本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及含有磷脂雙分子層的fgfr的類膜體系及其組裝方法。

背景技術(shù)：

成纖維細胞生長因子受體屬于酪氨酸(fibroblastgrowthfactorreceptor，fgfrs)激酶超家族中的成員。人類fgfr家族具有四個成員，fgfr1、fgfr2、fgfr3、fgfr4。fgfr家族在生物體的生理和代謝活動中具有十分重要的功能，包括胚胎發(fā)育、受傷組織修復、血管的生成、細胞增殖、細胞遷移和細胞分化等，異常的信號通路可能會導致癌癥的發(fā)生。因此，fgfrs成為了腫瘤學中潛在的藥物靶標，研究fgfrs的信號通路、作用機制和原理對相關(guān)的疾病研究和藥物開發(fā)具有十分重要的意義。

fgfr在結(jié)構(gòu)上一般分為三個部分，膜外配體結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)、膜內(nèi)激酶區(qū)。在蛋白質(zhì)水平上fgfr1、fgfr2、fgfr3和fgfr4大約有55％～72％的同源序列，因此具有很高的同源性。膜外區(qū)主要包括一個疏水的信號肽段，2～3個類免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域(d1～d3)，在d1區(qū)和d2區(qū)之間有一個～30個蘇氨酸的酸盒，d2和d3結(jié)構(gòu)區(qū)是結(jié)合配體(fgf)和硫酸肝素(hpsg)的區(qū)域；跨膜區(qū)的功能是把物質(zhì)和信號從膜外區(qū)傳送到膜內(nèi)區(qū)；在膜內(nèi)區(qū)的部分，靠近細胞膜的區(qū)段被稱為近膜區(qū)，近膜區(qū)連接著膜內(nèi)的酪氨酸激酶區(qū)域；在膜內(nèi)區(qū)最末端是c端。體外對fgfr的研究還只限制在fgfr的單結(jié)構(gòu)域的研究，沒有在整體的結(jié)構(gòu)水平下對fgfr的功能進行研究，因此，如果能夠在體外構(gòu)建一種含有磷脂雙分子層的fgfr的類膜體系(包括fgfr的包含跨膜區(qū)，膜外配體結(jié)合區(qū)，膜內(nèi)激酶區(qū))，模擬天然的fgfr的生理條件，對于真實和準確的研究fgfr的功能具有深遠的意義，同時利用所述類膜體系為fgfr的功能研究，fgfr抗體的制備及fgfr抑制劑的篩選及改造，提供了有利的工具。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明人經(jīng)過深入研究，開發(fā)出人造的含有磷脂雙分子層的fgfr的類膜體系及其制備方法，并在多個方面利用所述人造的含有磷脂雙分子層的fgfr的類膜體系。

具體而言，本發(fā)明提供一種人造的含有磷脂雙分子層的fgfr的類膜體系，所述類膜體系包含：

1)成纖維細胞生長因子受體(fibroblastgrowthfactorreceptor，fgfr)，

2)磷脂雙分子層，

3)膜骨架蛋白(membranescaffoldprotein，msp)，

其中，msp包裹磷脂形成磷脂雙分子層，fgfr的胞外區(qū)在磷脂雙分子層的一側(cè)，fgfr的胞內(nèi)區(qū)在磷脂雙分子層的另一側(cè)，fgfr的跨膜區(qū)由磷酸雙分子層包裹，并貫穿整個磷脂雙分子層。

在優(yōu)選的實施方案中，所述磷脂雙分子層是碟狀的。

在優(yōu)選的實施方案中，所述fgfr包括fgfrlc(其氨基酸序列如seqidno：1所示)、fgfr1b(其氨基酸序列如seqidno：2所示)、fgfr2c(其氨基酸序列如seqidno：3所示)、fgfr2b(其氨基酸序列如seqidno：4所示)、fgfr3c(其氨基酸序列如seqidno：5所示)、fgfr3b(其氨基酸序列如seqidno：6所示)、fgfr4(其氨基酸序列如seqidno：7所示)，或在包含跨膜區(qū)的前提下與上述任意一種具有60％以上，優(yōu)選80以上，還優(yōu)選95％以上，更優(yōu)選99％以上的同源性的氨基酸序列。

