本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及苯丙氨酸衰減子突變體和解決反饋阻遏的苯丙氨酸操縱子以及它們的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：l-苯丙氨酸(l-phenylalanine)是人和動物的8種必需氨基酸之一，主要用于高甜度低熱量的新型甜味劑阿斯巴甜的原料，還廣泛應(yīng)用于食品、飼料添加劑以及醫(yī)藥等領(lǐng)域。目前國內(nèi)外工業(yè)化生產(chǎn)l-苯丙氨酸的主要方法是微生物發(fā)酵法。此外，l-苯丙氨酸還可以通過微生物代謝途徑進(jìn)一步衍生合成d-苯丙氨酸、苯丙酮酸、扁桃酸、乙酸苯酯、苯基乙醇、苯乙胺、苯乙烯和肉桂酸等重要應(yīng)用價值的化合物。然而，微生物中l(wèi)-苯丙氨酸的合成途徑及調(diào)控方式較復(fù)雜，是高效發(fā)酵生產(chǎn)l-苯丙氨酸及其衍生物的關(guān)鍵限制因素。微生物合成氨基酸(如l-組氨酸、l-蘇氨酸、l-苯丙氨酸、l-亮氨酸、l-異亮氨酸和l-色氨酸等)的操縱子基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)存在衰減調(diào)節(jié)機(jī)制。當(dāng)胞內(nèi)特定氨基酸濃度較高時，氨基酸操縱子的轉(zhuǎn)錄提前終止。相反地，當(dāng)胞內(nèi)特定氨基酸缺乏時，rna聚合酶轉(zhuǎn)錄氨基酸操縱子。微生物發(fā)酵生產(chǎn)l-苯丙氨酸或其衍生物的過程中，胞內(nèi)l-苯丙氨酸逐步積累，通過上述衰減調(diào)控機(jī)制反饋阻遏苯丙氨酸操縱子的表達(dá)，不利于l-苯丙氨酸或其衍生物的生物合成。因此，為了構(gòu)建高效生產(chǎn)苯丙氨酸或其衍生物的工程菌，亟需開發(fā)苯丙氨酸衰減子改造的方法，以提高苯丙氨酸操縱子表達(dá)水平和苯丙氨酸產(chǎn)量。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供苯丙氨酸衰減子突變體和解決反饋阻遏的苯丙氨酸操縱子以及它們的應(yīng)用。本發(fā)明首先保護(hù)dna分子甲(苯丙氨酸衰減子突變體)，為如下(a1)、(a2)、(a3)、(a4)或(a5)：(a1)序列表的序列2第n1-n2位核苷酸所示的dna分子；n1為105以上118以下的自然數(shù)(n1優(yōu)選為117)，n2為123以上176以下的自然數(shù)(n2具體可為123以上146以下的自然數(shù)或147以上176以下的自然數(shù)，更具體可為123、146或176)；(a2)將苯丙氨酸衰減子的第1至n3位核苷酸去除后得到的dna分子，n3為104以上117以下的自然數(shù)(n3優(yōu)選為116)；(a3)將苯丙氨酸衰減子相關(guān)序列的第1至n3位核苷酸去除后得到的dna分子，n3為104以上117以下的自然數(shù)(n3優(yōu)選為116)；(a4)在(a1)或(a2)或(a3)的末端連接標(biāo)簽序列得到的dna分子；(a5)在(a1)或(a2)或(a3)的末端連接連接序列得到的dna分子。苯丙氨酸衰減子突變體為苯丙氨酸衰減子截短體或苯丙氨酸衰減子變體。苯丙氨酸衰減子截短體如序列表的序列2第n1-123位核苷酸所示。苯丙氨酸衰減子變體如序列表的序列2第n1-n4位核苷酸所示，n4為124以上176以下的自然數(shù)(n4具體可為124以上146以下的自然數(shù)或147以上176以下的自然數(shù)，更具體可為146或176)。本發(fā)明還保護(hù)所述dna分子甲在促進(jìn)下游目的基因表達(dá)中的應(yīng)用。所述應(yīng)用中，所述dna分子甲作為調(diào)控元件。所述應(yīng)用中，所述dna分子甲位于所述目的基因的啟動子和所述目的基因的起始密碼子之間。所述應(yīng)用中，所述啟動子具體可為序列表的1所示的啟動子pthr-trc。所述應(yīng)用中，所述目的基因具體可為序列表的序列3所示的gfp基因。本發(fā)明還保護(hù)dna分子乙，自上游至下游依次包括：所述dna分子甲和目的基因。所述目的基因具體可為序列表的序列3所示的gfp基因。本發(fā)明還保護(hù)dna分子丙，自上游至下游依次包括：啟動子、所述dna分子甲、目的基因和終止子。所述啟動子具體可為序列表的1所示的啟動子pthr-trc。所述目的基因具體可為序列表的序列3所示的gfp基因。所述終止子具體可為“ctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg”。所述dna分子甲或所述dna分子乙或所述dna分子丙中，不具有苯丙氨酸衰減子第1至n3位核苷酸，n3為104以上117以下的自然數(shù)(n3優(yōu)選為116)。所述dna分子乙自上游至下游依次由如下元件組成：序列表的序列2第117至176位核苷酸，連接序列“ggttctggttctggttct”，序列表的序列3所示的gfp基因所述dna分子丙自上游至下游依次由如下元件組成：序列表的1所示的啟動子pthr-trc，限制性內(nèi)切酶hindiii的酶切識別序列，序列表的序列2第117至176位核苷酸，連接序列“ggttctggttctggttct”，序列表的序列3所示的gfp基因，終止子序列“ctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg”。本發(fā)明還保護(hù)dna分子丁(解除衰減調(diào)控的苯丙氨酸操縱子基因，又稱苯丙氨酸操縱子基因突變體)，是將苯丙氨酸操縱子基因中的苯丙氨酸衰減子第1至n3位核苷酸去除后得到的dna分子；n3為104以上117以下的自然數(shù)(n3優(yōu)選為116)。本發(fā)明還保護(hù)dna分子戊，是將苯丙氨酸操縱子基因進(jìn)行如下兩個改造后得到的dna分子：(1)將苯丙氨酸衰減子第1至n3位核苷酸去除；n3為104以上117以下的自然數(shù)(n3優(yōu)選為116)；(2)將編碼分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫水酶雙功能酶的基因從編碼野生蛋白的基因突變?yōu)榫幋a解除了反饋阻遏的突變蛋白的基因。所述解除了反饋阻遏的突變蛋白具體可為phea*蛋白。所述野生蛋白具體可為phea蛋白。所述dna分子戊具體可為序列表的序列2第117至1307位核苷酸所示的dna分子。所述dna分子戊具體可為序列表的序列2第117至1413位核苷酸所示的dna分子。含有所述dna分子丁或所述dna分子戊的重組載體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。含有所述dna分子丁或所述dna分子戊的重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述重組菌可為將所述dna分子丁或所述dna分子戊導(dǎo)入出發(fā)菌進(jìn)行過表達(dá)得到的重組菌。所述出發(fā)菌為埃希氏菌屬細(xì)菌或棒桿菌屬細(xì)菌。所述埃希氏菌屬細(xì)菌具體可為大腸桿菌，例如大腸桿菌k-12或其衍生菌株。所述棒桿菌屬細(xì)菌具體可為谷氨酸棒桿菌，例如谷氨酸棒桿菌13032。所述出發(fā)菌可為將編碼3-脫氧-d-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(arof蛋白)的基因?qū)氤跏季玫降闹亟M菌。所述初始菌為埃希氏菌屬細(xì)菌或棒桿菌屬細(xì)菌。所述埃希氏菌屬細(xì)菌具體可為大腸桿菌，例如大腸桿菌k-12或其衍生菌株。所述棒桿菌屬細(xì)菌具體可為谷氨酸棒桿菌，例如谷氨酸棒桿菌13032。編碼arof蛋白的基因也可與所述dna分子丁一起導(dǎo)入所述出發(fā)菌。