本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中，一種制備水稻濕度敏感型雄性不育材料的方法及相關(guān)基因。

背景技術(shù)：

水稻作為全球百分之五十以上人口的主食，其產(chǎn)量和品質(zhì)一直備受關(guān)注。雜交水稻育種技術(shù)作為提高水稻產(chǎn)量和品質(zhì)的重要手段，一直是眾多科學(xué)家關(guān)注并追蹤的熱點和重點。1964年，我國科學(xué)家袁隆平在洞庭早秈中發(fā)現(xiàn)了“天然雄性不育株”，通過對水稻雄性不育的研究，提出了選育水稻雄性不育系、雄性不育保持系、雄性不育恢復(fù)系的三系法途徑，實現(xiàn)了水稻雜種優(yōu)勢的利用。1973年，石明松在晚粳農(nóng)墾58中選育到光敏核雄性不育材料“農(nóng)墾58s”，提出了利用自然兩用系的設(shè)想，從而解決了粳稻自然不育株的不育特性難以保持的難題，同時也拉開了我國兩系法雜交水稻育種的序幕。此后，在秈稻中又發(fā)現(xiàn)了溫敏雄性不育材料，進一步完善了兩系法雜交水稻育種技術(shù)。兩系法雜交水稻育種較傳統(tǒng)的三系法雜交水稻育種具有簡化雜交育種和制種程序、降低種子成本、配組自由、無不育細胞質(zhì)負效應(yīng)、易轉(zhuǎn)育新不育系等優(yōu)點。然而，基于光溫敏核不育的兩系法雜交水稻育種技術(shù)易受光溫條件所左右，導(dǎo)致育種失敗，因此，急需加強和完善兩系法雜交水稻的制種技術(shù)，新的條件型不育材料的發(fā)現(xiàn)也許能為兩系法雜交水稻育種技術(shù)帶來新的突破。

植物生長發(fā)育不僅需要光照和溫度，還需要適宜的濕度。目前，濕度敏感型雄性不育現(xiàn)象僅在擬南芥中有詳細報道，preuss等發(fā)現(xiàn)擬南芥雄性不育突變體pop1的花粉粒在人工培養(yǎng)箱里能夠正常萌發(fā)，但是在柱頭上卻不能與柱頭發(fā)生水合作用，導(dǎo)致其不能萌發(fā)。然而，在高濕度環(huán)境中，pop1的花粉卻能夠從環(huán)境中吸收水分并恢復(fù)活性，進而與柱頭發(fā)生粘附并萌發(fā)出花粉管。ishiguro等發(fā)現(xiàn)了一個t-dna插入突變體flakypollen1-1(fkp1-1)花粉粒很少粘附柱頭，也表現(xiàn)為濕度敏感型雄性不育的表型。

目前關(guān)于水稻濕度敏感型雄性不育的報道僅見于本發(fā)明的發(fā)明人在中國專利號為cn201280006361.6的專利中，公開了水稻的ososc8基因的功能缺失突變體具有濕度敏感型雄性不育的特性，具體的分子機制還有待于進一步研究。

糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyltransferases,gt；ec2.4.x.y)幾乎存在于所有活的有機體中，催化糖基的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，將糖基從活化的供體分子轉(zhuǎn)移到受體分子上，是最重要的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)之一。udp-糖基轉(zhuǎn)移酶(ugt)作為糖基轉(zhuǎn)移酶家族中最大的超家族，參與了一系列生理生化反應(yīng)，具有重要的生物學(xué)功能。udp-糖基轉(zhuǎn)移酶通過糖基化生長素、細胞分裂素、脫落酸、赤霉素、油菜素內(nèi)酯、水楊酸等植物激素，降低甚至完全消除它們的生物活性，進而影響植物的生長發(fā)育和對逆境條件的響應(yīng)。通過對細胞內(nèi)內(nèi)源和外源毒素的糖基化，有助于毒素由胞內(nèi)向胞外或生物體外的轉(zhuǎn)運，從而減小或消除毒素對細胞的毒害作用。糖基化還可以改變小分子化合物的食品風(fēng)味以及在植物細胞內(nèi)的溶解性、穩(wěn)定性和揮發(fā)性等分子特性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何制備濕度敏感型雄性不育水稻。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了制備濕度敏感型不育植物的方法。

本發(fā)明提供的制備濕度敏感型不育植物的方法，包括：降低目的植物中蛋白質(zhì)的活性、降低目的植物中所述蛋白質(zhì)的含量、抑制目的植物中所述蛋白質(zhì)的編碼基因的表達或敲除目的植物中所述蛋白質(zhì)的編碼基因，得到濕度敏感型不育植物；

所述蛋白質(zhì)的名稱為osugt蛋白質(zhì)，是如下a1)或a2)：

a1)氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白質(zhì)；

a2)將序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白質(zhì)。

上述a2)中的osugt蛋白質(zhì)，所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。

上述方法可通過crispr/cas9系統(tǒng)對所述蛋白質(zhì)的編碼基因進行定點突變實現(xiàn)。

上述方法中，所述蛋白質(zhì)的編碼基因可為如下b1)-b4)中任一種：

b1)其編碼序列是序列表中序列1的cdna分子或dna分子；

b2)其編碼序列是序列表中序列3的cdna分子或dna分子；

b3)與b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼osugt蛋白質(zhì)的cdna分子或基因組dna分子；

b4)在嚴(yán)格條件下與b1)或b2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼osugt蛋白質(zhì)的cdna分子或基因組dna分子。