在優(yōu)選的實施方案中，用于形成類膜體系的所述磷脂包括所有的磷脂，優(yōu)選選自popg(1-棕櫚酰-2-油酰-sn-甘油基-3-磷酸-(1′-rac-甘油))或popc(1-棕櫚酰-2-油酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿)或pope(1-十六?；?2-(9z-十八碳烯酰)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺)或pops(1-棕櫚酰-2-油酰-sn-甘油基-3-磷酸-l-絲氨酸)或dopg(1，2-二-(9z-十八碳烯酰)-sn-甘油基-3-磷酸-(1′-rac-甘油))或dopc(1，2-二-(9z-十八碳烯酰)-sn-甘油基-3-磷酸膽堿)或dope(1，2-二-(9z-十八碳烯酰)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺)或dops(1，2-二-(9z-十八碳烯酰)-sn-甘油基-3-磷酸-l-絲氨酸)或pi(3，4)p21-十七酰-2-(5z，8z，11z，14z-花生四烯酰)-sn-甘油基-3-磷酸-(1′-肌肉-肌醇-3′，4′-二磷酸)或pi(4，5)p2(1-十七酰-2-(5z，8z，11z，14z-花生四烯酰)-sn-甘油基-3-磷酸-(1′-肌肉-肌醇-4′，5′-二磷酸))或pi(3，4，5)p3(1-十七酰-2-(5z，8z，11z，14z-花生四烯酰)-sn-甘油基-3-磷酸-(1′-肌肉-肌醇-3′，4′，5′-三磷酸))。所述磷脂最優(yōu)選選自popg和popc，其中磷脂的組成由它們中的一種及多種按照不同比例混合。

在優(yōu)選的實施方案中，所述比例是其中一種磷脂可以是1％-100％。

在優(yōu)選的實施方案中，膜骨架蛋白msp包括msp1d1(其氨基酸序列如seqidno：8所示)，msp1d1dh7-10(其氨基酸序列如seqidno：9所示)，msp1d1dh5(其氨基酸序列如seqidno：10所示)，或與msp序列具有70％以上，優(yōu)選80％以上，還優(yōu)選90％上，更優(yōu)選95％以上，最優(yōu)選98％以上的同源性的氨基酸序列。

在優(yōu)選的實施方案中，所述人造的含有磷脂雙分子層的fgfr的類膜體系通過以下步驟構(gòu)建：

1)將fgfr編碼基因插入到真核表達載體中，并用真核細胞表達fgfr蛋白；

2)將純化的所述fgfr蛋白與msp，磷脂和去污劑混合；

3)去除步驟2)中多余的去污劑；

4)分離含有磷脂雙分子層的fgfr的類膜體系。

在優(yōu)選的實施方案中，所述真核表達載體可以是哺乳動物表達載體和或昆蟲細胞表達載體。

在優(yōu)選的實施方案中，fgfr蛋白與msp，磷脂和去污劑的比例為1∶1-2：50-100∶100-200，優(yōu)選比例為為1∶1∶50∶100。

在優(yōu)選的實施方案中，其中fgfr蛋白，msp，磷脂和去污劑中任意兩種成分的可選比例是原比例的0.01-100倍，優(yōu)選比例為0.1-10倍更優(yōu)選比例為0.5-5倍，最優(yōu)選比例為0.8-2.5倍。

