本發(fā)明涉及一種提高脂肪細(xì)胞移植成活率的方法，屬于細(xì)胞移植技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

隨著年齡的增長，皮膚會逐漸出現(xiàn)松弛、彈性減弱以及局部凹陷等老化現(xiàn)象，整形外科常抽出患者身體多余脂肪，純化脂肪細(xì)胞后補(bǔ)充到患者需要填充的部位，不僅快速美化形體曲線，且使脂肪的損傷降到最低。一般采用低速離心、提純、凈化處理后，選擇完整的脂肪細(xì)胞顆粒，利用精細(xì)聯(lián)合化注射技術(shù)，多層次多點(diǎn)進(jìn)行太陽穴、蘋果肌、面頰、額頭、鼻子、口周等面部填充/除皺/塑形等。

自體脂肪移植已有上百年的歷史，由于其來源豐富、取材容易、操作簡單、充盈外形好、局部反應(yīng)小，無排異反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，且移植后具有較好的手感而易被患者接受，可以獲得較好的塑形等效果備受整形美容外科醫(yī)師的重視。因此，近年來，自體脂肪移植美容已經(jīng)成為愛美者最為接受的美容方式之一。

目前自體脂肪是整形外科進(jìn)行軟組織填充和塑形的常用填充材料，自體脂肪填充在臨床上應(yīng)用廣泛，自1893年neuber首次報(bào)道后一直是整形外科的研究熱點(diǎn)。近100年來，自體脂肪填充應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)展，可用于隆胸、隆頜、隆鼻術(shù)，應(yīng)用于面部老化處、肢體不對稱、凹陷性瘢痕以及各種原因?qū)е碌慕M織缺損處等。

早期自體脂肪填充手術(shù)效果存在缺陷，填充的脂肪吸收率高，造成自體脂肪數(shù)量減少，填充部位出現(xiàn)感染、液化、壞死、鈣化以及囊腫形成等不良反應(yīng)。coleman技術(shù)誕生后一定程度上提高了移植脂肪的存活率，自體脂肪填充才逐漸廣泛應(yīng)用于臨床，但自體脂肪的吸收率仍較高。脂肪抽脂技術(shù)將獲得的脂肪推注到軟組織損傷部位，即脂肪細(xì)胞移植技術(shù)，但依舊存在移植脂肪低成活率和高吸收率的問題。

雖然自體脂肪細(xì)胞移植備受整形美容外科醫(yī)師的重視，但是到目前仍未成為一種常規(guī)的手術(shù)方法，主要原因?yàn)橐浦埠蟠婊钪就ǔＵ汲跏贾倔w積的40%-50%，而有些報(bào)道脂肪組織最多僅僅存活10%，這使得單純的自體脂肪細(xì)胞注射的應(yīng)用受到限制，脂肪組織吸收并且最終被纖維結(jié)締組織所替代。脂肪細(xì)胞移植成活率低的原因可能有兩點(diǎn)，一是成熟脂肪細(xì)胞對損傷的耐受能力低，不具備增殖更新的能力；二是移植脂肪組織新生血管化速度和程度低，導(dǎo)致移植的脂肪組織缺少血供引起氧和營養(yǎng)的缺乏，從而效果不佳。

多數(shù)研究認(rèn)為脂肪細(xì)胞填充后局部環(huán)境缺氧是影響脂肪成活的最重要因素。自體脂肪填充后初期，脂肪處于缺氧和缺血環(huán)境，通過受體區(qū)周圍組織滲透作用獲得養(yǎng)分；新生毛細(xì)血管形成后，受體區(qū)域血運(yùn)重建，脂肪即可通過血運(yùn)獲得養(yǎng)分。缺氧條件下脂肪細(xì)胞非常敏感，當(dāng)氧分壓過低，超過其耐受閾值時，脂肪細(xì)胞凋亡?？梢姡泽w脂肪填充后成活的關(guān)鍵是早期重建血運(yùn)。如果在植入組織中加入脂肪源性干細(xì)胞，提高其中的干細(xì)胞與脂肪細(xì)胞比例，可使植入組織的整體存活率增加，此即adscs協(xié)助自體脂肪移植術(shù)（cell-assistedlipotransfer，cal）。

現(xiàn)有的脂肪細(xì)胞培養(yǎng)過程中成活率較低，且步驟繁瑣，因此需要研究一種能提高脂肪細(xì)胞移植成活率的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對上述問題，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種提高脂肪細(xì)胞移植成活率的方法。