這里使用的術(shù)語“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括與本發(fā)明的編碼序列2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計算機軟件進行評價。使用計算機軟件，兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來評價相關(guān)序列之間的同一性。

所述嚴(yán)格條件是在2×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×sspe(或0.1×ssc)、0.1％sds的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可為80％、85％、90％或95％以上的同一性。

所述crispr/cas9系統(tǒng)中使用的osugt蛋白質(zhì)的編碼基因的靶序列可為靶序列1、靶序列2或靶序列3；

所述靶序列1為如下h1)、h2)或h3)：

h1)序列表中序列1的第1-20位的核苷酸序列；

h2)與h1)限定的dna序列具有75％或75％以上同一性的由h1)衍生的dna序列；

h3)在嚴(yán)格條件下與h1)限定的dna序列雜交的由h1)衍生的dna序列；

所述靶序列2為如下i1)、i2)或i3)：

i1)序列表中序列1的第266-285位的核苷酸序列；

i2)與i1)限定的dna序列具有75％或75％以上同一性的由i1)衍生的dna序列；

i3)在嚴(yán)格條件下與i1)限定的dna序列雜交的由i1)衍生的dna序列；

所述靶序列3為如下j1)、j2)或j3)：

j1)序列表中序列1的第342-361位的核苷酸序列；

j2)與j1)限定的dna序列具有75％或75％以上同一性的由j1)衍生的dna序列；

j3)在嚴(yán)格條件下與j1)限定的dna序列雜交的由j1)衍生的dna序列。

上述方法可通過向所述目的植物中導(dǎo)入靶向所述靶序列1、所述靶序列2或所述靶序列3的sgrna的編碼基因與cas9的編碼基因，得到濕度敏感型不育植物。

上述方法中，所述sgrna的編碼基因可通過向所述目的植物中導(dǎo)入含有所述sgrna的編碼基因的重組載體實現(xiàn)。

所述載體可含有編碼所述sgrna中除間隔序列(spacer)外的其他序列的dna片段。編碼所述間隔序列的dna可為所述靶序列1、所述靶序列2或所述靶序列3。

所述載體具體可為pos-sgrna載體。

所述重組載體具體可為pos-sgrna-osugt-spacer1、pos-sgrna-osugt-spacer2或pos-sgrna-osugt-spacer3，所述pos-sgrna-osugt-spacer1、所述pos-sgrna-osugt-spacer2和所述pos-sgrna-osugt-spacer3分別為向pos-sgrna載體的bsai的識別序列間插入所述靶序列1、所述靶序列2和所述靶序列3得到的重組載體，所述pos-sgrna-osugt-spacer1、所述pos-sgrna-osugt-spacer2和所述pos-sgrna-osugt-spacer3分別表達sgrna1、sgrna2和sgrna3，所述sgrna1含有所述靶序列1編碼的rna序列，所述sgrna2含有所述靶序列2編碼的rna序列，所述sgrna3含有所述靶序列3編碼的rna序列。

上述方法中，所述cas9的編碼基因可通過向所述目的植物中導(dǎo)入含有所述cas9的編碼基因的重組載體實現(xiàn)。

上述方法中，所述sgrna的編碼基因和所述cas9的編碼基因也可通過向所述目的植物中導(dǎo)入含有所述sgrna的編碼基因和所述cas9的編碼基因的重組載體實現(xiàn)。所述重組載體具體可為ph-ubi-cas9-osugt-spacer1、ph-ubi-cas9-osugt-spacer2和ph-ubi-cas9-osugt-spacer3，所述ph-ubi-cas9-osugt-spacer1、所述ph-ubi-cas9-osugt-spacer2和所述ph-ubi-cas9-osugt-spacer3分別為將所述pos-sgrna-osugt-spacer1、所述pos-sgrna-osugt-spacer2和所述pos-sgrna-osugt-spacer3與表達載體ph-ubi-cas9進行l(wèi)r反應(yīng)得到的重組載體。所述ph-ubi-cas9-osugt-spacer1表達cas9和所述sgrna1，所述ph-ubi-cas9-osugt-spacer2表達cas9和所述sgrna2，所述ph-ubi-cas9-osugt-spacer3表達cas9和所述sgrna3。

上述方法中，所述濕度敏感型不育植物可為濕度敏感型雄性不育植物。所述濕度敏感型雄性不育植物可為濕度敏感型花粉不育植物。

所述濕度敏感型不育植物花粉的失水速率高于所述目的植物花粉的失水速率。所述失水速率可為在60％≥rh≥30％下，具體可為在rh＜30％的濕度條件下的失水速率。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了制備濕度不敏感育性植物方法。

本發(fā)明提供的制備濕度不敏感育性植物方法，包括增加受體植物中osugt蛋白質(zhì)的活性、增加受體植物中osugt蛋白質(zhì)的含量或促進受體植物中osugt蛋白質(zhì)的編碼基因的表達，得到濕度不敏感育性植物；

所述受體植物為濕度敏感型不育植物。

上述制備濕度不敏感育性植物方法中，所述增加受體植物中osugt蛋白質(zhì)的含量可通過向所述受體植物中導(dǎo)入osugt蛋白質(zhì)的編碼基因?qū)崿F(xiàn)。

上述方法中，所述osugt蛋白質(zhì)的編碼基因可通過向所述受體植物中導(dǎo)入含有所述osugt蛋白質(zhì)的編碼基因的重組載體實現(xiàn)。

所述載體可為pcambia1301或pu1301。pu1301為將pcambia1301的hindiii和bamhi識別序列間的dna片段替換為序列5的第7-2016位所示的ubiqutin啟動子得到的載體。