在優(yōu)選的實施方案中，所述去污劑選自聚乙二醇辛基苯基醚(triton)或膽酸鈉，更優(yōu)選膽酸鈉。

在優(yōu)選的實施方案中，所述磷脂選自popg、popc、pope、pops、dopg、dopc、dope、dops、dmpc、pi(3，4)p2、pi(4，5)p2、pi(3，4，5)p3或其組合，優(yōu)選為popg。

本發(fā)明還提供一種制備所述人造的含有磷脂雙分子層的fgfr的類膜體系的方法，所述方法包括以下步驟：

1)將fgfr編碼基因插入到真核中，并用真核細胞表達fgfr蛋白；

2)將純化的所述fgfr蛋白與msp，磷脂和去污劑按照一定比例混合；

3)去除來自步驟2)中的去污劑；和

4)分離含有磷脂雙分子層的fgfr的類膜體系。

在優(yōu)選的實施方案中，所述真核表達載體可以是哺乳動物表達載體和或昆蟲細胞表達載體。

在優(yōu)選的實施方案中，fgfr蛋白與msp，磷脂和去污劑的比例中可選比例為1∶1-2∶30-100∶100-200，優(yōu)選為1∶1∶40∶80。

在優(yōu)選的實施方案中，其中任意兩種成分的可選比例是原比例的0.01-100倍，優(yōu)選比例為0.1-10倍更優(yōu)選比例為0.5-5倍，最優(yōu)選比例為0.8-2.5倍。

在優(yōu)選的實施方案中，所述去污劑選自壬基酚聚氧乙烯醚(np-40)，聚乙二醇辛基苯基醚(triton)，或膽酸鈉，更優(yōu)選膽酸鈉。

在本發(fā)明中，msp是由apolipoproteina-i(apoa-i)蛋白改造得到的兩親性蛋白，其包裹磷脂形成的納米級碟狀磷脂雙分子層，進一步的，將fgfr遷入到納米盤中，其中fgfr的胞外區(qū)在納米盤的磷脂雙分子層的一側(cè)，fgfr的胞內(nèi)區(qū)在納米盤的磷脂雙分子成的另一側(cè)，fgfr的跨膜區(qū)由磷酸雙分子層包裹，并貫穿整個磷脂雙分子層。

需要注意的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉成纖維細胞生長因子受體酪氨酸(fgfr)家族包括fgfr1c、fgfr1b、fgfr2c、fgfr2b、fgfr3c、fgfr3b、fgfr4等7個成員，它們具有很高的同源性，都為單跨膜的膜蛋白，所以在納米盤的組裝方法上具有共性。

因此，本發(fā)明中所述的“fgfr蛋白”是指天然存在于人中的成熟fgfr蛋白，在典型的情況下，fgfr蛋白包括七種，分別是fgfr1c、fgfr1b、fgfr2c、fgfr2b、fgfr3c、fgfr3b、fgfr4，其氨基酸序列分別如seqidno：1-7所示，或在包含所述fgfr的跨膜區(qū)的前提下與seqidno：1-7具有60％以上，優(yōu)選80％以上，還優(yōu)選95％以上，更優(yōu)選99％以上的同源性的氨基酸序列。

在優(yōu)選的實施方案中，所述真核表達載體是pfastbac^tm1，pfastbac^tm-gus，pfastbac^tmht，pfastbac^tmht-cat，pfastbac^tmdual或pfastbac^tmdual-gus/cat，用藍白斑篩選法篩選出插入有目的片段，即fgfr編碼基因的表達載體。

在優(yōu)選的實施方案中，所述真核細胞是昆蟲細胞，優(yōu)選sf9或sf21細胞。

在優(yōu)選的實施方案中，通過用含有tritonx-100的裂解緩沖液裂解細胞，通過肝素層析柱進行純化，獲得fgfr蛋白。所述去污劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知和常用的。

在優(yōu)選的實施方案中，步驟3)中所述的多余的去污劑用biobeads去除。

在優(yōu)選的實施方案中，步驟4)中所述分離利用分子篩進行。用于本發(fā)明的分子篩是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如fplc分子篩(superdex20010/300gl，ge)。、

