本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種可調(diào)節(jié)腸道功能、預(yù)防結(jié)腸炎的發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01及其用途。

背景技術(shù)：

炎癥性腸病是病因和發(fā)病機制尚不清楚的慢性非特異性腸道疾病，結(jié)腸炎是其中一種，主要癥狀包括便血、腹痛、腹瀉、消瘦、里急后重等，嚴(yán)重影響患者生活，給患者帶來巨大痛苦與困擾。結(jié)腸炎在世界范圍內(nèi)均有發(fā)生，與種族、地域和年齡有關(guān)，發(fā)病人群中男女性別無顯著差異。據(jù)統(tǒng)計，西方國家結(jié)腸炎發(fā)病率最高，發(fā)生率為1.2-20.3/10萬，流行率為7.6-245/10萬；歐洲地區(qū)的發(fā)生率為19.2-24.3/10萬，亞洲和中東地區(qū)的發(fā)生率為6.3/10萬。但是，由于我國人民生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)腸炎的發(fā)病率呈逐年增加趨勢，已成為我國消化系統(tǒng)常見疾病之一。此外，數(shù)據(jù)顯示有5％-10％的慢性結(jié)腸炎患者轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)腸癌，而患有結(jié)腸炎25年以上的長期患者，約40％轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)腸癌，給人民健康和結(jié)腸炎患者帶來巨大的威脅。因此，探尋有效預(yù)防結(jié)腸炎的方法已迫在眉睫。

在臨床研究中，由于結(jié)腸炎發(fā)病機制的不確定性，使得臨床上治療結(jié)腸炎的藥物種類繁多，目前常用的藥物可歸納為以下幾種：氨基水楊酸類(主要代表藥物：5-氨基水楊酸)、免疫抑制劑類(主要代表藥物：硫唑嘌呤和6-巰基嘌呤)、糖皮質(zhì)激素類(主要代表藥物：二丙酸倍氯松、巰氫可的松)、抗生素、維生素和細(xì)胞因子拮抗劑。雖然這些藥物可在不同程度上預(yù)防結(jié)腸炎，但其作用機理有所不同，并且大多具有副作用、價格高的特點，不適用于普通患者。例如，長期使用5-氨基水楊酸會導(dǎo)致腹痛、惡心、溶血性貧血和腎功能衰竭；低劑量使用糖皮質(zhì)激素時結(jié)腸炎復(fù)發(fā)率較高，而高劑量使用又會導(dǎo)致白內(nèi)障和骨質(zhì)疏松癥；此外，使用抗生素能使腸道菌群生存環(huán)境的條件發(fā)生改變，不利于有益微生物的生存。除此之外，不少研究者還關(guān)注中藥制劑治療結(jié)腸炎的效果，如黃連煎劑、烏梅丸、參苓白術(shù)散、葛根芩連湯、四白湯和四神丸等，雖然表現(xiàn)出對結(jié)腸炎的預(yù)防效果，但是中藥制劑具有組成復(fù)雜且含有不明成分的特點。因此，尋找安全、有效且經(jīng)濟的治療方法具有重要意義。

