，使ph維持在設(shè)定值，以不進(jìn)行中和劑流加的分批發(fā)酵作為對(duì)照。發(fā)酵16h后停止發(fā)酵。每種堿性ph中和劑條件下做3個(gè)批次的平行試驗(yàn)。

結(jié)果分析：不管采用哪種中和劑，其發(fā)酵活菌都顯著高于不流加堿性ph中和劑的活菌數(shù)。如圖4所示，以30％的na2co3作為中和劑，發(fā)酵活菌數(shù)明顯高于氨水組、koh組、naoh組。因此確定30％的na2co3最適堿性ph中和劑。

實(shí)施例4發(fā)酵參數(shù)最適恒定溶氧的優(yōu)化

發(fā)酵培養(yǎng)基：豆粕12g/l、甘油28g/l、硫酸銨1.5g/l、三水合磷酸氫二鉀2g/l、三水合乙酸鈉6g/l、二水合檸檬酸鈉3g/l、七水合硫酸鎂0.8g/l、一水合硫酸錳0.15g/l。

種子液制備：將在－80℃保存的糞腸球菌甘油菌種劃線于mrs(葡萄糖20g/l；蛋白胨10g/l；酵母粉5g/l；檸檬酸氫二銨2g/l；乙酸鈉5g/l；磷酸氫二鉀2g/l；硫酸鎂0.58g/l；硫酸錳0.25g/l)瓊脂培養(yǎng)基上，放置39℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落；挑取飽滿的單菌落接入裝有mrs液體試管，35℃，170r/min搖瓶培養(yǎng)10小時(shí)后；以1％接種量轉(zhuǎn)接于mrs液體培養(yǎng)基，37℃，100r/min震蕩培養(yǎng)9小時(shí)后作為種子液。

發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng):配制發(fā)酵罐培養(yǎng)基3l，加入5l發(fā)酵罐中121℃、15min高壓滅菌待用。調(diào)節(jié)罐體溫度至37℃，使用25％氨水調(diào)節(jié)ph至6.5，并接種種子液90ml，啟動(dòng)發(fā)酵程序。發(fā)酵參數(shù)設(shè)定為：溫度37℃、以30％的na2co3為中和劑，當(dāng)ph降至5.5，自動(dòng)補(bǔ)堿功能進(jìn)行自動(dòng)控制流加，使ph維持在5.5；調(diào)節(jié)通氣量和轉(zhuǎn)速，維持的恒定溶氧分別為20％、25％、30％；發(fā)酵16h后停止發(fā)酵。每種恒定ph條件做3個(gè)批次的平行試驗(yàn)。

結(jié)果分析：如圖5所示，控制溶氧在25％的條件下發(fā)酵活菌數(shù)明顯高于控制溶氧在20％或30％下，發(fā)酵活菌數(shù)達(dá)到4.8×10¹⁰cfu/ml。

實(shí)施例5甘油-硫酸銨耦合流加補(bǔ)料分批發(fā)酵試驗(yàn)

1、糞腸球菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)基組分及其含量為：

豆粕13g/l、甘油22g/l、硫酸銨3g/l、三水合磷酸氫二鉀3g/l、三水合乙酸鈉7g/l、二水合檸檬酸鈉2g/l、七水合硫酸鎂0.6g/l、一水合硫酸錳0.3g/l。

2、糞腸球菌高密度發(fā)酵主要步驟如下

(1)將冷凍保存的糞腸球菌甘油菌種劃線于mrs(葡萄糖20g/l；蛋白胨10g/l；酵母粉5g/l；檸檬酸氫二銨2g/l；乙酸鈉5g/l；磷酸氫二鉀2g/l；硫酸鎂0.58g/l；硫酸錳0.25g/l)瓊脂培養(yǎng)基上，放置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落；上述單菌落中挑取飽滿的單菌落接入裝有mrs液體試管，37℃，50r/min搖瓶培養(yǎng)10小時(shí)后；以1％接種量轉(zhuǎn)接于mrs液體培養(yǎng)基，37℃，100r/min震蕩培養(yǎng)8小時(shí)后作為種子液；

(2)稱取甘油800g和硫酸銨80g，加蒸餾水溶解并定容至100ml，在103.4kpa蒸汽壓力、110℃下蒸汽滅菌30min得補(bǔ)料液；

(3)配制糞腸球菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基降至所需溫度時(shí)，接上溶氧電極，標(biāo)定溶氧為100％；