編碼arof蛋白的基因也可與所述dna分子戊一起導(dǎo)入所述出發(fā)菌。arof蛋白為如下(b1)或(b2)：(b1)由序列表中序列8所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b2)將序列8的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有3-脫氧-d-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶功能的由序列8衍生的蛋白質(zhì)。編碼arof蛋白的基因的開放閱讀框可如序列表的序列7中第195至1265位核苷酸所示。編碼arof蛋白的基因可如序列表的序列7所示。本發(fā)明還保護(hù)以上任一所述重組菌在制備苯丙氨酸中的應(yīng)用。應(yīng)用所述重組菌生產(chǎn)苯丙氨酸時，采用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)所述重組菌。所述發(fā)酵培養(yǎng)基可以是豐富培養(yǎng)基，也可以是無機(jī)鹽培養(yǎng)基。培養(yǎng)基包含碳源、氮源、無機(jī)離子、抗生素和其它的營養(yǎng)因子。作為碳源，可以使用葡萄糖、乳糖、半乳糖等糖類；也可以是甘油、甘露醇等醇類；也可以使用葡萄糖酸、檸檬酸、丁二酸等有機(jī)酸類。作為氮源，可以使用氨水、硫酸銨、磷酸銨、氯化銨等無機(jī)氮源；也可以使用玉米漿、豆粕水解液、毛發(fā)粉、酵母提取物、蛋白胨等有機(jī)氮源。無機(jī)離子包含鐵、鈣、鎂、錳、鉬、鈷、銅、鉀等離子中的一種或多種。其它營養(yǎng)因子還包括生物素、維生素b1、吡哆醛等維生素。所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源為葡萄糖。所述發(fā)酵培養(yǎng)基具體可為：葡萄糖20.0g/l、硫酸銨15.0g/l、磷酸二氫鉀2.0g/l、七水硫酸鎂2.0g/l、酵母粉2.0g/l、碳酸鈣15.0g/l、微量元素混合液5ml/l，余量為水。微量元素混合液：feso4·7h2o10g/l、cacl21.35g/l、znso4·7h2o2.25g/l、mnso4·4h2o0.5g/l、cuso4·5h2o1g/l、(nh4)6mo7o24·4h2o0.106g/l、na2b4o7·10h2o0.23g/l、cocl2·6h2o0.48g/l、35％hcl10ml/l，余量為水。所述培養(yǎng)的條件具體可為：37℃、220rpm震蕩培養(yǎng)36h。所述培養(yǎng)的條件具體可為：將種子液以3％的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、220rpm震蕩培養(yǎng)36h。種子液的制備方法如下：將重組菌接種至液體lb培養(yǎng)基中，37℃、220rpm振蕩培養(yǎng)8h，得到種子液。所述種子液的od600nm值具體可為5.0。所述培養(yǎng)的過程中進(jìn)行如下過程控制：培養(yǎng)過程中，用氨水調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的ph值使其維持在6.8-7.0；培養(yǎng)過程中，每隔3-4h取樣一次，檢測葡萄糖含量，當(dāng)體系中的葡萄糖含量低于5g/l時，補(bǔ)加葡萄糖并使體系中的葡萄糖濃度達(dá)到10g/l。本發(fā)明還保護(hù)一種提高微生物生產(chǎn)苯丙氨酸的能力的方法，包括如下步驟：刪除微生物的苯丙氨酸操縱子基因中從苯丙氨酸衰減子第1位開始計數(shù)的第1至n3位核苷酸；n3為104以上117以下的自然數(shù)(n3優(yōu)選為116)。所述微生物為具有苯丙氨酸操縱子的微生物。所述微生物具體可為埃希氏菌屬微生物。所述埃希氏菌屬微生物具體可為大腸桿菌，更具體可為大腸桿菌k-12或其衍生菌株。本發(fā)明還保護(hù)一種解除微生物中苯丙氨酸操縱子反饋阻遏的方法，包括如下步驟：刪除微生物的苯丙氨酸操縱子基因中從苯丙氨酸衰減子第1位開始計數(shù)的第1至n3位核苷酸；n3為104以上117以下的自然數(shù)(n3優(yōu)選為116)。所述微生物為具有苯丙氨酸操縱子的微生物。所述微生物具體可為埃希氏菌屬微生物。所述埃希氏菌屬微生物具體可為大腸桿菌，更具體可為大腸桿菌k-12或其衍生菌株。以上任一所述苯丙氨酸操縱子基因包括苯丙氨酸衰減子和編碼分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫水酶雙功能酶(phea*蛋白或phea蛋白)的基因。phea*蛋白為如下(c1)或(c2)：(c1)由序列表中序列6所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(c2)將序列6的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫水酶雙功能酶功能的由序列6衍生的蛋白質(zhì)。phea蛋白為如下(d1)或(d2)：(d1)由序列表中序列5所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(d2)將序列5的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫水酶雙功能酶功能的由序列5衍生的蛋白質(zhì)。所述苯丙氨酸衰減子具體如序列表的序列2第1至123位核苷酸所示。所述苯丙氨酸衰減子相關(guān)序列具體如序列表的序列2第1至176位核苷酸所示。編碼phea*蛋白的基因具體如序列表的序列2第147至1307位核苷酸所示。所述苯丙氨酸操縱子基因具體如序列表的序列2第1至1307位核苷酸所示。所述苯丙氨酸操縱子基因具體如序列表的序列2第1至1413位核苷酸所示。以上任一所述苯丙氨酸具體可為l-苯丙氨酸。本發(fā)明公開了一種改造苯丙氨酸衰減子的方法，該方法為刪除衰減子中編碼前導(dǎo)肽的基因phel和終止子莖環(huán)結(jié)構(gòu)中前段反向互補(bǔ)回文序列，而保留了終止子后段反向互補(bǔ)回文序列。本發(fā)明的發(fā)明人通過去除苯丙氨酸衰減子的特定序列，意外的獲得了可以顯著提高基因表達(dá)水平的苯丙氨酸衰減子突變體。顯而易見，根據(jù)本發(fā)明的試驗結(jié)果，本領(lǐng)域技術(shù)人員可輕易推論得到，去除上述衰減子的終止子莖環(huán)結(jié)構(gòu)中前段反向互補(bǔ)回文序列的部分序列，在一定程度上破壞終止子二級互補(bǔ)結(jié)構(gòu)，同樣可能得到相似性能的苯丙氨酸衰減子突變體和苯丙氨酸操縱子突變體。因此，這種類似的改造苯丙氨酸衰減子的方法也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之中。顯而易見，本發(fā)明解除大腸桿菌的苯丙氨酸衰減子的方法，同樣可應(yīng)用于其它菌屬的苯丙氨酸衰減子。本發(fā)明還公開了一種解除衰減調(diào)控的苯丙氨酸操縱子基因，具體為去除編碼前導(dǎo)肽的基因phel和終止子莖環(huán)結(jié)構(gòu)中前段反向互補(bǔ)回文序列、而保留終止子后段反向互補(bǔ)回文序列的苯丙氨酸操縱子基因。應(yīng)用本發(fā)明提供的苯丙氨酸衰減子改造方法，顯著提高了工程菌的苯丙氨酸發(fā)酵性能。本發(fā)明在實踐上可用于細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)苯丙氨酸。顯而易見，本發(fā)明還可用于苯丙氨酸代謝途徑下游化合物如d-苯丙氨酸、苯丙酮酸、扁桃酸、乙酸苯酯、苯基乙醇、苯乙胺、苯乙烯和肉桂酸等的生物合成。除了改造染色體上原位的苯丙氨酸操縱子基因之外，作為基因過表達(dá)的其它方法，如在染色體上整合≥1拷貝的上述解除衰減調(diào)控的苯丙氨酸操縱子基因同樣在本專利的保護(hù)范圍之內(nèi)；此外，通過質(zhì)粒過表達(dá)上述解除衰減調(diào)控的苯丙氨酸操縱子基因同樣也在本專利的保護(hù)范圍之內(nèi)。