所述重組載體可為pcambia1301-osugtpro-osugt或pu1301-osugt，所述pcambia1301-osugtpro-osugt為將pcambia1301的pstⅰ和ecorⅰ間的識別序列替換為序列3所示的dna分子得到的重組載體，所述pu1301-osugt為將pu1301的smaⅰ和ecorⅰ的識別序列間的dna片段替換為pcambia1301-osugtpro-osugt的smaⅰ和ecorⅰ的識別序列間的dna片段得到的重組載體。所述pcambia1301-osugtpro-osugt和所述pu1301-osugt均能表達序列2所示的osugt蛋白質(zhì)。

所述濕度敏感型不育植物可為濕度敏感型雄性不育植物。所述濕度敏感型雄性不育植物可為濕度敏感型花粉不育植物。

所述濕度不敏感育性植物花粉的失水速率低于所述濕度敏感型不育植物花粉的失水速率。所述失水速率可為在60％≥rh≥30％下，具體可為在rh＜30％的濕度條件下的失水速率。

為解決上述及問題，本發(fā)明還提供了調(diào)控植物濕度敏感育性的產(chǎn)品。

本發(fā)明所提供的調(diào)控植物濕度敏感育性的產(chǎn)品，包括下述m1)或m2)：

m1)制備濕度敏感型不育植物的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品具有如下功能：降低植物中osugt蛋白質(zhì)的活性、降低植物中osugt蛋白質(zhì)的含量、抑制植物中osugt蛋白質(zhì)的編碼基因的表達或敲除植物中osugt蛋白質(zhì)的編碼基因；

m2)制備濕度不敏感育性植物的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品具有如下功能：增加植物中osugt蛋白質(zhì)的活性、增加植物中osugt蛋白質(zhì)的含量或促進osugt蛋白質(zhì)的編碼基因的表達。

m1)所述產(chǎn)品可為利用crispr/cas9系統(tǒng)定點編輯所述osugt蛋白質(zhì)的編碼基因所需的試劑和/或儀器。

所述試劑可為試劑1、試劑2、試劑3、試劑4或試劑5：

所述試劑1為r1)-r3)中的任一種：

r1)靶向所述靶序列1的sgrna；

r2)靶向所述靶序列2的sgrna；

r3)靶向所述靶序列3的sgrna；

所述試劑2為所述試劑2與cas9組成的組合物；

所述試劑3為含有r1)-r3)中的任一種rna的編碼基因的重組載體；

所述試劑4為由所述試劑3與含有cas9的編碼基因的重組載體組成的組合物；

所述試劑5為含有r1)-r3)中的任一種rna的編碼基因與cas9的編碼基因的重組載體。

所述試劑3的重組載體可為所述pos-sgrna-osugt-spacer1、所述pos-sgrna-osugt-spacer2或所述pos-sgrna-osugt-spacer3。

所述試劑5的重組載體可為所述ph-ubi-cas9-osugt-spacer1、所述ph-ubi-cas9-osugt-spacer2或所述ph-ubi-cas9-osugt-spacer3。

m2)所述產(chǎn)品可為osugt蛋白質(zhì)的編碼基因或含有osugt蛋白質(zhì)的編碼基因的重組載體。所述重組載體可為所述pcambia1301-osugtpro-osugt或所述pu1301-osugt。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了osugt蛋白質(zhì)或所述osugt蛋白質(zhì)的編碼基因在調(diào)控植物濕度敏感育性中的應(yīng)用。

本發(fā)明中，所述植物、所述受體植物和所述目的植物均可為下述1)或2)：

1)單子葉植物或雙子葉植物；

2)水稻。

本發(fā)明中，所述濕度敏感型不育水稻可表現(xiàn)為在＞60％的濕度條件下可育，具體可表現(xiàn)為在高濕度條件(rh≥80％)下可育，在自然條件(60％≥rh≥30％)下不育，在rh＜30％的濕度條件下不育。各濕度條件與自然條件的溫度均可為27-32℃。

本發(fā)明通過控制水稻的一個糖基轉(zhuǎn)移酶osugt基因及其編碼蛋白獲得了水稻的濕度敏感型雄性不育材料，實現(xiàn)了水稻育性在不同濕度條件下的轉(zhuǎn)換。本發(fā)明獲得的水稻crispr突變體在營養(yǎng)生長階段與野生型無明顯差異；在生殖生長階段，其形態(tài)和花器官的完整性以及花粉的活性均與野生型相似，但是最終表現(xiàn)為不育。深入研究發(fā)現(xiàn)，在自然條件下(tm＝27-32℃，rh＝30-60％)，突變體的花粉粒在空氣中快速失水干癟，不能與柱頭相黏附，使得突變體的結(jié)實率不到10％；在高濕條件下(tm＝27-32℃，rh≥80％)，花粉粒能夠正常粘附柱頭，結(jié)實率也能夠恢復(fù)到80％以上。該濕度敏感型雄性不育材料可以作為母本與優(yōu)勢品種配組生產(chǎn)雜交種子。這類材料的發(fā)現(xiàn)和利用不僅為水稻兩系法雜交育種提供了新的不育系材料，也能為其他禾本科作物的雜交育種奠定理論基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1為5株crispr純合突變體中osugt基因的序列變化。畫下劃線的序列為設(shè)計的靶標(biāo)序列；矩形框內(nèi)的序列為pam基序；—表示缺失的堿基序列

