本發(fā)明屬于化工醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種銀杏葉提純物中內(nèi)酯類成分高純單體的工業(yè)制備方法。

背景技術(shù)：

銀杏，又名白果樹、公孫樹，是我國(guó)特有樹種。銀杏的葉、果、樹皮均可入藥，尤以葉的藥用價(jià)值最高。銀杏葉的化學(xué)成分較為復(fù)雜，其提取物中主要含有黃酮類化合物和萜內(nèi)酯類化合物，具有擴(kuò)張心腦血管、改善微循環(huán)、抑制血小板聚集、抗氧化、清除和抑制氧自由基、延緩衰老、抗病毒、抗菌消炎、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌失調(diào)等生理作用。

銀杏內(nèi)酯屬于萜類化合物，由倍半萜內(nèi)酯和二萜內(nèi)酯組成，是銀杏葉中一類重要的活性成分。銀杏內(nèi)酯分子具有獨(dú)特的十二碳骨架結(jié)構(gòu)，嵌有一個(gè)叔丁基和六個(gè)五元環(huán)，包括一個(gè)螺壬烷，一個(gè)四氫呋喃環(huán)和三個(gè)內(nèi)酯環(huán)。銀杏內(nèi)酯對(duì)血小板活化因子(paf)受體有強(qiáng)大的特異性抑制作用，抗paf活性很強(qiáng)，因此，迄今對(duì)銀杏內(nèi)酯b的藥理作用研究是最為集中的。

銀杏內(nèi)酯的提取及純化方法主要有溶劑萃取法、柱色譜法、溶劑萃取-柱色譜法、超臨界提取法及色譜或柱層析純化等方法，上述各種方法雖然得到了較高純度的銀杏內(nèi)酯單體，但大都工藝路線長(zhǎng)、分離效率低、溶劑消耗大、有毒物質(zhì)銀杏酸存在使產(chǎn)品品質(zhì)受到影響。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種銀杏葉提純物中內(nèi)酯類成分高純單體的工業(yè)制備方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)中銀杏內(nèi)酯的提取及純化方法工藝路線長(zhǎng)、分離效率低、溶劑消耗大、有毒物質(zhì)銀杏酸存在使產(chǎn)品品質(zhì)受到影響的問(wèn)題。

本發(fā)明提供的一種銀杏葉提純物中內(nèi)酯類成分高純單體的工業(yè)制備方法，包括以下步驟：

步驟1，原料的預(yù)處理：取標(biāo)準(zhǔn)銀杏葉提取物，往其中加入相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)銀杏葉提取物重量5～8倍的去離子水，于40～70℃下攪拌至標(biāo)準(zhǔn)銀杏葉提取物完全溶解，然后往其中加入濃度為10％的稀鹽酸，調(diào)節(jié)體系ph為4～6，得到預(yù)處理銀杏葉提取物；

步驟2，高速逆流萃取：將預(yù)處理銀杏葉提取物抽入萃取塔內(nèi)，然后按照預(yù)處理銀杏葉提取物與萃取溶劑體積比為1：1.5～3.0比例往萃取塔內(nèi)均勻?qū)胼腿∪軇┻M(jìn)行循環(huán)高速逆流萃取，控制萃取溫度為40～60℃，循環(huán)萃取3～5次后，得到萃取液，將萃取液濃縮、干燥、粉碎后，得到銀杏總內(nèi)酯粗品；

其中，所述萃取溶劑由乙酸乙酯與二氯甲烷按照80：20的體積比混合配制而成；

步驟3，減壓液相色譜分離：將銀杏總內(nèi)酯粗品與乙醇按照1g：3～5ml的比例混合、溶解，得到銀杏總內(nèi)酯粗品的乙醇溶液，往銀杏總內(nèi)酯粗品的乙醇溶液中加入相當(dāng)于銀杏總內(nèi)酯粗品重量1.5～2倍的硅膠拌樣，同時(shí)用相當(dāng)于銀杏總內(nèi)酯粗品重量20～30倍的硅膠濕法裝柱，徑高比為1：4～6，裝柱完畢后，控制柱壓為-0.3～-0.1mpa，上樣，進(jìn)行硅膠柱層析，并用石油醚和乙酸乙酯的混合溶液作為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，收集各梯度餾分，所得各餾分通過(guò)薄層色譜檢測(cè)后，合并相同餾分，并將合并后的各相同餾分分別濃縮、干燥，得各餾分內(nèi)酯粗品；