在優(yōu)選的實施方案中，磷脂(lipid)是popg或popc或pope或pops或dopg或dopc或dope或dops，或pip2或pip3或clp的一種，或是其中兩種及兩以上的混合物，其中混合比例可以是任意的。

在優(yōu)選的實施方案中，所加入的去污劑是膽酸鈉。

在優(yōu)選的實施方案中，所述msp：磷脂：膽酸鈉：fgfr1c的比例是1∶50∶100∶1。

本發(fā)明還提供所述的人造的含有磷脂雙分子層的fgfr的類膜體系用于制備抗體、藥物篩選或開發(fā)fgfr活性檢測試劑盒的用途，所述藥物優(yōu)選為fgfr抑制劑。

本發(fā)明制備的含有fgfr的納米盤(nanodisc)的主要優(yōu)點是能夠使不易溶解的蛋白如fgfr等跨膜蛋白在沒有去污劑的條件下溶解，并且使fgfr存在于一種接近天然磷脂雙分子層環(huán)境中，形成的納米盤大小均一，且尺寸可控。

附圖說明

圖1fgfr1c核酸電泳圖

圖2.fgfr1c蛋白sds-page凝膠電泳圖

圖3.msp蛋白sds-page凝膠電泳圖

圖4.fgfr1c的納米盤分子排阻層析圖

圖5.fgfr1c的納米盤的sds-page凝膠電泳圖

圖6.fgfr1c的納米盤的透射電鏡圖

圖7.fgfr1c的納米盤的磷酸化及抑制劑藥效的westernblot圖

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。

實施中實驗主要試劑耗材及儀器：克隆所用引物均為上海生工合成。聚合酶鏈式反應(pcr)中dna聚合酶(primerstar)、限制性內(nèi)切酶、連接酶、dpnl均購于takara公司；dnamarker購于thermo公司；普通dna產(chǎn)物回收試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購于tiangen公司。e.colidh5α菌株，e.colidh10菌株，e.colibl21菌株，pet22b-sumo-fgf21質(zhì)粒，sumo蛋白酶購于北京索萊寶科技有限公司。

s.o.c培養(yǎng)基、tris、咪唑、抗生素購置于上海生工，其他鹽類購于國藥，濃縮管購于millipore。fplc儀器使用的是ge公司的系統(tǒng)，使用的肝素親和層析柱，ni-sepharose層析柱和分子排阻層析柱hiload16/60superdex75pg均購于ge公司。昆蟲細胞培養(yǎng)基(sf-900tmiisfm)，購自gibco。bca試劑盒購于thermo，fgfr酪氨酸磷酸化抗體購自r&d。實施例1.fgfr1c的克隆與陽性篩選

以合成的fgfr1c為模板，進行pcr擴增，所述fgfr1c的序列如seqidno：1所示。所使用的兩條引物的序列分別為：

p1：5’-cccggatccatgtggagctggaagtgcctcctc-3’(seqidno：12)，

p2：5’-cgcaagcttcaagcggcgtttgagtccgccattg-3’(seqidno：13)。

在它們的兩端分別含有限制性內(nèi)切酶bamhi和hindiii的酶切位點。pcr反應條件為：94℃，5min；60℃，30s；72℃，3min，循環(huán)次數(shù)為30次，72℃，5min。瓊脂糖電泳檢測，如圖1所示。pcr產(chǎn)物純化試劑盒進行回收并將產(chǎn)物送交生工公司測序。pfastbac^tm1載體(購置invitrogen)與pcr擴增的fgfr1c的dna片段用限制性內(nèi)切酶bamhi和hindiii雙酶切，以獲得兩端分別為bamhi和hindiii酶切產(chǎn)生的粘性末端的pfastbac^tm1載體和fgfr1c(22-765)的dna片段。將它們分別用瓊脂糖電泳分離純化，紫外燈下切割含有pfastbac^tm1載體及fgfr1c目標片段的區(qū)域，dna小量回收試劑盒回收目標片段。瓊脂糖電泳結(jié)果估測載體和目的基因含量，將目的基因片段與載體按照摩爾比約3∶1的比例進行混合，takara連接試劑盒于16℃恒溫連接2h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化dh5a感受態(tài)細胞，挑選轉(zhuǎn)化菌株進行菌落pcr檢測并送交生工公司測序。