本發(fā)明的提高脂肪細(xì)胞移植成活率的方法為：步驟一、脂肪干細(xì)胞獲取，1-1、將吸脂來源的脂肪組織放入預(yù)冷含1%雙抗的生理鹽水中，密封，低溫條件下,2-8℃下送回實(shí)驗(yàn)室；1-2、將上述脂肪組織用生理鹽水沖洗，去除殘留的血細(xì)胞和組織碎片，把脂肪組織放入離心管中，記錄原始體積，向組織中加入等體積的消化液，所述的消化液由0.25%胰酶，0.1%i型膠原酶，以1:1比例混合配制而成，放入37℃氣浴振蕩器中消化30min，然后將消化好的組織靜置5min，此時液面分為3層，上層黃色油狀物是破碎的脂肪細(xì)胞釋放的脂滴，中層為大顆粒脂肪細(xì)胞層，間或混合少量纖維，下層為單個核細(xì)胞層；1-3、棄掉上層和中層細(xì)胞，將下層的細(xì)胞懸液以1500r/min，離心10min后棄上清，得到離心管底部的脂肪干細(xì)胞團(tuán)，用非動物源血清l-dmem培養(yǎng)液將其重懸，密度調(diào)整到1×10⁵個/ml，然后接種在培養(yǎng)面積為25cm²的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中；1-4、在37℃下5%的co2條件下培養(yǎng)；1-5、當(dāng)脂肪干細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶后按一傳二進(jìn)行傳代，首先，用生理鹽水沖洗一遍細(xì)胞，然后加入3ml的混合酶溶液，所述的混合酶溶液由0.25%胰酶和0.04%的edta在體積為為1:1情況下配置而成,消化，當(dāng)在顯微鏡下觀察到細(xì)胞發(fā)生明顯的變形，縮成球狀后，立即用等體積的培養(yǎng)基中止消化，并用吸管輕輕吹打瓶底部，確保細(xì)胞完全脫落至懸液中，1000r/min，離心5min，然后，將離心得到的細(xì)胞團(tuán)重懸，調(diào)整密度后按1:2進(jìn)行接種；1-6、在37℃，5%的co2條件下傳代培養(yǎng)；1-7、細(xì)胞凍存，凍存細(xì)胞前在12h內(nèi)進(jìn)行換液，具體步驟與步驟1-5相同，即棄去培養(yǎng)液，生理鹽水洗一遍，加入消化液，待消化完成后，中止消化；輕輕吹打使細(xì)胞懸浮于生理鹽水中，1000r/min，離心5min；棄上清，再用生理鹽水洗一遍，計(jì)數(shù)；最后加入凍存液,所述的凍存液中無血清l-dmem培養(yǎng)液：人血白蛋白：dmso=5:4:1，使得細(xì)胞密度為1×10⁶個/ml左右；分裝至2ml凍存管中，每管1ml-1.5ml；將凍存管放入程序降溫盒內(nèi)，然后放入-80℃冰箱過夜，轉(zhuǎn)至液氮罐內(nèi)長期儲存；1-8、細(xì)胞復(fù)蘇，從液氮中迅速取出凍存管，立即放入37℃恒溫水浴鍋中，并不斷晃動，使其完全溶化；無菌條件下，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含5ml無血清l-dmem培養(yǎng)液離心管中，在1000r/min情況下，離心5min，棄上清；重復(fù)洗一遍；加入適量非動物源血清l-dmem培養(yǎng)液后接種于培養(yǎng)瓶中；37℃、5%co2條件下培養(yǎng)，待用；步驟二、脂肪細(xì)胞獲取，2-1、將吸脂來源的脂肪組織用生理鹽水沖洗，去除殘留的血細(xì)胞和組織碎片，把脂肪組織放入離心管中，記錄原始體積；2-2、向組織中加入等體積的消化液,所述的消化液由0.25%胰酶，0.1%的i型膠原酶，以1:1比例混合配制而成，放入37℃氣浴振蕩器中消化30min，然后將消化好的組織靜置5min，待其分層后，用吸管吸取位于懸液中層的脂肪細(xì)胞，用細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，并將過濾后的細(xì)胞懸液以1000r/min，離心2min后棄掉下層懸液得到脂肪細(xì)胞；2-3、用生理鹽水懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)；步驟三、移植，3-1、在處理脂肪細(xì)胞的同時收獲培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞，計(jì)數(shù)；3-2、將脂肪干細(xì)胞與脂肪細(xì)胞按2:1比例進(jìn)行混合，3-3、將步驟3-2中得到的細(xì)胞懸液進(jìn)行移植到相應(yīng)部位。本發(fā)明的有益效果：脂肪干細(xì)胞的獲取步驟較為簡單，脂肪干細(xì)胞能夠分泌多種生長營養(yǎng)因子，改善組織器官內(nèi)部的微環(huán)境，因此，利用自體脂肪干細(xì)胞與脂肪細(xì)胞共移植無疑可以大大改善脂肪細(xì)胞填充后因缺乏養(yǎng)分而造成的死亡，從而提高脂肪細(xì)胞的移植成活率。