步驟4，高效制備液相色譜分離：將各餾分內(nèi)酯粗品和甲醇均按照1g：10ml的比例混合、溶解后過(guò)0.45μm的濾膜，分別得到各餾分內(nèi)酯粗品的甲醇溶液，將各餾分內(nèi)酯粗品的甲醇溶液分別注入到高效制備液相色譜儀中，采用甲醇水混合溶液洗脫，洗脫過(guò)程中收集單一組分，并將各單一組分分別濃縮、結(jié)晶、真空干燥，得到各組分內(nèi)酯單體；

步驟5，溶劑重結(jié)晶：將各組分內(nèi)酯單體和丙酮均按照1g：3ml的比例進(jìn)行重結(jié)晶，得到第一次重結(jié)晶產(chǎn)物，將第一次重結(jié)晶產(chǎn)物與濃度為98％的乙醇按照1g：3ml的比例進(jìn)行第二次重結(jié)晶，得到各組分內(nèi)酯高純單體；

其中，所述各組分內(nèi)酯高純單體分別為銀杏內(nèi)酯a、銀杏內(nèi)酯b、銀杏內(nèi)酯c、銀杏內(nèi)酯j、銀杏內(nèi)酯m和白果內(nèi)酯的高純單體。

優(yōu)選的，所述標(biāo)準(zhǔn)銀杏葉提取物中總黃酮含量≥24％，總內(nèi)酯含量≥6％，總銀杏酸含量≤10ppm。

優(yōu)選的，所述步驟3中所用硅膠的規(guī)格為200～300目。

優(yōu)選的，所述步驟3中石油醚與乙酸乙酯分別按照體積比為10：3、10：4、10：5、10：6、10：7以及0：1的梯度進(jìn)行洗脫。

優(yōu)選的，所述步驟4中用來(lái)洗脫的甲醇水混合溶液中甲醇和水的體積比為60：40或70：30。

優(yōu)選的，所述步驟4各單一組分分別濃縮至固液比1：3～5后再降溫至3～6℃進(jìn)行結(jié)晶。

優(yōu)選的，所述步驟5中第一次重結(jié)晶以及第二次重結(jié)晶的溫度均為3～6℃。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明采用溶解、高速逆流萃取、減壓液相色譜分離、高效制備液相色譜分離和溶劑重結(jié)晶組合工藝，對(duì)銀杏葉提取物中內(nèi)酯類成分進(jìn)行分離，獲得銀杏內(nèi)酯a、銀杏內(nèi)酯b、銀杏內(nèi)酯c、銀杏內(nèi)酯j、銀杏內(nèi)酯m和白果內(nèi)酯的高純單體，高效液相色譜法檢測(cè)其純度均可達(dá)99％以上，此外，本發(fā)明的工藝路線短、分離效率高、溶劑消耗少、避免了有毒物質(zhì)銀杏酸對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)的影響，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

具體實(shí)施方式

為了使本領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案能予以實(shí)施，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但所舉實(shí)施例不作為對(duì)本發(fā)明的限定。

本發(fā)明各實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

實(shí)施例1

一種銀杏葉提純物中內(nèi)酯類成分高純單體的工業(yè)制備方法，包括以下步驟：

步驟1，原料的預(yù)處理：取標(biāo)準(zhǔn)銀杏葉提取物1.0kg(采用現(xiàn)有技術(shù)制備的符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的銀杏提取物均可以)，總內(nèi)酯含量為7.12％(含總內(nèi)酯約71.2g)，往其中加入5.0l去離子水，于70℃下攪拌至標(biāo)準(zhǔn)銀杏葉提取物完全溶解，然后往其中加入濃度為10％的稀鹽酸，調(diào)節(jié)體系ph為4，得到預(yù)處理銀杏葉提取物；

步驟2，高速逆流萃?。簩㈩A(yù)處理銀杏葉提取物抽入萃取塔內(nèi)，再往萃取塔內(nèi)均勻?qū)?.5l萃取溶劑進(jìn)行循環(huán)高速逆流萃取，控制萃取溫度為40℃，循環(huán)萃取3次后，得到萃取液，將萃取液60℃減壓濃縮、干燥、粉碎后，得到61.52g銀杏總內(nèi)酯粗品；