取測序正確的1ngpfastbac^tm1-fgfrlc重組質(zhì)粒加入至100μldh10bac的感受態(tài)細胞中，冰上孵育30min，42℃熱激45s，冰上孵育2min，加入900μls.o.c培養(yǎng)基(2％蛋白胨，0.5％酵母粉，0.05％nacl2，2.5mmkcl，10mmmgcl2，20mm葡萄糖)，37℃震蕩4h。用s.o.c培養(yǎng)基將細胞稀釋為原濃度的10^-1，10^-2，10^-3，取稀釋后的溶液100μl分別涂于含有50μg/ml卡那霉素、7μg/ml慶大霉素、10μg/ml四環(huán)素、100ug/mlbluo-gal以及40μg/mliptg的lb平板中，37℃培養(yǎng)48h。取平板上的10個白色單克隆，接種于含有50μg/ml卡那霉素、7μg/ml慶大霉素、10μg/ml四環(huán)素、100μg/mlbluo-gal以及40μg/mliptg的lb培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)。異丙醇沉淀法提取病毒桿粒，提取方法步驟如下：

1.用離心方法收集3ml過夜培養(yǎng)的細菌，用300ul溶液1(50mm葡萄糖，25mmtris-cl，10mmedta，100ug/mlrna酶)將菌體重懸，輕輕震蕩并混合均勻。

2.將300ul溶液2(0.2mnaoh，1％sds)加入到混合均勻的菌液中，輕輕混勻，孵育3-5分鐘，溶液變的澄清，到半透明狀態(tài)。

3.緩慢加入300ul溶液3(3m醋酸鉀，ph5.5)，輕輕混勻，形成白色沉淀。

4.在4℃下14000rpm離心20mins

5.輕輕將上清液轉(zhuǎn)移到含有0.9的異丙醇溶液中，混合均勻，冰上孵育20mins

6.在4℃下14000rpm離心10mins

7.去掉上清，用0.5ml的70％的乙醇溶液清洗三次。

8.室溫放置20-30分鐘完全去掉乙醇，加入40ul去離子水溶解提取的桿粒。

用pcr法檢測病毒桿粒。該pcr法中所使用的兩條引物序列分別為：

p1：5’-gcggatccatggctgtgctggtcacagccacactctgcacc-3’(seqidno：14)，

p2：5’-cccaagcttttactcctggttggaggtcaaggccacgatgcg-3’(seqidno：15)。

pcr反應條件為：94℃，3min；94℃，45s；55℃，45s；72℃，3min，從第二到第4步循環(huán)次數(shù)為30次，72℃，5min。瓊脂糖凝膠電泳法檢測pcr產(chǎn)物。結(jié)果如圖1所示，pcr鑒定目的條帶在2200bp處，與理論值一致。

實施例2.fgfr1c病毒包裝

首先將2×10⁶個sf9細胞放入t25培養(yǎng)瓶中并加入無抗體的昆蟲細胞培養(yǎng)基5ml，靜置30分鐘以上。另一方面利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑進行轉(zhuǎn)染，將12ul的轉(zhuǎn)染試劑和2ug的桿粒(實施例1中分離的)分別放入100ul無血清無抗性的培養(yǎng)基中，孵育30分鐘后再將兩種含有2ug的桿粒的培養(yǎng)基放入含有12ul轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)基中，孵育30分鐘后將混合物滴入預先準備好的t25培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)4天，收集上清病毒即是第一代病毒p1，將1mlp1加入到含有1×10⁷個細胞的t75培養(yǎng)瓶中(15-20ml昆蟲細胞培養(yǎng)基)，培養(yǎng)4天，收集上清病毒即是第二代病毒p2，將1mlp2加入到含有1×10⁷個細胞的t75培養(yǎng)瓶中(15-20ml培養(yǎng)基)，培養(yǎng)4天。收集上清，即為p3代病毒，可用于表達蛋白使用。