應(yīng)用本發(fā)明提供的苯丙氨酸衰減子改造方法，顯著提高了苯丙氨酸操縱子或其它基因的表達(dá)水平，從而提高工程菌的苯丙氨酸及其衍生物的發(fā)酵性能。本發(fā)明獲得高效解除反饋阻遏的核酸序列，構(gòu)建了高效生產(chǎn)苯丙氨酸的菌株，為改進(jìn)苯丙氨酸發(fā)酵生產(chǎn)提供了新方法。采用本發(fā)明提供的方案，可以顯著提高苯丙氨酸及其衍生物產(chǎn)量，對于苯丙氨酸及其衍生物的生產(chǎn)領(lǐng)域具有極其重大的應(yīng)用推廣價值。具體實施方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。下述實施例中如未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段和市售的常用儀器、試劑，可參見《分子克隆實驗指南(第3版)》(科學(xué)出版社)、《微生物學(xué)實驗(第4版)》(高等教育出版社)以及相應(yīng)儀器和試劑的廠商說明書等參考。atcc：https://www.atcc.org/。大腸桿菌k12mg1655：atcc編號為700926。pacyc184質(zhì)粒：neb公司，產(chǎn)品目錄號e4152s。pgfpuv載體：clontechlaboratories,inc.，catalogno.632312。大腸桿菌ec135：記載于如下文獻(xiàn)：zhangetal,plosgenetics，2012,8(9):e1002987。實施例1、衰減子突變體調(diào)控gfp基因的表達(dá)一、構(gòu)建重組質(zhì)粒pacyc184-pthr-trc1、合成序列表的序列1所示的雙鏈dna分子(啟動子pthr-trc)。2、以大腸桿菌k12mg1655的基因組dna為模板，采用wy1947和wy1948組成的引物對進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。wy1947：ctagtctagagcttttcattctgactgcaac；wy1948：cccaagcttacattatacgagccggatgattaattgtcaactgtctgtgcgctatgcct。3、取步驟2得到的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶xbai和hindiii進(jìn)行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。4、取pacyc184質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶xbai和hindiii進(jìn)行雙酶切，回收載體骨架(約4.1kb)。5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pacyc184-pthr-trc。二、構(gòu)建各個重組質(zhì)粒1、構(gòu)建重組菌gfp3248(1)以大腸桿菌k12mg1655的基因組dna為模板，采用wy3248和wy3258組成的引物對進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物a1；以pgfpuv載體為模板，采用wy3105和wy1859組成的引物對進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物a2；將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物a1和pcr擴(kuò)增產(chǎn)物a2混合后作為模板，采用wy3248和wy1859組成的引物對進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物a3。wy3248：cccaagcttagtcacttaaggaaacaaacatga；wy3258：agttcttctcctttactcatagaaccagaaccagaacccagcgccagtaacgggttttc；wy3105：ggttctggttctggttctatgagtaaaggagaagaacttttca；wy1859：acatgcatgccaaaaaacccctcaagacccgtttagaggccccaaggggttatgctagttatttgtagagctcatccatgcca。(2)取步驟(1)得到的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物a3，用限制性內(nèi)切酶hindiii和sphi雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。(3)取重組質(zhì)粒pacyc184-pthr-trc，用限制性內(nèi)切酶hindiii和sphi雙酶切，回收載體骨架。(4)將步驟(2)的酶切產(chǎn)物和步驟(3)的載體骨架連接，化轉(zhuǎn)至大腸桿菌ec135，并從轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒，得到重組質(zhì)粒pacyc184-pthr-trc-phela-gfp3248。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒pacyc184-pthr-trc-phela-gfp3248進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：在pacyc184質(zhì)粒的xbai和sphi酶切位點之間插入了特異dna分子；特異dna分子自上游至下游依次由如下元件組成：序列表的1所示的啟動子pthr-trc，限制性內(nèi)切酶hindiii的酶切識別序列，rbs序列“agtcacttaaggaaacaaac”，序列表的序列2第1至176位核苷酸(包含完整的苯丙氨酸衰減子和phea基因的開放閱讀框中編碼前10個氨基酸殘基的序列)，連接序列“ggttctggttctggttct”，序列表的序列3所示的gfp基因，終止子序列“ctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg”。含有重組質(zhì)粒pacyc184-pthr-trc-phela-gfp3248的大腸桿菌ec135命名為重組菌gfp3248。2、構(gòu)建重組菌gfp3250(1)以大腸桿菌k12mg1655的基因組dna為模板，采用wy3250和wy3258組成的引物對進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物a1；以pgfpuv載體為模板，采用wy3105和wy1859組成的引物對進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物a2；將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物a1和pcr擴(kuò)增產(chǎn)物a2混合后作為模板，采用wy3250和wy1859組成的引物對進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物a3。wy3250：cccaagcttcttttttattgataacaaaaaggcaacact。(2)取步驟(1)得到的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物a3，用限制性內(nèi)切酶hindiii和sphi雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。