其中，萃取溶劑由乙酸乙酯與二氯甲烷按照80：20的體積比混合配制而成；

步驟3，減壓液相色譜分離：將61.52g銀杏總內(nèi)酯粗品用300ml乙醇溶解，得到銀杏總內(nèi)酯粗品的乙醇溶液，往銀杏總內(nèi)酯粗品的乙醇溶液中加入100g規(guī)格為200目的硅膠拌樣，得到樣品的硅膠拌樣，將樣品的硅膠拌樣減壓濃縮至干后備用；

取1230g規(guī)格為200目的硅膠，105℃干燥1h，濕法裝柱，徑高比1：5.3，裝柱完畢后，控制柱壓為-0.1mpa，上樣，進(jìn)行硅膠柱層析，然后用石油醚和乙酸乙酯的混合溶液作為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，并按照石油醚與乙酸乙酯的體積比分別為10：3、10：4、10：5、10：6、10：7以及0：1的梯度進(jìn)行洗脫，每種梯度的洗脫液均為5.0l，每500ml為1個(gè)梯度餾分進(jìn)行收集，所得各餾分通過(guò)薄層色譜檢測(cè)后，合并相同餾分，并將合并后的各相同餾分分別濃縮、干燥，得各餾分內(nèi)酯粗品；

步驟4，高效制備液相色譜分離：將各餾分內(nèi)酯粗品和甲醇均按照1g：10ml的比例混合、溶解后過(guò)0.45μm的濾膜，分別得到各餾分內(nèi)酯粗品的甲醇溶液，將各餾分內(nèi)酯粗品的甲醇溶液分別注入到高效制備液相色譜儀中，采用甲醇與水的體積比為70：30的甲醇水混合溶液進(jìn)行洗脫，洗脫過(guò)程中收集單一組分，并將各單一組分分別濃縮至固液比為1：3后于3℃下結(jié)晶，母液濃縮濃縮至1/2體積后降溫至3℃結(jié)晶2次，合并所有晶體，真空干燥，得到各組分內(nèi)酯單體；

步驟5，溶劑重結(jié)晶：將各組分內(nèi)酯單體和丙酮均按照1g：3ml的比例進(jìn)行重結(jié)晶，得到第一次重結(jié)晶產(chǎn)物，將第一次重結(jié)晶產(chǎn)物與濃度為98％的乙醇按照1g：3ml的比例進(jìn)行第二次重結(jié)晶，收集兩次重結(jié)晶的母液，將其濃縮至1/2體積后降溫至4℃結(jié)晶2次，抽濾，合并所有晶體并真空冷凍干燥，最后得到3.45g銀杏內(nèi)酯a，純度為99.37％；得到12.65g銀杏內(nèi)酯b，純度為99.21％；得到14.84g銀杏內(nèi)酯c，純度為99.18％；得到7.02g白果內(nèi)酯，純度為99.36％；得到0.84g銀杏內(nèi)酯j，純度為99.12％；得到0.32g銀杏內(nèi)酯m，純度為99.19％。

實(shí)施例2

一種銀杏葉提純物中內(nèi)酯類成分高純單體的工業(yè)制備方法，包括以下步驟：

步驟1，原料的預(yù)處理：取標(biāo)準(zhǔn)銀杏葉提取物1.2kg，總內(nèi)酯含量為7.12％(含總內(nèi)酯約85.44g)，往其中加入7.2l去離子水，于60℃下攪拌至標(biāo)準(zhǔn)銀杏葉提取物完全溶解，然后往其中加入濃度為10％的稀鹽酸，調(diào)節(jié)體系ph為4.5，得到預(yù)處理銀杏葉提取物；

步驟2，高速逆流萃?。簩㈩A(yù)處理銀杏葉提取物抽入萃取塔內(nèi)，再往萃取塔內(nèi)均勻?qū)?4.4l萃取溶劑進(jìn)行循環(huán)高速逆流萃取，控制萃取溫度為45℃，循環(huán)萃取4次后，得到萃取液，將萃取液65℃減壓濃縮、干燥、粉碎后，得到70.58g銀杏總內(nèi)酯粗品；