微生態(tài)制劑因其具有安全、有效且經(jīng)濟的特點而受到國內(nèi)外學(xué)者的重視，益生菌是微生態(tài)制劑中的一種，在保護腸道中發(fā)揮重要作用，cn1796540a公開了具有抗腸道致病菌和抗氧化特性的雙歧桿菌及其用途，用于制備食品組合物或藥物組合物，殺死或抑制幽門螺旋桿菌或大腸桿菌，治療由其引起的各種疾病。cn102174450a公開了一種抗幽門螺桿菌感染的植物乳桿菌及其用途，用于制備藥物組合物、發(fā)酵劑、動物飼料添加劑和保健品中來預(yù)防或減輕幽門螺桿菌的感染。目前認(rèn)為其作用機理為：益生菌進入腸道后，通過調(diào)節(jié)腸道菌群，改善腸道免疫屏障和促進適應(yīng)性與固有免疫反應(yīng)途徑來維持機體腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)的平衡，從而抑制腸道內(nèi)有害菌的生長和減少毒素的產(chǎn)生；益生菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物(乳酸)使腸道內(nèi)ph值降低，進而具有一定抗菌作用；此外，益生菌還能與胃腸道上皮細(xì)胞結(jié)合，從而抑制腸道內(nèi)致病菌的黏附與定植等功能。因此，篩選具有預(yù)防結(jié)腸炎功能的乳酸菌對改善腸道功能的研究具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種可調(diào)節(jié)腸道功能、預(yù)防結(jié)腸炎的發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01及其用途，主要提供一種可調(diào)節(jié)腸道功能、預(yù)防結(jié)腸炎的發(fā)酵乳桿菌菌株和提供一種所述發(fā)酵乳桿菌在發(fā)酵食品中的用途。

本發(fā)明提供的一種可調(diào)節(jié)腸道功能、預(yù)防結(jié)腸炎的發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01于2015年12月29日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，保藏編號為cctccm2015792。

發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01從自然發(fā)酵牦牛酸乳中篩選出，利用形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀和生理生化特征等微生物學(xué)特性對該乳酸桿菌lactobacillusfermentumhy01鑒定為發(fā)酵乳桿菌，該菌株已于2015年12月29日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，保藏編號為cctccm2015792。

所述發(fā)酵乳桿菌hy01的形態(tài)學(xué)特征具體為：

菌體特征：呈革蘭氏染色陽性，細(xì)胞桿狀，無芽孢，兩端圓形。

菌落特征：在mrs固體培養(yǎng)基上形成明顯的菌落，圓形，邊緣整齊，乳白色，菌落凸起，表面濕潤光滑，不產(chǎn)生色素。

所述發(fā)酵乳桿菌hy01體內(nèi)耐受特征為：

發(fā)酵乳桿菌的菌株耐受能力較強，在ph3.0的人工胃液中處理3h后的存活率為103.73±8.60％；在0.3％膽鹽濃度下的生長效率為無膽鹽培養(yǎng)的21.62±0.86％。

所述發(fā)酵乳桿菌hy01在制備調(diào)節(jié)腸道功能或/和預(yù)防結(jié)腸炎的食品中的應(yīng)用。

所述發(fā)酵乳桿菌來源于傳統(tǒng)發(fā)酵食品，屬公認(rèn)安全(generallyrecognizedassafe,gras)菌種，用于發(fā)酵食品中；

所述發(fā)酵食品為含有發(fā)酵乳桿菌的乳酸菌奶飲料、乳粉、膠囊制品或發(fā)酵乳中的一種或多種。

利用所述發(fā)酵乳桿菌hy01制備乳酸菌奶飲料的方法，將保存的發(fā)酵乳桿菌hy01作為發(fā)酵工作劑加入經(jīng)殺菌的原料乳中，培養(yǎng)至發(fā)酵乳桿菌hy01濃度達(dá)到10⁶cfu/ml以上，保存，得乳酸菌奶飲料；

所述原料乳選自脫脂奶、鮮奶或復(fù)原奶。

進一步，所述乳酸菌奶飲料是按照下述步驟制備得到的：

所述發(fā)酵乳桿菌的原始菌種在溫度-80℃下以磁珠形式保存，或者在溫度4℃下以冷凍干燥菌粉的形式保存?zhèn)溆茫?/p>

利用所述發(fā)酵乳桿菌的原始菌種制備發(fā)酵乳桿菌工作發(fā)酵劑；

原料乳在95℃下加熱殺菌20min或在140℃下高溫?zé)釟⒕?s，冷卻到4℃，加入所述發(fā)酵乳桿菌工作發(fā)酵劑，使其濃度達(dá)到10⁶cfu/ml以上，在4℃冷藏保存。