(3)取重組質(zhì)粒pacyc184-pthr-trc，用限制性內(nèi)切酶hindiii和sphi雙酶切，回收載體骨架。(4)將步驟(2)的酶切產(chǎn)物和步驟(3)的載體骨架連接，化轉(zhuǎn)至大腸桿菌ec135，并從轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒，得到重組質(zhì)粒pacyc184-pthr-trc-phela-gfp3250。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒pacyc184-pthr-trc-phela-gfp3250進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：在pacyc184質(zhì)粒的xbai和sphi酶切位點之間插入了特異dna分子；特異dna分子自上游至下游依次由如下元件組成：序列表的1所示的啟動子pthr-trc，限制性內(nèi)切酶hindiii的酶切識別序列，序列表的序列2第117至176位核苷酸(包括苯丙氨酸衰減子截短體和phea基因的開放閱讀框中編碼前10個氨基酸殘基的序列)，連接序列“ggttctggttctggttct”，序列表的序列3所示的gfp基因，終止子序列“ctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg”。含有重組質(zhì)粒pacyc184-pthr-trc-phela-gfp3250的大腸桿菌ec135命名為重組菌gfp3250。3、構(gòu)建重組菌gfp3251(1)以大腸桿菌k12mg1655的基因組dna為模板，采用wy3251和wy3258組成的引物對進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物a1；以pgfpuv載體為模板，采用wy3105和wy1859組成的引物對進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物a2；將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物a1和pcr擴(kuò)增產(chǎn)物a2混合后作為模板，采用wy3251和wy1859組成的引物對進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物a3。wy3251：cccaagcttgataacaaaaaggcaacactatga。(2)取步驟(1)得到的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物a3，用限制性內(nèi)切酶hindiii和sphi雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。(3)取重組質(zhì)粒pacyc184-pthr-trc，用限制性內(nèi)切酶hindiii和sphi雙酶切，回收載體骨架。(4)將步驟(2)的酶切產(chǎn)物和步驟(3)的載體骨架連接，化轉(zhuǎn)至大腸桿菌ec135，并從轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒，得到重組質(zhì)粒pacyc184-pthr-trc-phela-gfp3251。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒pacyc184-pthr-trc-phela-gfp3251進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：在pacyc184質(zhì)粒的xbai和sphi酶切位點之間插入了特異dna分子；特異dna分子自上游至下游依次由如下元件組成：序列表的1所示的啟動子pthr-trc，限制性內(nèi)切酶hindiii的酶切識別序列，序列表的序列2第127至176位核苷酸(包含phea基因的開放閱讀框中編碼前10個氨基酸殘基的序列，且完全去除了苯丙氨酸衰減子)，連接序列“ggttctggttctggttct”，序列表的序列3所示的gfp基因，終止子序列“ctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg”。含有重組質(zhì)粒pacyc184-pthr-trc-phela-gfp3251的大腸桿菌ec135命名為重組菌gfp3251。4、構(gòu)建gfp對照將重組質(zhì)粒pacyc184-pthr-trc導(dǎo)入大腸桿菌ec135，得到的重組菌命名為gfp對照。三、gfp熒光強(qiáng)度分析試驗菌株為：重組菌gfp3248、重組菌gfp3250或重組菌gfp3251。設(shè)置gfp對照作為對照菌株。1、將試驗菌株或?qū)φ站杲臃N至含34mg/l氯霉素的液體lb培養(yǎng)基中，37℃、220rpm振蕩培養(yǎng)過夜。2、取步驟1得到的菌液，按照1％接種量接種于含34mg/l氯霉素的液體lb培養(yǎng)基中，37℃、220rpm振蕩培養(yǎng)12小時。3、取150μl步驟2得到的菌液，加入黑邊透底的96孔板中，使用高通量多功能酶標(biāo)儀(infinite200pro型，瑞士tecan)同時檢測細(xì)胞密度和gfp熒光信號。檢測細(xì)胞密度的相關(guān)參數(shù)設(shè)置見表1。檢測gfp熒光信號的相關(guān)參數(shù)設(shè)置見表2。表1吸光度(absorbance)波長(wavelength)600nm帶寬(bandwidth)9nm閃光次數(shù)(numberofflashes)25建立時間(settletime)0ms表2熒光頂讀(fluorescencetopreading)激發(fā)波長(excitationwavelength)400nm發(fā)射波長(emissionwavelength)510nm激發(fā)帶寬(excitationbandwidth)9nm發(fā)射帶寬(emissionbandwidth)20nm收集(gain)100(手動，manual)閃光次數(shù)(numberofflashes)15積分時間(integrationtime)20μs滯后時間(lagtime)0μs建立時間(settletime)0msz位置(z-position)20000μm(手動，manual)各個試驗菌株的熒光強(qiáng)度值＝實測熒光值÷細(xì)胞密度-對照菌株的實測熒光值÷對照菌株的細(xì)胞密度。設(shè)置三次重復(fù)試驗，相應(yīng)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差結(jié)果見表3。與重組菌gfp3248(完全保留苯丙氨酸衰減子)相比，重組菌gfp3250的熒光強(qiáng)度提高了5.2倍。與重組菌gfp3251(完全去除苯丙氨酸衰減子)相比，重組菌gfp3250的熒光強(qiáng)度提高了3.7倍。結(jié)果表明，位于啟動子和目的基因之間的苯丙氨酸衰減子截短體可以作為調(diào)控元件，促進(jìn)目的基因的表達(dá)。苯丙氨酸衰減子突變體如序列表的序列2第n1-n2位核苷酸所示，n1為105以上118以下的自然數(shù)(n1優(yōu)選為117)，n2為123以上176以下的自然數(shù)(n2具體可為123以上146以下的自然數(shù)或147以上176以下的自然數(shù)，更具體可為123、146或176)。苯丙氨酸衰減子突變體包括苯丙氨酸衰減子截短體和苯丙氨酸衰減子變體(全稱為在苯丙氨酸衰減子截短體下游連接其他核苷酸的變體)。苯丙氨酸衰減子截短體如序列表的序列2第n1-123位核苷酸所示。苯丙氨酸衰減子變體如序列表的序列2第n1-n4位核苷酸所示，n4為124以上176以下的自然數(shù)(n4具體可為124以上146以下的自然數(shù)或147以上176以下的自然數(shù)，更具體可為146或176)。