圖2為自然條件和保濕條件下花粉粒在柱頭上的粘附情況。a為自然條件下野生型中花11號的花粉粒在柱頭上的粘附情況；b為自然條件下突變體cugt的花粉粒在柱頭上的粘附情況；c為保濕處理后野生型中花11號的花粉粒在柱頭上的粘附情況；d為保濕處理后突變體cugt的花粉粒在柱頭上的粘附情況。標(biāo)尺＝500μm。

圖3為突變體株系cugt與野生型中花11號相互雜交后花粉粒的粘附情況。野生型中花11號與突變體cugt相互雜交授粉1h后取柱頭用水溶性苯胺藍染色觀察。a：cugt♂×zh11♀；b：cugt♀×zh11♂；異花授粉通過人工授粉完成。標(biāo)尺＝500μm。

圖4為crispr純合突變體的表型。其中，zh11為中花11號，cugt為純合突變體。箭頭所指的稻穗是經(jīng)保濕處理過的，其余稻穗均在自然條件下開花結(jié)實。

圖5為osugt基因的表達模式分析。

圖6為部分轉(zhuǎn)基因植株的鑒定結(jié)果。其中，a為pcambia1301-ugtpro-osugt轉(zhuǎn)基因植株的鑒定結(jié)果，泳道1-11、13-17、19和22均為陽性植株，其余為陰性植株；b為pu1301-osugt轉(zhuǎn)基因植株的鑒定結(jié)果，泳道1-12、14-16和18-22均為陽性植株；m為dna分子量標(biāo)準(zhǔn)，p為陽性對照，n為陰性對照。

圖7為轉(zhuǎn)osugt基因的植株的表型鑒定。a為花粉的失水速率，cugt表示cugt1-8；b和c分別為ctp和pcambia1301對照植株在自然條件(即未進行保濕處理)下的表型和結(jié)實率，pcambia1301為pcambia1301對照植株，ctp1、ctp2和ctp3為ctp的三個陽性株系；d和e分別為oe和pu1301對照植株在自然條件(即未進行保濕處理)下的表型和結(jié)實率，pu1301為pu1301對照植株，oe1、oe2和oe3為oe的三個陽性株系。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑、儀器等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。

下述實施例中的pos-sgrna載體(jinmiaoetal.，targetedmutagenesisinriceusingcrispr-cassystem，cellresearch(2013)23:1233-1236.)經(jīng)北京大學(xué)瞿禮嘉教授同意后公眾可從申請人處獲得該生物材料，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實驗所用，不可作為其它用途使用。

下述實施例中的表達載體ph-ubi-cas9為文獻(jinmiaoetal.，targetedmutagenesisinriceusingcrispr-cassystem，cellresearch(2013)23:1233-1236.)中的ph-ubi-cas9-7經(jīng)北京大學(xué)瞿禮嘉教授同意后公眾可從申請人處獲得該生物材料，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實驗所用，不可作為其它用途使用。

下述實施例中的中花11號(zh11)為文獻(peng,etal.,ectopicexpressionofoslfl1inricerepressesehd1bybindingonitspromoter,biochemicalandbiophysicalresearchcommunications360(2007)251–256)中的zh11，公眾可從申請人處獲得該生物材料，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實驗所用，不可作為其它用途使用。

下述實施例中的表達載體pcambia1301為北京華越洋生物科技有限公司產(chǎn)品，表達載體pu1301為將pcambia1301的hindiii和bamhi識別序列間的dna片段替換為序列5的第7-2016位所示的ubiqutin啟動子得到的載體，序列5的第1-6位和第2017-2022位分別為hindiii和bamhi的識別序列。

實施例1、濕度敏感型雄性不育水稻的獲得

本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了水稻中一個與濕度敏感型雄性不育相關(guān)的基因——osugt基因。其中，osugt基因的編碼序列為序列表中序列1的第2-1486位，osugt基因編碼的蛋白質(zhì)(即osugt蛋白質(zhì))的序列為序列2，osugt基因的基因組序列為序列3。

本實施例通過crispr/cas9基因編輯技術(shù)敲除水稻osugt基因，得到具有濕度敏感型雄性不育表型的突變體cugt。具體操作方法如下：

(1)靶標(biāo)序列

所用靶序列為靶序列1、靶序列2和靶序列3，靶序列1為5’-catgcagtcgccagagaatg-3’(序列1的第1-20位)，靶序列2為5’-tccccagccgcgagctcgcg-3’(序列1的第266-285位)，靶序列3為5’-gcgcagacccgccgacgccg-3’(序列1的第342-361位)。

(2)中間載體的構(gòu)建

將每個靶序列的兩條引物通過退火反應(yīng)形成二聚體結(jié)構(gòu)，與pos-sgrna載體經(jīng)bsai酶切后的載體骨架連接，得到含有水稻osugt基因靶序列的正確的重組載體。

其中，含有靶序列1的重組載體的名稱為pos-sgrna-osugt-spacer1，所用靶序列1的兩條引物的序列如下：

osugt-sgrna1-f：5’-ggcacatgcagtcgccagagaatg-3’

osugt-sgrna1-r：5’-aaaccattctctggcgactgcatg-3’

含有靶序列2的重組載體的名稱為pos-sgrna-osugt-spacer2，所用靶序列2的兩條引物的序列如下：

osugt-sgrna2-f：5’-ggcatccccagccgcgagctcgcg-3’

osugt-sgrna2-r：5’-aaaccgcgagctcgcggctgggga-3’