利用所述發(fā)酵乳桿菌hy01制備乳粉的方法，將保存的發(fā)酵乳桿菌hy01作為發(fā)酵工作劑加入經(jīng)殺菌的原料乳中，發(fā)酵獲得發(fā)酵乳桿菌發(fā)酵乳，然后將獲得的發(fā)酵乳桿菌發(fā)酵乳與經(jīng)殺菌的原料乳按照體積比為1:3混合，進行均質(zhì)，真空濃縮、噴霧干燥得到乳粉。

進一步，所述乳粉是按照下述步驟制備得到的：

所述發(fā)酵乳桿菌的原始菌種在溫度-80℃下磁珠形式保存，或者在溫度4℃下以冷凍干燥菌粉的形式保存?zhèn)溆茫?/p>

利用所述發(fā)酵乳桿菌的原始菌種制備發(fā)酵乳桿菌工作發(fā)酵劑；

原料乳在95℃下加熱殺菌20min或在140℃下高溫?zé)釟⒕?s，然后冷卻到37℃，再以原料乳體積的4％接菌量接種所述的發(fā)酵乳桿菌工作發(fā)酵劑，37℃下發(fā)酵16h，得到發(fā)酵乳桿菌發(fā)酵乳；所述發(fā)酵乳桿菌發(fā)酵乳和滅菌后的原料乳按照1∶3(v∶v)配比加入，進行均質(zhì)，真空濃縮、噴霧干燥得到含發(fā)酵乳桿菌的乳粉。

利用所述發(fā)酵乳桿菌hy01制備膠囊制品的方法，將保存的發(fā)酵乳桿菌hy01作為發(fā)酵工作劑加入經(jīng)殺菌的原料乳中，發(fā)酵獲得發(fā)酵乳桿菌發(fā)酵乳，然后將獲得的發(fā)酵乳桿菌發(fā)酵乳與經(jīng)殺菌的原料乳按照體積比為1:3混合，進行均質(zhì)，真空濃縮、噴霧干燥得到乳粉，將乳粉裝到膠囊中制成膠囊制品。

進一步，所述膠囊制品是按照下述步驟制備得到的：

所述發(fā)酵乳桿菌的原始菌種在溫度-80℃下以磁珠形式保存，或者在溫度4℃下以冷凍干燥菌粉的形式保存?zhèn)溆茫?/p>

利用所述發(fā)酵乳桿菌的原始菌種制備發(fā)酵乳桿菌工作發(fā)酵劑；

將原料乳在140℃高溫?zé)釟⒕?s，然后冷卻至37℃，以原料乳體積的4％接菌量接種所述發(fā)酵乳桿菌工作發(fā)酵劑，在37℃下發(fā)酵16h，得到發(fā)酵乳桿菌發(fā)酵乳；將所述發(fā)酵乳桿菌發(fā)酵乳和滅菌后的原料乳按照以1∶3(v∶v))配比加入，均質(zhì)，真空濃縮、噴霧干燥處理后得到乳粉，將得到含有發(fā)酵乳桿菌的膠囊制品。

利用所述發(fā)酵乳桿菌hy01制備發(fā)酵乳的方法，將保存的發(fā)酵乳桿菌hy01作為發(fā)酵工作劑按體積百分比為3～5％加入經(jīng)殺菌的原料乳中，在加入相當(dāng)于原料乳體積百分比為3～5％的可共生發(fā)酵劑，混勻后在發(fā)酵至滴定酸度以乳酸計0.6-0.7％，然后冷卻至4℃，再進行冷藏保存得發(fā)酵乳。

進一步，所述發(fā)酵乳是按照下述步驟制備得到的：

所述發(fā)酵乳桿菌的原始菌種在溫度-80℃下以磁珠形式保存，或者在溫度4℃下以冷凍干燥菌粉的形式保存?zhèn)溆茫?/p>

利用所述發(fā)酵乳桿菌的原始菌種制備發(fā)酵乳桿菌工作發(fā)酵劑；

原料乳在95℃下加熱殺菌20min或在140℃下高溫?zé)釟⒕?s，然后冷卻到37℃，再按照3-5％(體積)加入發(fā)酵乳桿菌工作發(fā)酵劑，再加入3-5％(體積)可共生的用于制備發(fā)酵乳制品的發(fā)酵劑，混勻后在37℃下混菌發(fā)酵至滴定酸度以乳酸計0.6-0.7％，然后冷卻至4℃，再進行冷藏保存得到含有發(fā)酵乳桿菌的發(fā)酵乳。