(4)接種，以5％的接種量將步驟(1)所得的種子液接種于步驟(3)的發(fā)酵培養(yǎng)基中；

(5)發(fā)酵參數(shù)設(shè)定為：溫度37℃、調(diào)節(jié)通氣量和轉(zhuǎn)速，溶氧維持在25％；發(fā)酵過程中維持發(fā)酵液ph值為5.5，當(dāng)ph低于設(shè)定值時(shí)，30％的na2co3溶液維持在設(shè)定值；

a組:補(bǔ)料流加速度控制在10g/h，使甘油濃度在2g/l左右。

b組:補(bǔ)料流加速度25g/h，甘油濃度15g/l左右。

c組:根據(jù)細(xì)菌生長(zhǎng)的密度值改變補(bǔ)料流加速度，補(bǔ)料流加速度控制在10～25g/h，甘油濃度在10g/l左右

(6)發(fā)酵16h后停止發(fā)酵。每種恒定ph條件做3個(gè)批次的平行試驗(yàn)。

3、結(jié)果分析：如圖6所示，c組條件下糞腸球菌發(fā)酵活菌數(shù)明顯高于a組和b組，發(fā)酵活菌數(shù)達(dá)到7.3×10¹⁰cfu/ml。

實(shí)施例6糞腸球菌的高密度發(fā)酵培養(yǎng)方法

1、糞腸球菌高密度發(fā)酵種子和發(fā)酵培養(yǎng)基的成分和配制：

種子及發(fā)酵培養(yǎng)基的主要成分及含量為：豆粕10g/l、甘油30g/l、硫酸銨2.5g/l、三水合磷酸氫二鉀2.5g/l、三水合乙酸鈉8g/l、二水合檸檬酸鈉4g/l、七水合硫酸鎂0.7g/l、一水合硫酸錳0.1g/l。

補(bǔ)料培養(yǎng)基的主要成分及含量為：甘油800g和硫酸銨80g

補(bǔ)料培養(yǎng)基配配制方法如下:

稱取培養(yǎng)基各組分，充分溶解后，定容至所需體積，110℃滅菌30分鐘。

種子搖瓶培養(yǎng)基配制方法如下：

稱取培養(yǎng)基各組分，充分溶解后，用25％氨水溶液調(diào)ph至7.0，定容至所需體積，110℃滅菌30分鐘。

發(fā)酵罐培養(yǎng)基配制方法如下：

(1)發(fā)酵罐中裝入20g/l氫氧化鈉溶液，裝液量為70％，0.11-0.16mpa滅菌1h，冷卻后放液，用自來水沖洗發(fā)酵罐2次后放空發(fā)酵罐。

(2)按上述含量分別稱取各組分，用蒸餾水溶解，裝入發(fā)酵罐中0.14mp滅菌30分鐘。

(3)攪拌混勻，37℃，100rpm保溫1h，用25％氨水溶液調(diào)ph至7.0后，0.14mpa滅菌40分鐘。待溫度穩(wěn)定在37℃時(shí)，校正溶氧為100％。

(4)滅菌后的培養(yǎng)基在37℃，50rpm，不通氣條件下空培至接種前。

2.種子液制備

(1)挑取新鮮培養(yǎng)的糞腸球菌斜面，接種至種子搖瓶培養(yǎng)基中，37℃，50r/min搖瓶培養(yǎng)8小時(shí)作為一級(jí)搖瓶種子液。

(2)在50l發(fā)酵罐中配制二級(jí)種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)前對(duì)二級(jí)種子培養(yǎng)基及一級(jí)搖瓶種子液進(jìn)行鏡檢，確保無雜菌污染。

(3)接種前將50l發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速調(diào)至100rpm，并用滅菌的25％氨水調(diào)二級(jí)種子培養(yǎng)基ph至7.0后，按照2％的接種量將一級(jí)種子液接入50l發(fā)酵罐中。

(4)發(fā)酵參數(shù)設(shè)定：發(fā)酵溫度37℃；轉(zhuǎn)速200rpm；通風(fēng)比0.1～0.5vvm；；不控ph不補(bǔ)料，發(fā)酵8h結(jié)束作為二級(jí)種子液。

3.2噸發(fā)酵罐規(guī)模條件下的高密度發(fā)酵

(1)發(fā)酵前對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基及二級(jí)種子液進(jìn)行鏡檢，確保無污染。

(2)接種前將2噸發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速調(diào)至100rpm，并用滅菌的25％氨水調(diào)ph至6.8后，將二級(jí)種子液全部轉(zhuǎn)接至2噸發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵。