其中，萃取溶劑由乙酸乙酯與二氯甲烷按照80：20的體積比混合配制而成；

步驟3，減壓液相色譜分離：將70.58g銀杏總內(nèi)酯粗品用300ml乙醇溶解，得到銀杏總內(nèi)酯粗品的乙醇溶液，往銀杏總內(nèi)酯粗品的乙醇溶液中加入120g規(guī)格為250目的硅膠拌樣，得到樣品的硅膠拌樣，將樣品的硅膠拌樣減壓濃縮至干后備用；

取1552g規(guī)格為250目的硅膠，105℃干燥1h，濕法裝柱，徑高比1：4.5，裝柱完畢后，控制柱壓為-0.15mpa，上樣，進(jìn)行硅膠柱層析，然后用石油醚和乙酸乙酯的混合溶液作為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，并按照石油醚與乙酸乙酯的體積比分別為10：3、10：4、10：5、10：6、10：7以及0：1的梯度進(jìn)行洗脫，每種梯度的洗脫液均為6.0l，每500ml為1個(gè)梯度餾分進(jìn)行收集，所得各餾分通過(guò)薄層色譜檢測(cè)后，合并相同餾分，并將合并后的各相同餾分分別濃縮、干燥，得各餾分內(nèi)酯粗品；

步驟4，高效制備液相色譜分離：將各餾分內(nèi)酯粗品和甲醇均按照1g：10ml的比例混合、溶解后過(guò)0.45μm的濾膜，分別得到各餾分內(nèi)酯粗品的甲醇溶液，將各餾分內(nèi)酯粗品的甲醇溶液分別注入到高效制備液相色譜儀中，采用甲醇與水的體積比為70：30的甲醇水混合溶液進(jìn)行洗脫，洗脫過(guò)程中收集單一組分，并將各單一組分分別濃縮至固液比為1：3.5后于4℃下結(jié)晶，母液濃縮濃縮至1/2體積后降溫至4℃結(jié)晶2次，合并所有晶體，真空干燥，得到各組分內(nèi)酯單體；

步驟5，溶劑重結(jié)晶：將各組分內(nèi)酯單體和丙酮均按照1g：3.5ml的比例進(jìn)行重結(jié)晶，得到第一次重結(jié)晶產(chǎn)物，將第一次重結(jié)晶產(chǎn)物與濃度為98％的乙醇按照1g：3.5ml的比例進(jìn)行第二次重結(jié)晶，收集兩次重結(jié)晶的母液，將其濃縮至1/2體積后降溫至4℃結(jié)晶2次，抽濾，合并所有晶體并真空冷凍干燥，最后得到4.18g銀杏內(nèi)酯a，純度為99.15％；得到15.34g銀杏內(nèi)酯b，純度為99.34％；得到17.26g銀杏內(nèi)酯c，純度為99.57％；得到8.39g白果內(nèi)酯，純度為99.13％；得到0.96g銀杏內(nèi)酯j，純度為99.45％；得到0.41g銀杏內(nèi)酯m，純度為99.08％。

實(shí)施例3

一種銀杏葉提純物中內(nèi)酯類成分高純單體的工業(yè)制備方法，包括以下步驟：

步驟1，原料的預(yù)處理：取標(biāo)準(zhǔn)銀杏葉提取物1.5kg，總內(nèi)酯含量為7.12％(含總內(nèi)酯約106.8g)，往其中加入10.5l去離子水，于50℃下攪拌至標(biāo)準(zhǔn)銀杏葉提取物完全溶解，然后往其中加入濃度為10％的稀鹽酸，調(diào)節(jié)體系ph為5.0，得到預(yù)處理銀杏葉提取物；

步驟2，高速逆流萃?。簩㈩A(yù)處理銀杏葉提取物抽入萃取塔內(nèi)，再往萃取塔內(nèi)均勻?qū)?6.25l萃取溶劑進(jìn)行循環(huán)高速逆流萃取，控制萃取溫度為50℃，循環(huán)萃取5次后，得到萃取液，將萃取液70℃減壓濃縮、干燥、粉碎后，得到88.32g銀杏總內(nèi)酯粗品；

其中，萃取溶劑由乙酸乙酯與二氯甲烷按照80：20的體積比混合配制而成；

步驟3，減壓液相色譜分離：將88.32g銀杏總內(nèi)酯粗品用350ml乙醇溶解，得到銀杏總內(nèi)酯粗品的乙醇溶液，往銀杏總內(nèi)酯粗品的乙醇溶液中加入150g規(guī)格為250目的硅膠拌樣，得到樣品的硅膠拌樣，將樣品的硅膠拌樣減壓濃縮至干后備用；