實施例3.fgfr1c蛋白的表達

用無菌的容量2l的三角燒瓶中加入500ml的s.o.c培養(yǎng)基，并加入sf9細胞使其細胞濃度達到0.5×10⁶個/ml，培養(yǎng)約20h，待細胞濃度達到1.0×10⁶個/ml時，每瓶加入5mlfgfr1c的p3代病毒，繼續(xù)培養(yǎng)36-48h，收集細胞，將收集的細胞進行sds-page凝膠電泳分析其表達。

實施例4.fgfr蛋白的純化

將收集的sf9細胞按照一定比例加入裂解液，以1g細胞(濕重)加入10ml細胞裂解液(20mmtris，100mmnacl，1mmdtt，0.2％triton，0.2mmnavo3，ph7.2)裂解1h后，利用超速離心機進行離心，5萬rpm離心1h，收集上清，用肝素親和層析純化蛋白。用平衡緩沖液(20mmtris，100mmnacl，1mmdtt，0.2％triton，0.2mmnavo3)平衡肝素親和層析柱，將上清液與肝素孵育1h，進行純化，利用洗脫緩沖液(20mmtris，300mmnacl，1mmdtt，0.2％triton，0.2mmnavo3)洗脫雜蛋白，最后用緩沖液(20mmtris，1mnacl，1mmdtt，0.2％triton，0.2mmnavo3)緩沖洗脫fgfr1c蛋白，并利用sds-page凝膠電泳進行鑒定。如圖2所示。凝膠電泳中純化后fgfr條帶的分子量在9萬左右，與理論分子分子量一致。

實施例5.msp1d1dh5載體構(gòu)建

在金斯瑞公司根據(jù)msp1d1dh5氨基酸序列進行大腸桿菌表達密碼子優(yōu)化，并合成cdna，(序列如seqidno：11所示)，推導的氨基酸序列如(seqidno：10)。

使用的引物包括：

正向引物：

5’-cgccatatgggtcatcatcatcatcatcatcacgattatgatattc-3’(seqidno：16)，

反向引物：

5’-ccggaatccttactgggtattcagctttttagt-3’(seqidno：17)。利用引物進行msp1d1dh5基因的擴增。

將msp1d1dh5的pcr產(chǎn)物用和pet28a質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶ndei和ecori酶切。將它們分別用瓊脂糖電泳分離純化，紫外燈下切割含有pet28a載體及msp1d1dh5目標片段的區(qū)域，dna小量回收試劑盒(購置于tiangen公司)回收目標片段，按照試劑盒提供的方法進行提取。瓊脂糖電泳結(jié)果檢測載體和目的基因含量，將目的基因片段與載體按照摩爾比約3∶1的比例進行混合，takara連接試劑盒于16℃恒溫連接2h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化dh5a感受態(tài)細胞，挑選轉(zhuǎn)化菌株進行菌落pcr檢測并送交生工公司測序。對正確的克隆進行質(zhì)粒提取，將提取的pet28a-msp1d1dh5質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌bl21(de3)菌種(novagen)中，得到具有卡那霉素抗性的陽性單克隆，將其作為表達菌種存于-80℃超低溫冰箱。