含有靶序列3的重組載體的名稱為pos-sgrna-osugt-spacer3，所用靶序列3的兩條引物的序列如下：

osugt-sgrna3-f：5’-ggcagcgcagacccgccgacgccg-3’

osugt-sgrna3-r：5’-aaaccggcgtcggcgggtctgcgc-3’

(3)表達載體的構(gòu)建

利用invitrogenlrclonaseii分別催化步驟(2)含有水稻osugt基因靶序列的重組載體和表達載體ph-ubi-cas9進行l(wèi)r反應(yīng)，得到序列正確的重組載體ph-ubi-cas9-osugt-spacer1、ph-ubi-cas9-osugt-spacer2和ph-ubi-cas9-osugt-spacer3。ph-ubi-cas9-osugt-spacer1表達cas9和sgrna1，sgrna1含有靶序列1編碼的rna序列；ph-ubi-cas9-osugt-spacer2表達cas9和sgrna2，sgrna2含有靶序列2編碼的rna序列；ph-ubi-cas9-osugt-spacer3表達cas9和sgrna3，sgrna3含有靶序列3編碼的rna序列。

利用invitrogenlrclonaseii催化pos-sgrna載體與表達載體ph-ubi-cas9進行l(wèi)r反應(yīng)，得到重組載體ph-ubi-cas9-sgrna作為對照載體。

將ph-ubi-cas9-osugt-spacer1、ph-ubi-cas9-osugt-spacer2和ph-ubi-cas9-osugt-spacer3分別導(dǎo)入農(nóng)桿菌eha105中，得到重組菌eha105-ph-ubi-cas9-osugt-spacer1、eha105-ph-ubi-cas9-osugt-spacer2和eha105-ph-ubi-cas9-osugt-spacer3。將ph-ubi-cas9-sgrna導(dǎo)入農(nóng)桿菌eha105中得到重組菌eha105-ph-ubi-cas9-sgrna作為對照菌株。

(4)濕度敏感型雄性不育水稻材料的獲得

利用農(nóng)桿菌浸染水稻成熟胚胚性愈傷獲得濕度敏感型雄性不育水稻，所用菌株為步驟(3)的eha105-ph-ubi-cas9-osugt-spacer1、eha105-ph-ubi-cas9-osugt-spacer2和eha105-ph-ubi-cas9-osugt-spacer3，每個菌株均獨立轉(zhuǎn)化水稻成熟胚胚性愈傷，并利用eha105-ph-ubi-cas9-sgrna得到空載體對照水稻：

挑選飽滿成熟的中花11號種子去除穎殼，置于70％乙醇中表面消毒5min，然后在0.1％hgcl中消毒10min(或20％naclo中消毒20min)，消毒完成后用無菌水沖洗數(shù)次，使種子表面盡量不殘留消毒物質(zhì)，將處理好的種子置于無菌水中浸泡5-15h。在超凈臺中，切取種子胚放于nb2誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，將切面接觸培養(yǎng)基，每個培養(yǎng)皿放置20粒左右，于25℃暗培養(yǎng)4-5周。將誘導(dǎo)出的愈傷組織轉(zhuǎn)接于nb1繼代培養(yǎng)基上，25℃黑暗條件下培養(yǎng)2-3周；挑選淺黃色質(zhì)地較密的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到新的nb1繼代培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)2-3周。選擇生長良好的黃色致密胚性愈傷組織將其切成2mm大小，轉(zhuǎn)移到新的nb1繼代培養(yǎng)基上，25℃繼續(xù)暗培養(yǎng)4-6天用于轉(zhuǎn)化。將愈傷組織浸泡在新鮮的aam-as重懸的od600為0.5左右的農(nóng)桿菌中20min左右，期間不時搖晃。倒掉菌液用移液槍吸干菌液，然后將愈傷塊放到鋪有濾紙的培養(yǎng)皿上5-10min，吸干愈傷表面的殘液，然后轉(zhuǎn)移到覆蓋一層濾紙的nb2c共培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)3-4天。將將共培養(yǎng)好的愈傷轉(zhuǎn)移至nb1s1培養(yǎng)基上篩選培養(yǎng)兩周，兩周后轉(zhuǎn)移到nb1s2篩選培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)兩代，每代15天左右，大部分愈傷組織在篩選后10天左右褐化，然后在褐化組織的邊緣重新生長出乳白色的抗性愈傷組織。將鮮黃色的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到re1分化培養(yǎng)基上進行分化培養(yǎng)，先暗培養(yǎng)1周，再置于光下培養(yǎng)2-3周。將已分化出不定芽的愈傷組織轉(zhuǎn)到re2分化培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)2周，如果狀態(tài)不好可再re2上繼續(xù)誘導(dǎo)分化。分化出的植株長至2-3cm時，轉(zhuǎn)移到1/2ms生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)兩周左右，待小苗長至10cm左右時，打開容器封口膜，煉苗5-7天，即可移栽到培養(yǎng)間或大田，即得到t0代植株。