取2208g規(guī)格為250目的硅膠，105℃干燥1h，濕法裝柱，徑高比1：5.7，裝柱完畢后，控制柱壓為-0.2mpa，上樣，進(jìn)行硅膠柱層析，然后用石油醚和乙酸乙酯的混合溶液作為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，并按照石油醚與乙酸乙酯體積比分別為10：3、10：4、10：5、10：6、10：7以及0：1的梯度進(jìn)行洗脫，每種梯度的洗脫液均為7.2l，每600ml為1個(gè)梯度餾分進(jìn)行收集，所得各餾分通過(guò)薄層色譜檢測(cè)后，合并相同餾分，并將合并后的各相同餾分分別濃縮、干燥，得各餾分內(nèi)酯粗品；

步驟4，高效制備液相色譜分離：將各餾分內(nèi)酯粗品和甲醇均按照1g：10ml的比例混合、溶解后過(guò)0.45μm的濾膜，分別得到各餾分內(nèi)酯粗品的甲醇溶液，將各餾分內(nèi)酯粗品的甲醇溶液分別注入到高效制備液相色譜儀中，采用甲醇與水的體積比為60：40的甲醇水混合溶液進(jìn)行洗脫，洗脫過(guò)程中收集單一組分，并將各單一組分分別濃縮至固液比為1：4后于4℃下結(jié)晶，母液濃縮濃縮至1/2體積后降溫至4℃結(jié)晶2次，合并所有晶體，真空干燥，得到各組分內(nèi)酯單體；

步驟5，溶劑重結(jié)晶：將各組分內(nèi)酯單體和丙酮均按照1g：4ml的比例進(jìn)行重結(jié)晶，得到第一次重結(jié)晶產(chǎn)物，將第一次重結(jié)晶產(chǎn)物與濃度為98％的乙醇按照1g：4ml的比例進(jìn)行第二次重結(jié)晶，收集兩次重結(jié)晶的母液，將其濃縮至1/2體積后降溫至4℃結(jié)晶2次，抽濾，合并所有晶體并真空冷凍干燥，最后得到5.26g銀杏內(nèi)酯a，純度為99.26％；得到19.13g銀杏內(nèi)酯b，純度為99.30％；得到21.38g銀杏內(nèi)酯c，純度為99.28％；得到9.89g白果內(nèi)酯，純度為99.08％；得到1.17g銀杏內(nèi)酯j，純度為99.41％；得到0.51g銀杏內(nèi)酯m，純度為99.21％。

實(shí)施例4

一種銀杏葉提純物中內(nèi)酯類成分高純單體的工業(yè)制備方法，包括以下步驟：

步驟1，原料的預(yù)處理：取標(biāo)準(zhǔn)銀杏葉提取物2.0kg，總內(nèi)酯含量為7.12％(含總內(nèi)酯約142.4g)，往其中加入16.0l去離子水，于40℃下攪拌至標(biāo)準(zhǔn)銀杏葉提取物完全溶解，然后往其中加入濃度為10％的稀鹽酸，調(diào)節(jié)體系ph為5.5，得到預(yù)處理銀杏葉提取物；

步驟2，高速逆流萃?。簩㈩A(yù)處理銀杏葉提取物抽入萃取塔內(nèi)，再往萃取塔內(nèi)均勻?qū)?8l萃取溶劑進(jìn)行循環(huán)高速逆流萃取，控制萃取溫度為55℃，循環(huán)萃取5次后，得到萃取液，將萃取液75℃減壓濃縮、干燥、粉碎后，得到112.68g銀杏總內(nèi)酯粗品；

其中，萃取溶劑由乙酸乙酯與二氯甲烷按照80：20的體積比混合配制而成；

步驟3，減壓液相色譜分離：將112.68g銀杏總內(nèi)酯粗品用500ml乙醇溶解，得到銀杏總內(nèi)酯粗品的乙醇溶液，往銀杏總內(nèi)酯粗品的乙醇溶液中加入200g規(guī)格為300目的硅膠拌樣，得到樣品的硅膠拌樣，將樣品的硅膠拌樣減壓濃縮至干后備用；