實施例6.msp1d1dh5蛋白表達

實驗的具體步驟如下：

(1)從-80℃中取出保存的msp1d1dh5菌種置于冰上，取出200ul接種到含有5mllb培養(yǎng)基試管中，加入終濃度為50mg的卡那霉素，37℃過夜培養(yǎng)；

(2)按1∶100(5ml)轉(zhuǎn)接至500mllb培養(yǎng)基，加入終濃度為50mg的卡那霉素，；

(3)37℃培養(yǎng)至od600達0.8-1.0之間時，加iptg250ul(終濃度為0.5m)，25℃誘導表達3.5-4h，離心收集菌體。

(4)將離心沉淀存入-80℃中，誘導前后樣品需進行sds-page檢測。

實施例7.msp1d1dh5蛋白純化

pet28a-msp1d1dh5載體來源于本實驗室，其中，msp的編碼序列為seqidno：11，在msp的n端插入有6*histag以方便對目的蛋白的純化，這里msp系列蛋白我們采用的是兩步層析法，分別是ni-nta親和柱層析法和fplc分子篩層析法。實驗的具體步驟如下：

(1)超聲破碎：從-80℃中取出保存的菌液，常溫水浴融化菌液，其間要不時搖勻幾次；待完全解凍后，倒出至玻璃小燒杯中，冰浴，超聲破碎儀參數(shù)設(shè)定為工作3s，間歇4s，時長5min，反復三次；然后將細胞破碎后溶液14000rpm30min(46#轉(zhuǎn)子)離心；取出上清存4℃；超聲破碎后離心前取20ul樣品，13000rpm1min離心，其中上清加4ul6*sdsloadingbuffer制成破碎上清電泳樣品，而沉淀部分加20ul2*sdsloadingbuffer重懸制成破碎后沉淀電泳樣品，均存放于-20℃。

(2)ni-nta親和柱純化：使用前需先對ni-nta親和柱進行再生處理和緩沖液平衡處理，處理方法是：分別用0.5mnaoh，100mmedta，100mmni2so4，20％乙醇各洗2個柱體積，各個環(huán)節(jié)前后均需穿插水洗5個柱體積，以去除之前掛在柱上的雜蛋白，最后用懸菌緩沖液平衡5個柱體積；將超聲破碎離心后的上清與適量鎳填料混勻在4℃中結(jié)合大于2h；結(jié)合完成后緩慢上樣，并收集穿出液；上樣結(jié)束后用平衡緩沖液洗2個柱體積，收集沒掛到柱上的雜蛋白峰；接著分別用不斷升高咪唑濃度的梯度緩沖液進行洗脫，收集各段蛋白峰；從各洗脫峰接收管中取出20ul用于sds-page檢測，其余分別保存至4℃。

(3)濃縮：根據(jù)sds-page檢測結(jié)果對洗脫峰接收管用超濾濃縮管(10kdcutoff)進行濃縮，3000rpm4℃離心，直至濃縮至約5ml。

(4)fplc分子篩進一步純化：組建好分子篩(hiload16/60superdex75，ge)，并用已抽濾的fplc平衡緩沖液平衡1個柱體積以上；將上步得到的濃縮液在4℃13000rpm離心10min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一新的ep管中；從此管中取5ul作為sds-page電泳樣品；將剩余處理好的濃縮液進行分子篩上樣(千萬不要吸進氣泡及沉淀)；進樣速度要控制好，關(guān)注柱壓；收集各峰蛋白液，并在各管中取出10ul用于sds-page電泳檢測，其余保存至4℃。

(5)二次濃縮：根據(jù)sds-page電泳檢測結(jié)果對分子篩各峰接收管用超濾濃縮管(10kdcutoff)進行濃縮，3000rpm4℃離心，直至濃縮至約1.5ml，保存至4℃。