(3)發(fā)酵參數(shù)設(shè)定為：發(fā)酵溫度37℃；調(diào)節(jié)通氣量和轉(zhuǎn)速，維持溶氧在25％左右；發(fā)酵過程中維持發(fā)酵液ph值為5.5，當(dāng)ph低于設(shè)定值時(shí)，30％的碳酸鈉溶液維持在設(shè)定值；通過流加補(bǔ)料培養(yǎng)基，補(bǔ)料流加速度控制在10～25g/h，使甘油濃度維持在10g/l左右；

(4)當(dāng)補(bǔ)加料液ph不再降低或發(fā)酵液在600nm波長(zhǎng)下的吸光值不再增加時(shí)，終止發(fā)酵，即得糞腸球菌活菌數(shù)達(dá)8.9×10¹⁰cfu/ml以上的發(fā)酵液。

4.對(duì)比試驗(yàn)

(1)傳統(tǒng)mrs培養(yǎng)基的主要成分及含量為：

葡萄糖：20g/l、蛋白胨：10g/l、牛肉膏：5g/l、酵母粉：4g/l、三水合磷酸氫二鉀：2g/l、三水合乙酸鈉：5g/l、檸檬酸氫二銨：2g/l、七水合硫酸鎂：0.5g/l、一水合硫酸錳：0.25g/l、吐溫80：1ml/l。

(2)種子搖瓶培養(yǎng)基配置方法如下

稱取培養(yǎng)基各組分，充分溶解后，用冰醋酸調(diào)ph至6.2，定容至所需要體積，121℃滅菌15分鐘。

(3)發(fā)酵罐培養(yǎng)基配制方法如下：

發(fā)酵罐中裝入20g/l氫氧化鈉溶液，裝液量為60％，0.11-0.16mpa滅菌1h，冷卻后放液，用自來水沖洗發(fā)酵罐2次后放空發(fā)酵罐。稱取培養(yǎng)基各組分，加入適量自來水?dāng)嚢柚脸浞秩芙猓a(bǔ)加自來水至發(fā)酵罐總體積的60％。37℃，100rpm保溫1h，用冰醋酸調(diào)ph至6.2后，0.12mpa滅菌30分鐘。待溫度穩(wěn)定在37℃時(shí)，校正溶氧為100％。滅菌后的培養(yǎng)基在38℃，50rpm，不通氣條件下空培至接種前。

(4)2噸發(fā)酵罐的發(fā)酵

挑取新鮮培養(yǎng)的糞腸球菌斜面，接種至種子搖瓶培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)10h作為一級(jí)種子液。在50l發(fā)酵罐中配制二級(jí)種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)前對(duì)二級(jí)種子培養(yǎng)基及一級(jí)種子液進(jìn)行鏡檢，確保無雜菌污染。發(fā)酵前對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基及二級(jí)種子液進(jìn)行鏡檢，確保無污染。

接種前將2噸發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速調(diào)至100rpm，并用滅菌的40％氫氧化鈉溶液調(diào)ph至6.2后，將二級(jí)種子液全部接入發(fā)酵罐中。

發(fā)酵參數(shù)設(shè)定為：溫度37℃；轉(zhuǎn)速100r/min；不通氣；發(fā)酵過程中維持發(fā)酵液ph值為6.2，當(dāng)ph超過設(shè)定值時(shí)，補(bǔ)加料液(補(bǔ)料培養(yǎng)基:葡萄糖800g/l和硫酸銨80g/l)；當(dāng)ph低于設(shè)定值時(shí)，自動(dòng)流加堿性中和劑(滅菌的20％氫氧化鈉溶液)維持在設(shè)定值。

(4)當(dāng)補(bǔ)加料液ph不再降低或發(fā)酵液在600nm波長(zhǎng)下的吸光值不再增加時(shí)，終止發(fā)酵，即得糞腸球菌活菌數(shù)達(dá)1.8×10¹⁰cfu/ml以上的發(fā)酵液。

5結(jié)果分析

如圖7所示，應(yīng)用本發(fā)明的培養(yǎng)基及其發(fā)酵工藝，可以得到糞腸球菌活菌數(shù)達(dá)8.9×10¹⁰cfu/ml的發(fā)酵液，而現(xiàn)行采用分批補(bǔ)料發(fā)酵方式獲得的糞腸球菌最大活菌數(shù)為3.2×10¹⁰cfu/ml，本發(fā)明的培養(yǎng)基及其發(fā)酵工藝得到的高密度發(fā)酵糞腸球菌活菌數(shù)為現(xiàn)有技術(shù)的2.78倍，完全滿足了糞腸球菌作為飼用乳酸菌的生產(chǎn)要求。

不局限于此，任何不經(jīng)過創(chuàng)造性勞動(dòng)想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所限定的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。