表3熒光強(qiáng)度重組菌gfp3248770.4±65.2重組菌gfp32504778.4±463.2重組菌gfp32511010.9±128.6實施例2、制備苯丙氨酸一、構(gòu)建重組質(zhì)粒pacyc184-pjj1、合成序列表的序列4所示的雙鏈dna分子(啟動子pjj)。2、以步驟1制備的雙鏈dna分子為模板，采用wy843和wy842組成的引物對進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。wy843：tgctctagacaattccgacgtctaagaaa；wy842：cccaagcttggtcagtgcgtcctgctgat。3、取步驟2得到的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶xbai和hindiii進(jìn)行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。4、取pacyc184質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶xbai和hindiii進(jìn)行雙酶切，回收載體骨架(約4.1kb)。5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pacyc184-pjj。二、三個重組質(zhì)粒的構(gòu)建1、以大腸桿菌k12mg1655的基因組dna為模板，采用wy3248和wy4020組成的引物對進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物a1；以大腸桿菌k12mg1655的基因組dna為模板，采用wy3250和wy4020組成的引物對進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物a2；以大腸桿菌k12mg1655的基因組dna為模板，采用wy3251和wy4020組成的引物對進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物a3；以大腸桿菌k12mg1655的基因組dna為模板，采用wy4021和wy4022組成的引物對進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物a4。wy3248：cccaagcttagtcacttaaggaaacaaacatga；wy3250：cccaagcttcttttttattgataacaaaaaggcaacact；wy3251：cccaagcttgataacaaaaaggcaacactatga；wy4020：cttcaaccagcgcacaggcttgttgccc；wy4021：gggcaacaagcctgtgcgctggttgaagwy4022：cgcggatcccgcacagcgttttcagagtwy4020和wy4021用于在編碼分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫水酶雙功能酶的基因中引入一個點突變(該點突變對應(yīng)序列表的序列2第1071位核苷酸，為g→t的突變)。將大腸桿菌k12mg1655的基因組中引入上述點突變前的相應(yīng)基因編碼的分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫水酶雙功能酶命名為phea蛋白(如序列表的序列5所示)。將引入上述點突變后的相應(yīng)基因編碼的分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫水酶雙功能酶命名為phea*蛋白(如序列表的序列6所示)。與phea蛋白相比，phea*蛋白的差異僅在于將phea蛋白第309位氨基酸殘基由甘氨酸突變?yōu)榱税腚装彼?，從而解除了反饋阻遏?、將步驟1得到的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物a1和pcr擴(kuò)增產(chǎn)物a4混合后作為模板，采用wy3248和wy4022組成的引物對進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物b1；將步驟1得到的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物a2和pcr擴(kuò)增產(chǎn)物a4混合后作為模板，采用wy3250和wy4022組成的引物對進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物b2；將步驟1得到的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物a3和pcr擴(kuò)增產(chǎn)物a4混合后作為模板，采用wy3251和wy4022組成的引物對進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物b3。3、取重組質(zhì)粒pacyc184-pjj，用限制性內(nèi)切酶hindiii和bamhi雙酶切，回收載體骨架。4、取步驟2得到的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物b1，用限制性內(nèi)切酶hindiii和bamhi雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。5、將步驟3的載體骨架和步驟4的酶切產(chǎn)物連接，得到重組質(zhì)粒pacyc184-pjj-phel3248a*。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒pacyc184-pjj-phel3248a*進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：在pacyc184質(zhì)粒的xbai和bamhi酶切位點之間插入了特異dna分子；特異dna分子自上游至下游依次由如下元件組成：序列表的序列4所示的啟動子pjj，限制性內(nèi)切酶hindiii的酶切識別序列，rbs序列“agtcacttaaggaaacaaac”，序列表的序列2所示的dna分子。6、取步驟2得到的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物b2，用限制性內(nèi)切酶hindiii和bamhi雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。7、將步驟3的載體骨架和步驟6的酶切產(chǎn)物連接，得到重組質(zhì)粒pacyc184-pjj-phel3250a*。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒pacyc184-pjj-phel3250a*進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：在pacyc184質(zhì)粒的xbai和bamhi酶切位點之間插入了特異dna分子；特異dna分子自上游至下游依次由如下元件組成：序列表的序列4所示的啟動子pjj，限制性內(nèi)切酶hindiii的酶切識別序列，序列表的序列2第117至1413位核苷酸所示的dna分子。8、取步驟2得到的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物b3，用限制性內(nèi)切酶hindiii和bamhi雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。9、將步驟3的載體骨架和步驟8的酶切產(chǎn)物連接，得到重組質(zhì)粒pacyc184-pjj-phel3251a*。