(6)濃度測定：從最終獲得的蛋白樣品中取出5ul用分子篩緩沖液稀釋至200ul，通過紫外分光光度計測定a280吸光值；經(jīng)過計算可獲得蛋白的濃度。

實施例8.磷脂母液的制備

(1)本實驗中所購買的磷脂均為粉末，而組裝中常用磷脂母液，這樣所用磷脂均需先溶解在膽酸鈉溶液中，其母液制備過程如下：

(2)稱量所需的磷脂粉末，將其溶于氯仿溶液中，用緩慢的氮氣吹干使其平鋪于容器底部形成透明或是白色的薄膜，本實施例中稱取30mgpopc；

(3)將此容器用封口膜密封并留有少許氣孔，接著放入凍干瓶中使用真空冷凍凍干機進行凍干3-4h，以去除殘留的氯仿。

(4)往凍干過后的磷脂薄膜中加入適量的預先配置好的膽酸鈉溶液(通常膽酸鈉的濃度是磷脂濃度的兩倍)，然后在旋轉(zhuǎn)搖床上低速混勻過夜即可得到磷脂母液，本實施例中加入1ml80mm的膽酸鈉溶液(20mmtris，100mmnacl，ph7.2)

(5)混勻后的磷脂母液可長時間儲存在-80℃中。

實施例9.fgfr的納米盤組裝

(1)將純化好的msp蛋白和實施例8中制備的磷脂母液按照一定的比例混合，這里mspdh5∶磷脂∶膽酸鈉∶fgfr1c的物質(zhì)的量比＝1∶50∶100∶0.2；4℃孵育2h。

(2)孵育結(jié)束后，加入適量的疏水吸附劑bio-beadssm-2(bio-rad，hercules，ca)去除膽酸鈉分子；這里疏水吸附劑bio-beads的量與組裝溶液的膽酸鈉的含量成正比，通常是0.5-0.8g的bio-beads可以吸附去除過程在室溫條件下旋轉(zhuǎn)搖床中混合4-8h。

(3)混合結(jié)束后吸取上清，4℃13000rpm離心10min，通過fplc分子篩進一步純化(superdex20010/300gl，ge)；如圖3所示。取峰1進行sds-pag凝膠電泳檢測后用超濾濃縮管(30kdcutoff)進行濃縮，3000rpm4℃離心。進行sds-page凝膠電泳進行分析，如圖4所示。fgfr1c，msp，同時在峰1中出現(xiàn)。

實施例10.fgfr的納米盤的電鏡表征

將純化的樣品加入磷鎢酸進行染色，并吸取10ul滴定到400目的銅網(wǎng)上進行表征，電鏡圖片清晰可見nanodiscs，如圖5所示。成功的組裝了納米盤。

實施例11.fgfr的nanodisc的磷酸化驗證

活性驗證試驗，將實施例9中的含有fgfr1c的納米盤(溶于20mmtris，100mmnacl，ph7.2)分別分裝于4個ep管中，并分別加入多韋替尼，使多韋替尼終濃度為1000nm，500nm，250nm和0nm。隨后在4個ep管中分別加入終濃度為10mmmgcl2和20μmatp在37℃反應15min，加入2倍的上樣緩沖液(20mmtris-hclph8.0，100mmdtt，2％sds，20％甘油和0.016％考馬斯亮藍)，95℃加熱10min。反應之后進行westernblot，使用fgfr酪氨酸磷酸化抗體(r&d)進行驗證，如圖7所示。組裝進入納米盤中的fgfr能夠在體外自磷酸化，說明組裝之后的fgfr具有生物活性。圖7的結(jié)果還說明了組裝之后的fgfr能夠被fgfr抑制劑多韋替尼所抑制。綜上所述，含有fgfr的納米盤可以被用來做為藥物篩選，進一步地，其也可以被用來作為fgfr抗體的制備，還可以被用來作為fgfr活性檢測試劑盒的開發(fā)。

含有fgfr，磷脂雙分子層和膜骨架蛋白msp的類膜體系及其制備方法

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王俊峰

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趙宏鑫

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劉娟娟

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