取3155g規(guī)格為300目的硅膠，105℃干燥1h，濕法裝柱，徑高比1：5.2，裝柱完畢后，控制柱壓為-0.25mpa，上樣，進(jìn)行硅膠柱層析，然后用石油醚和乙酸乙酯的混合溶液作為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，并按照石油醚與乙酸乙酯體積比分別為10：3、10：4、10：5、10：6、10：7以及0：1的梯度進(jìn)行洗脫，每種梯度的洗脫液均為9.6l，每800ml為1個(gè)梯度餾分進(jìn)行收集，所得各餾分通過(guò)薄層色譜檢測(cè)后，合并相同餾分，并將合并后的各相同餾分分別濃縮、干燥，得各餾分內(nèi)酯粗品；

步驟4，高效制備液相色譜分離：將各餾分內(nèi)酯粗品和甲醇均按照1g：10ml的比例混合、溶解后過(guò)0.45μm的濾膜，分別得到各餾分內(nèi)酯粗品的甲醇溶液，將各餾分內(nèi)酯粗品的甲醇溶液分別注入到高效制備液相色譜儀中，采用甲醇與水的體積比為60：40的甲醇水混合溶液進(jìn)行洗脫，洗脫過(guò)程中收集單一組分，并將各單一組分分別濃縮至固液比為1：5后于5℃下結(jié)晶，母液濃縮濃縮至1/2體積后降溫至5℃結(jié)晶2次，合并所有晶體，真空干燥，得到各組分內(nèi)酯單體；

步驟5，溶劑重結(jié)晶：將各組分內(nèi)酯單體和丙酮均按照1g：5ml的比例進(jìn)行重結(jié)晶，得到第一次重結(jié)晶產(chǎn)物，將第一次重結(jié)晶產(chǎn)物與濃度為98％的乙醇按照1g：5ml的比例進(jìn)行第二次重結(jié)晶，收集兩次重結(jié)晶的母液，將其濃縮至1/2體積后降溫至5℃結(jié)晶2次，抽濾，合并所有晶體并真空冷凍干燥，最后得到6.89g銀杏內(nèi)酯a，純度為99.38％；得到26.37g銀杏內(nèi)酯b，純度為99.12％；得到31.23g銀杏內(nèi)酯c，純度為99.19％；得到13.59g白果內(nèi)酯，純度為99.28％；得到1.62g銀杏內(nèi)酯j，純度為99.16％；得到0.62g銀杏內(nèi)酯m，純度為99.18％。

實(shí)施例5

一種銀杏葉提純物中內(nèi)酯類成分高純單體的工業(yè)制備方法，包括以下步驟：

步驟1，原料的預(yù)處理：取標(biāo)準(zhǔn)銀杏葉提取物2.5kg，總內(nèi)酯含量為7.12％(含總內(nèi)酯約178.0g)，往其中加入15.0l去離子水，于55℃下攪拌至標(biāo)準(zhǔn)銀杏葉提取物完全溶解，然后往其中加入濃度為10％的稀鹽酸，調(diào)節(jié)體系ph為6.0，得到預(yù)處理銀杏葉提取物；

步驟2，高速逆流萃?。簩㈩A(yù)處理銀杏葉提取物抽入萃取塔內(nèi)，再往萃取塔內(nèi)均勻?qū)?7.5l萃取溶劑進(jìn)行循環(huán)高速逆流萃取，控制萃取溫度為50℃，循環(huán)萃取4次后，得到萃取液，將萃取液70℃減壓濃縮、干燥、粉碎后，得到145.96g銀杏總內(nèi)酯粗品；

其中，萃取溶劑由乙酸乙酯與二氯甲烷按照80：20的體積比混合配制而成；

步驟3，減壓液相色譜分離：將145.96g銀杏總內(nèi)酯粗品用600ml乙醇溶解，得到銀杏總內(nèi)酯粗品的乙醇溶液，往銀杏總內(nèi)酯粗品的乙醇溶液中加入250g規(guī)格為300目的硅膠拌樣，得到樣品的硅膠拌樣，將樣品的硅膠拌樣減壓濃縮至干后備用；