所用培養(yǎng)基及其成分具體為：

nb2誘導(dǎo)培養(yǎng)基：n6培養(yǎng)基+2mg/l2,4-d+30g/l蔗糖+300mg/l水解酪蛋白，7g/l瓊脂粉，ph5.8；

nb1繼代培養(yǎng)基：n6培養(yǎng)基+0.5mg/l2,4-d+30g/l蔗糖+300mg/l水解酪蛋白，7g/l瓊脂粉，ph5.8；

nb2c共培養(yǎng)基：n6培養(yǎng)基+2mg/l2,4-d+30g/l蔗糖+300mg/l水解酪蛋白，7g/l瓊脂粉+10g/l葡萄糖+100μmol/l乙酰丁香酮(as)，ph5.2；nb1s1培養(yǎng)基：n6培養(yǎng)基+0.5mg/l2,4-d+30g/l蔗糖+300mg/l水解酪蛋白+50mg/l潮霉素+250mg/l替卡西林，7g/l瓊脂粉，ph5.8；nb1s2培養(yǎng)基：n6培養(yǎng)基+0.5mg/l2,4-d+30g/l蔗糖+300mg/l水解酪蛋白+100mg/l潮霉素+200mg/l替卡西林，7g/l瓊脂粉，ph5.8；

aam-as：aam鹽分和氨基酸+ms維生素+100μmol/l乙酰丁香酮(as)，ph5.2；

re1分化培養(yǎng)基：ms鹽分和維生素+300mg/l水解酪蛋白+1mg/l6-ba+0.5mg/lkt+0.2mg/lzt+0.25mg/lnaa+100mg/l潮霉素+250mg/l替卡西林+30g/l蔗糖+30g/l山梨醇，10g/l瓊脂粉，ph5.8；

re2分化培養(yǎng)基：ms鹽分和維生素+300mg/l水解酪蛋白+1mg/l6-ba+0.5mg/lkt+0.2mg/lzt+0.25mg/lnaa+50mg/l潮霉素+30g/l蔗糖+30g/l山梨醇，10g/l瓊脂粉，ph5.8；

1/2ms生根培養(yǎng)基：1/2ms培養(yǎng)基+0.5mg/lnaa，7g/l瓊脂粉，ph5.8。

(5)陽性植株的鑒定

將步驟(4)的t0代植株提取基因組進行pcr和sanger測序鑒定，所用引物為osugt-crispr-f：5’-gccaagaaatgccataagc-3’；osugt-crispr-r：5’-ccgacgacccacacgaagtt-3’。若發(fā)生純合突變則為有效的基因敲除植株，可在t0代直接觀察表型；若為雜合突變，還需在t1代分離后觀察純合突變體的表型。

轉(zhuǎn)基因t0代共49個株系，通過pcr擴增、sanger測序進行鑒定分析，其中5個株系為純合突變體，31個株系為雜合體，13個株系目標(biāo)序列未產(chǎn)生變化，5個osugt基因純合突變體株系(cugt)(cugt1-7、cugt1-8、cugt1-16、cugt2-1和cugt2-13)的序列變化如圖1所示。其中，cugt1-7、cugt1-8和cugt1-16為在靶序列1處發(fā)生突變得到的突變體，cugt1-7在靶序列1處插入了5個核苷酸(aaaaa)，導(dǎo)致osugt基因編碼的蛋白質(zhì)發(fā)生了移碼突變，cugt1-8在靶序列1處缺失了16個核苷酸，導(dǎo)致osugt基因編碼的蛋白質(zhì)發(fā)生了移碼突變，cugt1-16在靶序列1處缺失了3個核苷酸，導(dǎo)致osugt基因編碼的蛋白質(zhì)發(fā)生了缺失突變；cugt2-1和cugt2-13為在靶序列2處發(fā)生突變得到的突變體，cugt2-1在靶序列2處缺失了45個核苷酸，導(dǎo)致osugt基因編碼的蛋白質(zhì)發(fā)生了缺失突變，cugt2-13在靶序列2處插入了1個核苷酸，導(dǎo)致osugt基因編碼的蛋白質(zhì)發(fā)生了移碼突變。

表型分析發(fā)現(xiàn)，5個osugt基因純合突變體株系與野生型中花11號在營養(yǎng)生長階段和開花時間等方面無明顯差異，也具有一套完整正常的花器官和正常的花粉活性，但是最終表現(xiàn)為雄性不育(圖4)?；ǚ鄣闹^萌發(fā)實驗發(fā)現(xiàn)，5個osugt基因純合突變體株系的花粉粒均不能夠正常粘附柱頭，但是高濕條件下則能夠恢復(fù)對柱頭的粘附(圖2)?；ǚ鄣闹^萌發(fā)實驗方法如下：野生型中花11號、突變體cugt經(jīng)自花授粉1h后取柱頭用水溶性苯胺藍染色觀察。自然生長條件：tm＝30-39℃，rh＝40-70％；保濕處理：保鮮膜包裹開花期的花序，濕度可達80-100％。

在自然條件下，將5個osugt基因純合突變體株系與野生型中花11號相互雜交觀察花粉在柱頭的萌發(fā)情況，發(fā)現(xiàn)野生型的花粉粒能夠正常黏附純合突變體株系的柱頭(圖3中b)，但是純合突變體株系的花粉粒卻不能黏附野生型的柱頭(圖3中a)，表明純合突變體株系屬于雄性不育。