具體實(shí)施方式

本具體實(shí)施方式采用以下技術(shù)方案：所述的提高脂肪細(xì)胞移植成活率的方法為：步驟一、脂肪干細(xì)胞獲取，1-1、將吸脂來源的脂肪組織放入預(yù)冷含1%雙抗的生理鹽水中，密封，低溫條件下,2-8℃下送回實(shí)驗(yàn)室；1-2、將上述脂肪組織用生理鹽水沖洗，去除殘留的血細(xì)胞和組織碎片，把脂肪組織放入離心管中，記錄原始體積，向組織中加入等體積的消化液，所述的消化液由0.25%胰酶，0.1%i型膠原酶，以1:1比例混合配制而成，放入37℃氣浴振蕩器中消化30min，然后將消化好的組織靜置5min，此時液面分為3層，上層黃色油狀物是破碎的脂肪細(xì)胞釋放的脂滴，中層為大顆粒脂肪細(xì)胞層，間或混合少量纖維，下層為單個核細(xì)胞層；1-3、棄掉上層和中層細(xì)胞，將下層的細(xì)胞懸液以1500r/min，離心10min后棄上清，得到離心管底部的脂肪干細(xì)胞團(tuán)，用非動物源血清l-dmem培養(yǎng)液將其重懸，密度調(diào)整到1×10⁵個/ml，然后接種在培養(yǎng)面積為25cm²的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中；1-4、在37℃下5%的co2條件下培養(yǎng)；1-5、當(dāng)脂肪干細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶后按一傳二進(jìn)行傳代，首先，用生理鹽水沖洗一遍細(xì)胞，然后加入3ml的混合酶溶液，所述的混合酶溶液由0.25%胰酶和0.04%的edta在體積為為1:1情況下配置而成,消化，當(dāng)在顯微鏡下觀察到細(xì)胞發(fā)生明顯的變形，縮成球狀后，立即用等體積的培養(yǎng)基中止消化，并用吸管輕輕吹打瓶底部，確保細(xì)胞完全脫落至懸液中，1000r/min，離心5min，然后，將離心得到的細(xì)胞團(tuán)重懸，調(diào)整密度后按1:2進(jìn)行接種；1-6、在37℃，5%的co2條件下傳代培養(yǎng)；1-7、細(xì)胞凍存，凍存細(xì)胞前在12h內(nèi)進(jìn)行換液，具體步驟與步驟1-5相同，即棄去培養(yǎng)液，生理鹽水洗一遍，加入消化液，待消化完成后，中止消化；輕輕吹打使細(xì)胞懸浮于生理鹽水中，1000r/min，離心5min；棄上清，再用生理鹽水洗一遍，計(jì)數(shù)；最后加入凍存液,所述的凍存液中無血清l-dmem培養(yǎng)液：人血白蛋白：dmso=5:4:1，使得細(xì)胞密度為1×10⁶個/ml左右；分裝至2ml凍存管中，每管1ml-1.5ml；將凍存管放入程序降溫盒內(nèi)，然后放入-80℃冰箱過夜，轉(zhuǎn)至液氮罐內(nèi)長期儲存；1-8、細(xì)胞復(fù)蘇，從液氮中迅速取出凍存管，立即放入37℃恒溫水浴鍋中，并不斷晃動，使其完全溶化；無菌條件下，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含5ml無血清l-dmem培養(yǎng)液離心管中，在1000r/min情況下，離心5min，棄上清；重復(fù)洗一遍；加入適量非動物源血清l-dmem培養(yǎng)液后接種于培養(yǎng)瓶中；37℃、5%co2條件下培養(yǎng)，待用；步驟二、脂肪細(xì)胞獲取，2-1、將吸脂來源的脂肪組織用生理鹽水沖洗，去除殘留的血細(xì)胞和組織碎片，把脂肪組織放入離心管中，記錄原始體積；2-2、向組織中加入等體積的消化液,所述的消化液由0.25%胰酶，0.1%的i型膠原酶，以1:1比例混合配制而成，放入37℃氣浴振蕩器中消化30min，然后將消化好的組織靜置5min，待其分層后，用吸管吸取位于懸液中層的脂肪細(xì)胞，用細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，并將過濾后的細(xì)胞懸液以1000r/min，離心2min后棄掉下層懸液得到脂肪細(xì)胞；2-3、用生理鹽水懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)；步驟三、移植，3-1、在處理脂肪細(xì)胞的同時收獲培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞，計(jì)數(shù)；3-2、將脂肪干細(xì)胞與脂肪細(xì)胞按2:1比例進(jìn)行混合，3-3、將步驟3-2中得到的細(xì)胞懸液進(jìn)行移植到相應(yīng)部位。以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。