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒pacyc184-pjj-phel3251a*進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：在pacyc184質(zhì)粒的xbai和bamhi酶切位點之間插入了特異dna分子；特異dna分子自上游至下游依次由如下元件組成：序列表的序列4所示的啟動子pjj，限制性內(nèi)切酶hindiii的酶切識別序列，序列表的序列2第127至1413位核苷酸所示的dna分子。三、構(gòu)建三個重組質(zhì)粒1、以大腸桿菌k12mg1655的基因組為模板，采用wy4023和wy4024組成的引物對進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。wy4023：acatgcatgccaaagcatagcggattgttttcwy4024：cgcggatccttaagccacgcgagccgtca經(jīng)測序，pcr擴(kuò)增產(chǎn)物中，sphi和bamhi酶切位點之間的核苷酸序列如序列表的序列7所示，編碼序列表的序列8所示的蛋白質(zhì)。序列8所示的蛋白質(zhì)為3-脫氧-d-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(arof蛋白)。序列表的序列7中，開放閱讀框為第195至1265位核苷酸。2、取步驟1得到的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶sphi和bamhi雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。3、取重組質(zhì)粒pacyc184-pjj-phel3248a*，用限制性內(nèi)切酶sphi和bamhi雙酶切，回收載體骨架。4、將步驟2的酶切產(chǎn)物和步驟3的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pacyc184-pjj-phel3248a*-arof。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒pacyc184-pjj-phel3248a*-arof進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：在pacyc184質(zhì)粒的xbai和bamhi酶切位點之間插入了步驟二的5中所述的特異dna分子，在sphi和bamhi酶切位點之間插入了序列表的序列7所示的arof基因(重組質(zhì)粒中，特異dna分子與arof基因反向存在)。5、取重組質(zhì)粒pacyc184-pjj-phel3250a*，用限制性內(nèi)切酶sphi和bamhi雙酶切，回收載體骨架。6、將步驟2的酶切產(chǎn)物和步驟5的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pacyc184-pjj-phel3250a*-arof。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒pacyc184-pjj-phel3250a*-arof進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：在pacyc184質(zhì)粒的xbai和bamhi酶切位點之間插入了步驟二的7中所述的特異dna分子，在sphi和bamhi酶切位點之間插入了序列表的序列7所示的arof基因(重組質(zhì)粒中，特異dna分子與arof基因反向存在)。7、取重組質(zhì)粒pacyc184-pjj-phel3251a*，用限制性內(nèi)切酶sphi和bamhi雙酶切，回收載體骨架。8、將步驟2的酶切產(chǎn)物和步驟7的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pacyc184-pjj-phel3251a*-arof。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒pacyc184-pjj-phel3251a*-arof進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：在pacyc184質(zhì)粒的xbai和bamhi酶切位點之間插入了步驟二的9中所述的特異dna分子，在sphi和bamhi酶切位點之間插入了序列表的序列7所示的arof基因(重組質(zhì)粒中，特異dna分子與arof基因反向存在)。四、構(gòu)建重組菌將重組質(zhì)粒pacyc184-pjj-phel3248a*-arof導(dǎo)入大腸桿菌k12mg1655，得到重組菌，將其命名為工程菌phe3248。將重組質(zhì)粒pacyc184-pjj-phel3250a*-arof導(dǎo)入大腸桿菌k12mg1655，得到重組菌，將其命名為工程菌phe3250。將重組質(zhì)粒pacyc184-pjj-phel3251a*-arof導(dǎo)入大腸桿菌k12mg1655，得到重組菌，將其命名為工程菌phe3251。三、苯丙氨酸工程菌的搖瓶發(fā)酵試驗試驗菌株為：工程菌phe3248、工程菌phe3250或工程菌phe3251。1、取試驗菌株，劃線接種于固體lb培養(yǎng)基平板，37℃靜置培養(yǎng)12小時。2、完成步驟1后，挑取平板上的菌苔，接種至液體lb培養(yǎng)基中，37℃、220rpm振蕩培養(yǎng)8h，得到種子液(od600nm值＝5.0)。3、完成步驟2后，將種子液按照3％的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、220rpm震蕩培養(yǎng)。發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20.0g/l、硫酸銨15.0g/l、磷酸二氫鉀2.0g/l、七水硫酸鎂2.0g/l、酵母粉2.0g/l、碳酸鈣15.0g/l、微量元素混合液5ml/l，余量為水。微量元素混合液：feso4·7h2o10g/l、cacl21.35g/l、znso4·7h2o2.25g/l、mnso4·4h2o0.5g/l、cuso4·5h2o1g/l、(nh4)6mo7o24·4h2o0.106g/l、na2b4o7·10h2o0.23g/l、cocl2·6h2o0.48g/l、35％hcl10ml/l，余量為水。培養(yǎng)過程中，用氨水調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的ph值使其維持在6.8-7.0。培養(yǎng)過程中，每隔3-4h取樣一次，使用生物傳感分析儀sba-40d檢測葡萄糖含量，當(dāng)體系中的葡萄糖含量低于5g/l時，補(bǔ)加葡萄糖并使體系中的葡萄糖濃度達(dá)到10g/l。培養(yǎng)36h后取樣，12000g離心2分鐘，取上清液(即發(fā)酵上清)，檢測l-苯丙氨酸濃度。結(jié)果見表4(三次重復(fù)試驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)。與工程菌phe3248以及工程菌phe3251相比，工程菌phe3250發(fā)酵生產(chǎn)l-苯丙氨酸的產(chǎn)量顯著提高。表4發(fā)酵上清中的l-苯丙氨酸含量(g/l)工程菌phe32480.82±0.07工程菌phe32501.55±0.25工程菌phe32510.77±0.15l-苯丙氨酸濃度的檢測方法：高效液相法，在參考文獻(xiàn)(氨基酸和生物資源，2000，22，59-60)中氨基酸檢測方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，具體方法如下(2,4-二硝基氟苯(fdbn)柱前衍生高效液相法)：取10μl上清液于2ml離心管中，加入200μl0.5mnahco3水溶液和100μl1％(體積比)fdbn-乙腈溶液，于60℃水浴中暗處恒溫加熱60min，然后冷卻至室溫，然后加入700μl0.04mol/lkh2po4水溶液(ph＝7.2±0.05,用40g/lkoh水溶液調(diào)整ph)并搖勻，靜置15min，然后過濾并收集濾液。