對純合突變體株系中部分分蘗的花穗在開花期進行保濕處理，余下分蘗的花穗不進行任何處理(即自然條件，tm＝27-32℃，rh＝30-60％)。保濕處理的方法為：在水稻的開花期，使用保鮮膜或保鮮袋包裹整個花序，使花穗所處環(huán)境的濕度維持在80％-100％，溫度維持在27-32℃，對花穗進行保濕處理的時間為7天，待種子成熟后統(tǒng)計不同條件下的結(jié)實率，如圖4所示。統(tǒng)計結(jié)果顯示，野生型(zh11)中未進行任何處理的稻穗的結(jié)實率(96.25±0.02％)與保濕處理的稻穗的結(jié)實率(81.91±0.08％)無明顯差異，突變體中進行保濕處理的稻穗的結(jié)實率(統(tǒng)計10個稻穗，平均結(jié)實率為80.06±4.53％)與野生型無明顯差異，而未進行保濕處理的稻穗的結(jié)實率(n＝10)遠遠低于保濕處理的結(jié)實率(10個未進行保濕處理的稻穗的平均結(jié)實率為8.25±4.18％)，純合突變體間未進行保濕處理的結(jié)實率無明顯差異，且純合突變體間進行保濕處理的結(jié)實率也無明顯差異，無論是否進行保濕處理空載體對照水稻與野生型的表型和結(jié)實率均無明顯差異。表明，osugt基因突變后可以導(dǎo)致水稻具有濕度敏感型雄性不育表型，在自然條件下表現(xiàn)為不育，在高濕度環(huán)境中表現(xiàn)為可育。

實施例2、水稻濕度敏感型雄性不育相關(guān)基因osugt基因的表達分析

對野生型中花11號發(fā)育至第9-10期、第11-12期、第13-14期的花藥和成熟花粉以及其它15個組織部位進行了轉(zhuǎn)錄本分析，發(fā)現(xiàn)osugt特異的在花藥中表達，特別是發(fā)育至第9-10期的花藥中，其它組織部位幾乎檢測不到表達(圖5)。

實施例3、水稻濕度敏感型雄性不育相關(guān)基因osugt基因的功能分析

為了確定osugt基因是否控制水稻突變體cugt濕度敏感型雄性不育的性狀，發(fā)明人進一步通過轉(zhuǎn)基因?qū)嶒瀬眚炞C。本實施例將正常osugt基因及其調(diào)控序列利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)入突變體cugt中并使之表達，觀察突變體的濕度敏感型雄性不育性狀是否能夠恢復(fù)。具體實驗步驟如下：

(1)目的片段的克?。?/p>

提取野生型水稻中花11號幼葉的基因組dna作為模板，使用osugt基因特異的引物對擴增該基因的全長序列；使用osugt基因啟動子區(qū)段特異引物擴增osugt基因atg前長度約為1500bp的啟動子區(qū)域。所用引物對如下：

osugt基因全長擴增引物：

osugt-f：5’-ggggtaccccatgcagtcgccagagaatgc-3’

osugt-r：5’-ccggaattccggctcttcattaaacctcacattgaata-3’(該引物位于3’utr上)

osugt啟動子區(qū)段擴增引物：

osugtpro-f：5’-aactgcagaaccaatgcattggttgcgacttgatttatgct-3’

osugtpro-r：5’-ggggtaccccggcggcaccgacccgctc-3’

(2)表達載體的構(gòu)建：

將擴增得到的序列正確的osugt基因全長序列利用kpnⅰ和ecorⅰ酶切，將擴增得到的序列正確的啟動子區(qū)段(序列表中序列4)利用pstⅰ和kpnⅰ酶切，將這兩個酶切后的dna片段與表達載體pcambia1301經(jīng)pstⅰ和ecorⅰ酶切后得到的載體骨架連接，得到重組載體，將序列正確的重組載體命名為pcambia1301-osugtpro-osugt。pcambia1301-osugtpro-osugt能表達序列2所示的osugt蛋白質(zhì)，所用啟動子為osugt基因啟動子區(qū)段。

將pcambia1301-osugtpro-osugt經(jīng)smaⅰ和ecorⅰ酶切后得到的含有osugt基因的dna片段和表達載體pu1301經(jīng)smaⅰ和ecorⅰ酶切后得到的載體骨架連接，得到含有完整ubiqutin啟動子的重組載體，將該重組載體命名為pu1301-osugt，pu1301-osugt能表達序列2所示的osugt蛋白質(zhì)，所用啟動子為ubiqutin啟動子。

(3)轉(zhuǎn)基因植株的獲得：

將pcambia1301-ugtpro-osugt、pu1301-osugt、pcambia1301(作為空載體對照)和pu1301(作為空載體對照)分別導(dǎo)入農(nóng)桿菌eha105中得到重組菌eha105-pcambia1301-ugtpro-osugt、eha105-pu1301-osugt、eha105-pcambia1301和eha105-pu1301。

按照實施例步驟(2)的方法，利用上述四個重組菌轉(zhuǎn)化實施例2的cugt1-8，得到轉(zhuǎn)基因植株，將eha105-pcambia1301-ugtpro-osugt和eha105-pu1301-osugt得到的植株分別命名為ctp植株和oe植株，

將eha105-pcambia1301和eha105-pu1301得到的轉(zhuǎn)基因植株分別命名為pcambia1301對照植株和pu1301對照植株。

(4)植株鑒定和表型確認：

鑒定ctp植株采用caps標(biāo)記分析，所用引物對為5’-ctttcgtgctgttacctgtcg-3’(位于osugt基因的啟動子區(qū)域)和5’-ccgacgacccacacgaagtt-3’(位于osugt基因編碼區(qū)域)，擴增產(chǎn)物長度為1286bp。經(jīng)kpnⅰ酶切后得到長度為965bp和321bp的兩個片段(圖6中a)，利用pcambia1301-ugtpro-osugt載體作為陽性對照，利用pcambia1301載體作為陰性對照。鑒定oe植株時則是在過表達載體和基因序列上各設(shè)計一條引物，具體序列為5’-catggctgacgaggcgatg-3’(位于osugt基因編碼區(qū)域)和5’-tgatggcatttgtaggtg-3’(位于pu1301載體上)，擴增長度為852bp(圖6中b)，利用pu1301-osugt載體作為陽性對照，利用pu1301載體作為陰性對照。