取4379g規(guī)格為300目的硅膠，105℃干燥1h，濕法裝柱，徑高比1：6.5，裝柱完畢后，控制柱壓為-0.30mpa，上樣，進(jìn)行硅膠柱層析，然后用石油醚和乙酸乙酯的混合溶液作為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，并按照石油醚與乙酸乙酯體積比分別為10：3、10：4、10：5、10：6、10：7以及0：1的梯度進(jìn)行洗脫，每種梯度的洗脫液均為10.8l，每900ml為1個(gè)梯度餾分進(jìn)行收集，所得各餾分通過(guò)薄層色譜檢測(cè)后，合并相同餾分，并將合并后的各相同餾分分別濃縮、干燥，得各餾分內(nèi)酯粗品；

步驟4，高效制備液相色譜分離：將各餾分內(nèi)酯粗品和甲醇均按照1g：10ml的比例混合、溶解后過(guò)0.45μm的濾膜，分別得到各餾分內(nèi)酯粗品的甲醇溶液，將各餾分內(nèi)酯粗品的甲醇溶液分別注入到高效制備液相色譜儀中，采用甲醇與水的體積比為60：40的甲醇水混合溶液進(jìn)行洗脫，洗脫過(guò)程中收集單一組分，并將各單一組分分別濃縮至固液比為1：5后于6℃下結(jié)晶，母液濃縮濃縮至1/2體積后降溫至6℃結(jié)晶2次，合并所有晶體，真空干燥，得到各組分內(nèi)酯單體；

步驟5，溶劑重結(jié)晶：將各組分內(nèi)酯單體和丙酮均按照1g：5ml的比例進(jìn)行重結(jié)晶，得到第一次重結(jié)晶產(chǎn)物，將第一次重結(jié)晶產(chǎn)物與濃度為98％的乙醇按照1g：5ml的比例進(jìn)行第二次重結(jié)晶，收集兩次重結(jié)晶的母液，將其濃縮至1/2體積后降溫至6℃結(jié)晶2次，抽濾，合并所有晶體并真空冷凍干燥，最后得到8.46g銀杏內(nèi)酯a，純度為99.26％；得到30.13g銀杏內(nèi)酯b，純度為99.27％；得到35.58g銀杏內(nèi)酯c，純度為99.20％；得到16.21g白果內(nèi)酯，純度為99.04％；得到1.96g銀杏內(nèi)酯j，純度為99.38％；得到0.69g銀杏內(nèi)酯m，純度為99.22％。

本發(fā)明中采用了減壓液相色譜對(duì)銀杏葉提純物中內(nèi)酯類成分進(jìn)行了分離，減壓柱色譜分離可以加快層析速度，縮短洗脫時(shí)間，同時(shí)在完成一個(gè)溶劑梯度展開，抽干后還可用另一梯度溶液再次對(duì)其展開，有效的防止了各餾分之間的相互交叉和影響，極大的提高了分離效率，從而使同時(shí)分離出銀杏葉提純物中6種內(nèi)酯類成分成為可能。此外，相比于常規(guī)的常壓柱色譜和快速柱色譜分離而言，設(shè)備簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、分離速度快、分辨率高、分離容量大、溶劑消耗少。

高效制備液相色譜分離方法采用了高柱效制備型色譜柱，由于高柱效制備型色譜柱中采用了顆粒度較小的吸附劑，使其具有更高的分離因子，因此能夠完成難度很大的分離工作，并且分離效率高，對(duì)各種化合物均具有較好的分離效果，分離容量也大，直徑為5cm的色譜柱即可實(shí)現(xiàn)克級(jí)樣品的在線分離、檢測(cè)和制備收集。

需要說(shuō)明的是，本發(fā)明權(quán)利要求書中涉及數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解為每個(gè)數(shù)值范圍的兩個(gè)端點(diǎn)以及兩個(gè)端點(diǎn)之間任何一個(gè)數(shù)值均可選用，由于采用的步驟方法與實(shí)施例1-5相同，為了防止贅述，本發(fā)明的描述了優(yōu)選的實(shí)施例，但本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員一旦得知了基本創(chuàng)造性概念，則可對(duì)這些實(shí)施例作出另外的變更和修改。所以，所附權(quán)利要求意欲解釋為包括優(yōu)選實(shí)施例以及落入本發(fā)明范圍的所有變更和修改。

顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改動(dòng)和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動(dòng)和變型在內(nèi)。