濾液用于上樣，進(jìn)樣量為15μl。色譜柱為c18柱(zorbaxeclipsexdb-c18，4.6*150mm,agilent,usa)；柱溫：40℃；紫外檢測波長：360nm；流動相a為0.04mol/lkh2po4水溶液(ph＝7.2±0.05,用40g/100mlkoh水溶液調(diào)整ph)，流動相b為55％(體積比)乙腈水溶液，流動相總流量為1ml/min。洗脫過程：洗脫起始時刻(0min)流動相a占流動相總流量的體積份數(shù)為86％、流動相b占流動相總流量的體積份數(shù)為14％；洗脫過程分為4個階段，每個階段中流動相a和流動相b占流動相總流量的體積份數(shù)均為線性變化；第1階段(從起始時刻開始共進(jìn)行2min)結(jié)束時流動相a占流動相總流量的體積份數(shù)為88％、流動相b占流動相總流量的體積份數(shù)為12％，第2階段(從第1階段結(jié)束時刻開始共進(jìn)行2min)結(jié)束時流動相a占流動相總流量的體積份數(shù)為86％、流動相b占流動相總流量的體積份數(shù)為14％，第3階段(從第2階段結(jié)束時刻開始共進(jìn)行6min)結(jié)束時流動相a占流動相總流量的體積份數(shù)為70％、流動相b占流動相總流量的體積份數(shù)為30％，第4階段(從第3階段結(jié)束時刻開始共進(jìn)行10min)結(jié)束時流動相a占流動相總流量的體積份數(shù)為30％、流動相b占流動相總流量的體積份數(shù)為70％。以市售l-苯丙氨酸為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品的苯丙氨酸濃度。最后應(yīng)說明的是：顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引申出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之中。sequencelisting<110>中國科學(xué)院微生物研究所<120>苯丙氨酸衰減子突變體和解決反饋阻遏的苯丙氨酸操縱子以及它們的應(yīng)用<130>gncyx171071<160>8<170>patentinversion3.5<210>1<211>192<212>dna<213>人工序列<400>1gcttttcattctgactgcaacgggcaatatgtctctgtgtggattaaaaaaagagtgtct60gatagcagcttctgaactggttacctgccgtgagtaaattaaaattttattgacttaggt120cactaaatactttaaccaatataggcatagcgcacagacagttgacaattaatcatccgg180ctcgtataatgt192<210>2<211>1413<212>dna<213>人工序列<400>2atgaaacacataccgtttttcttcgcattcttttttaccttcccctgaatgggaggcgtt60tcgtcgtgtgaaacagaatgcgaagacgaacaataaggcctcccaaatcggggggccttt120tttattgataacaaaaaggcaacactatgacatcggaaaacccgttactggcgctgcgag180agaaaatcagcgcgctggatgaaaaattattagcgttactggcagaacggcgcgaactgg240ccgtcgaggtgggaaaagccaaactgctctcgcatcgcccggtacgtgatattgatcgtg300aacgcgatttgctggaaagattaattacgctcggtaaagcgcaccatctggacgcccatt360acattactcgcctgttccagctcatcattgaagattccgtattaactcagcaggctttgc420tccaacaacatctcaataaaattaatccgcactcagcacgcatcgcttttctcggcccca480aaggttcttattcccatcttgcggcgcgccagtatgctgcccgtcactttgagcaattca540ttgaaagtggctgcgccaaatttgccgatatttttaatcaggtggaaaccggccaggccg600actatgccgtcgtaccgattgaaaataccagctccggtgccataaacgacgtttacgatc660tgctgcaacataccagcttgtcgattgttggcgagatgacgttaactatcgaccattgtt720tgttggtctccggcactactgatttatccaccatcaatacggtctacagccatccgcagc780cattccagcaatgcagcaaattccttaatcgttatccgcactggaagattgaatataccg840aaagtacgtctgcggcaatggaaaaggttgcacaggcaaaatcaccgcatgttgctgcgt900tgggaagcgaagctggcggcactttgtacggtttgcaggtactggagcgtattgaagcaa960atcagcgacaaaacttcacccgatttgtggtgttggcgcgtaaagccattaacgtgtctg1020atcaggttccggcgaaaaccacgttgttaatggcgaccgggcaacaagcctgtgcgctgg1080ttgaagcgttgctggtactgcgcaaccacaatctgattatgacccgtctggaatcacgcc1140cgattcacggtaatccatgggaagagatgttctatctggatattcaggccaatcttgaat1200cagcggaaatgcaaaaagcattgaaagagttaggggaaatcacccgttcaatgaaggtat1260tgggctgttacccaagtgagaacgtagtgcctgttgatccaacctgatgaaaaggtgccg1320gatgatgtgaatcatccggcactggattattactggcgattgtcattcgcctgacgcaat1380aacacgcggctttcactctgaaaacgctgtgcg1413<210>3<211>717<212>dna<213>人工序列<400>3atgagtaaaggagaagaacttttcactggagttgtcccaattcttgttgaattagatggt60gatgttaatgggcacaaattttctgtcagtggagagggtgaaggtgatgcaacatacgga120aaacttacccttaaatttatttgcactactggaaaactacctgttccatggccaacactt180gtcactactttctcttatggtgttcaatgcttttcccgttatccggatcatatgaaacgg240catgactttttcaagagtgccatgcccgaaggttatgtacaggaacgcactatatctttc300aaagatgacgggaactacaagacgcgtgctgaagtcaagtttgaaggtgatacccttgtt360aatcgtatcgagttaaaaggtattgattttaaagaagatggaaacattctcggacacaaa420ctcgagtacaactataactcacacaatgtatacatcacggcagacaaacaaaagaatgga480atcaaagctaacttcaaaattcgccacaacattgaagatggatccgttcaactagcagac540cattatcaacaaaatactccaattggcgatggccctgtccttttaccagacaaccattac600ctgtcgacacaatctgccctttcgaaagatcccaacgaaaagcgtgaccacatggtcctt660cttgagtttgtaactgctgctgggattacacatggcatggatgagctctacaaataa717<210>4<211>162<212>dna<213>人工序列<400>4caattccgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtat60cacgaggccctttcgtcttcacctcgagtccctatcagtgatagagattgacctccctat120cagtgatagagatactgagcacatcagcaggacgcactgacc162<210>5<211>386<212>prt<213>大腸桿菌<400>5metthrsergluasnproleuleualaleuargglulysileserala151015leuaspglulysleuleualaleuleualagluargarggluleuala202530valgluvalglylysalalysleuleuserhisargprovalargasp354045ileasparggluargaspleuleugluargleuilethrleuglylys505560alahishisleuaspalahistyrilethrargleupheglnleuile65707580ilegluaspservalleuthrglnglnalaleuleuglnglnhisleu859095asnlysileasnprohisseralaargilealapheleuglyprolys100105110glysertyrserhisleualaalaargglntyralaalaarghisphe115120125gluglnpheilegluserglycysalalysphealaaspilepheasn130135140glnvalgluthrglyglnalaasptyralavalvalproilegluasn145150155160thrserserglyalaileasnaspvaltyraspleuleuglnhisthr165170175serleuserilevalglyglumetthrleuthrileasphiscysleu180185190leuvalserglythrthraspleuserthrileasnthrvaltyrser195200205hisproglnpropheglnglncysserlyspheleuasnargtyrpro210215220histrplysileglutyrthrgluserthrseralaalametglulys225230235240valalaglnalalysserprohisvalalaalaleuglysergluala245250255glyglythrleutyrglyleuglnvalleugluargileglualaasn260265270glnargglnasnphethrargphevalvalleualaarglysalaile275280285asnvalseraspglnvalproalalysthrthrleuleumetalathr290295300glyglnglnalaglyalaleuvalglualaleuleuvalleuargasn305310315320hisasnleuilemetthrargleugluserargproilehisglyasn325330335protrpgluglumetphetyrleuaspileglnalaasnleugluser340345350alaglumetglnlysalaleulysgluleuglygluilethrargser355360365metlysvalleuglycystyrprosergluasnvalvalprovalasp370375380prothr385<210>6<211>386<212>prt<213>人工序列<400>6metthrsergluasnproleuleualaleuargglulysileserala151015leuaspglulysleuleualaleuleualagluargarggluleuala202530valgluvalglylysalalysleuleuserhisargprovalargasp354045ileasparggluargaspleuleugluargleuilethrleuglylys505560alahishisleuaspalahistyrilethrargleupheglnleuile65707580ilegluaspservalleuthrglnglnalaleuleuglnglnhisleu859095asnlysileasnprohisseralaargilealapheleuglyprolys100105110glysertyrserhisleualaalaargglntyralaalaarghisphe115120125gluglnpheilegluserglycysalalysphealaaspilepheasn130135140glnvalgluthrglyglnalaasptyralavalvalproilegluasn145150155160thrserserglyalaileasnaspvaltyraspleuleuglnhisthr165170175serleuserilevalglyglumetthrleuthrileasphiscysleu180185190leuvalserglythrthraspleuserthrileasnthrvaltyrser195200205hisproglnpropheglnglncysserlyspheleuasnargtyrpro210215220histrplysileglutyrthrgluserthrseralaalametglulys225230235240valalaglnalalysserprohisvalalaalaleuglysergluala245250255glyglythrleutyrglyleuglnvalleugluargileglualaasn260265270glnargglnasnphethrargphevalvalleualaarglysalaile275280285asnvalseraspglnvalproalalysthrthrleuleumetalathr290295300glyglnglnalacysalaleuvalglualaleuleuvalleuargasn305310315320hisasnleuilemetthrargleugluserargproilehisglyasn325330335protrpgluglumetphetyrleuaspileglnalaasnleugluser340345350alaglumetglnlysalaleulysgluleuglygluilethrargser355360365metlysvalleuglycystyrprosergluasnvalvalprovalasp370375380prothr385<210>7<211>1265<212>dna<213>大腸桿菌<400>7caaagcatagcggattgttttcaaagggagtgtaaatttatctatacagaggtaagggtt60gaaagcgcgactaaattgcctgtgtaaataaaaatgtacgaaatatggattgaaaacttt120actttatgtgttatcgttacgt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