檢測t0代ctp陽性植株和t0代oe陽性植株的花粉在空氣中的失水速率，并利用pcambia1301對照植株、pu1301對照植株、實施例2的cugt1-8和中花11號(野生型，zh11)作為對照，檢測方法如下：

利用olympuscx21顯微鏡和奧特測量軟件usb2.0可以定時連拍花粉失水引起的體積變化，失水的花粉會干癟，易與未失水的花粉區(qū)分，統(tǒng)計出每個時間點失水花粉在總花粉中的比例，從而計算花粉的失水速率。全過程檢測的是同一個視野中的花粉，即在所有花粉完全失水前不可以移動觀察的視野。每個材料至少保證3個重復(fù)。

部分結(jié)果如圖7中a所示，結(jié)果顯示，t0代ctp陽性植株和t0代oe陽性植株的花粉在自然條件(tm＝27-32℃，rh＝30-60％)下的失水速率與野生型基本一致，而pcambia1301對照植株、pu1301對照植株和cugt1-8的花粉在自然條件下的失水速率基本一致，表明，osugt基因的突變可以導(dǎo)致花粉失水速率加快，osugt基因可以使突變體cugt1-8喪失花粉失水速率加快的表型。

選取三個t0代ctp陽性植株，將其分蘗分別隨機分為兩組，一組不做處理，一組按照實施例1中的保濕處理方法進行保濕處理，并利用pcambia1301對照植株和中花11號(野生型)作為對照。

選取三個t0代oe陽性植株，將其分蘗分別隨機分為兩組，一組不做處理，一組按照實施例1中的保濕處理方法進行保濕處理，并利用pu1301對照植株和中花11號(野生型)作為對照。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ctp陽性植株、oe陽性植株和中花11號無論在保濕處理下還是未進行保濕處理下的結(jié)實率均無明顯差異，并且植株間的結(jié)實率也無明顯差異，pcambia1301對照植株在保濕處理下的結(jié)實率與ctp陽性植株的結(jié)實率無顯著差異，且在未進行保濕處理下的結(jié)實率(8.78±1.28％)遠低于ctp陽性植株(保濕處理分蘗的結(jié)實率分別為81.48±1.17％，79.92±3.79％，79.90±1.68％)，pu1301對照植株在保濕處理下的結(jié)實率與oe陽性植株的結(jié)實率無顯著差異，且在未進行保濕處理下的結(jié)實率(8.56±1.22％)遠低于oe陽性植株(保濕處理分蘗的結(jié)實率分別為68.48±5.78％，82.76±5.33％，74.54±1.17％)。表明，osugt基因可以使突變體cugt1-8喪失濕度敏感型雄性不育的表型。

<110>中國科學(xué)院植物研究所

<120>一種制備水稻濕度敏感型雄性不育材料的方法及相關(guān)基因

<160>5

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1486

<212>dna

<213>水稻

<400>1

catgcagtcgccagagaatgcggcaccgcgcgtgtacttcatcccgttcccgacgccggg60

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gctcgtcctcacgcgcgccaacgccgccaggctcggcggcgccgtcgcccgcgccgccgc180

cgcgggatcacggatccgcgtccacgcgctcgccctgcccgccgaggccgcggggctcac240

gggcggccacgagagcgccgacgacctccccagccgcgagctcgcggggcccttcgccgt300

cgccgtcgacctcctcgcgccgctcttcgccgacctcctgcggcgcagacccgccgacgc360

cgtggtgttcgacggcgtcctcccgtgggctgccaccgcggcggccgagctccgcgtccc420

gcggtacgcgttcacggggacggggtgcttcgcgctctcggtgcagcgagcactgctgct480

ccacgccccgcaggacggcgtcgcgtcggacgacgagccgttcctcgtgccgggcctccc540

cgacgcggtgcggctcaccaagtcgaggctcgccgaggcgaccctccccggcgcgcactc600

gcgggagttcttgaaccgaatgttcgacggcgagcgcgccacgacggggtgggtggtcaa660

ctccttcgccgacctagagcagaggtacatcgagcactacgagaaggagacggggaagcc720

cgtgttcgccgtcgggccggtctgcctcgtcaacggcgacggcgacgacgtcatggagcg780

cgggcgcggcggggaaccgtgcgccgccacggacgccgcgcgcgcgctggcgtggctcga840

cgcgaagcccgcgcggtcggtggtgtacgtctgcttcggcagcctcacccggttcccgga900

cgagcaggtcgcggagctcggcgcggggctcgcgggctccggcgtgaacttcgtgtgggt960

cgtcgggggcaagaacgcgtcggcggcgccgctgctcccggacgtcgtgcacgccgccgt1020

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ggccggggtgccggtgctggcgtggccggtgttcgcggagcagttctacaacgaggcgct1200

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gcgccgggagatggcggcggatccacggaacgtgaaggaagtatga1486

<210>2

<211>494

<212>prt

<213>水稻

<400>2

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151015

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