進一步，所述可共生發(fā)酵劑保加利亞乳桿菌或嗜熱鏈球菌。

本發(fā)明中，所述發(fā)酵乳桿菌工作發(fā)酵劑的制備方法包括：

將所述發(fā)酵乳桿菌的原始菌種接種于12％(重量)的脫脂乳中，110℃滅菌10min，在37℃條件下培養(yǎng)14-16h至凝乳，連續(xù)培養(yǎng)活化兩代，用作母發(fā)酵劑；將所述母發(fā)酵劑按3-5％(體積)接種于滅菌乳中，培養(yǎng)14-16h至凝乳，至該凝乳中的活菌數(shù)約10⁹cfu/ml，得到工作發(fā)酵劑，可以直接將這種工作發(fā)酵劑添加到食品中，或者與可共生的制備發(fā)酵乳的商業(yè)發(fā)酵劑如保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌一起使用制備發(fā)酵乳；或

將所述發(fā)酵乳桿菌的原始菌種接種于mrs液體培養(yǎng)基中，在37℃條件下培養(yǎng)12-16h進行活化，連續(xù)活化兩代，然后將活化培養(yǎng)物按2-4％(體積)接種于mrs培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16-18h，在4℃條件下3000r/min離心15min，去除上清夜，得到細(xì)胞沉淀，將沉淀用無菌脫脂乳制成懸浮液，得到工作發(fā)酵劑。

本發(fā)明中，加熱殺菌是例如使用上海沃迪自動化裝備股份有限公司銷售的tw10d1000型管式殺菌機進行的。

高溫?zé)釟⒕抢缡褂帽本┯聞?chuàng)嘉業(yè)機械設(shè)備有限公司銷售的yc-104型板式超高溫殺菌機進行的。

均質(zhì)是例如使用常州市均質(zhì)機械有限公司銷售的gjb500-40小型均質(zhì)機進行的。

濃縮是例如使用上海偉宙輕工機械有限公司銷售的真空濃縮鍋進行的。

噴霧干燥是例如使用上海沃迪科技有限公司銷售的實驗型噴霧干燥機進行的。

商品發(fā)酵劑優(yōu)選的是保加利亞乳桿菌或嗜熱鏈球菌。

在本發(fā)明的意義上，所述的原料乳選自脫脂奶、鮮奶、復(fù)原奶的一種或多種。

本發(fā)明實施例的技術(shù)方案帶來的有益效果如下：

本發(fā)明公開了一種分離自四川省紅原縣牧民家自然發(fā)酵牦牛酸乳中的可調(diào)節(jié)腸道功能、預(yù)防結(jié)腸炎的發(fā)酵乳桿菌和以該菌株為發(fā)酵劑或添加的發(fā)酵乳、健康食品以及動物保健制品中的應(yīng)用，發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01菌株耐受能力較強，在ph3.0的人工胃液中處理3h后的存活率為103.73±8.60％；在0.3％膽鹽濃度下的生長效率為無膽鹽培養(yǎng)的21.62±0.86。這表明發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01在人的腸道內(nèi)能夠良好生長。小鼠體內(nèi)試驗表明，發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01能夠緩解結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸縮短、結(jié)腸水腫，結(jié)腸炎性細(xì)胞浸潤和粘膜損傷等。此外，在血清水平上，發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01能夠下調(diào)促炎因子ifn-γ，il-12、tnf-α和il-6的水平。在蛋白水平上，發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01還能提高iκbα的水平，降低nf-κbp65、inos和cox-2的水平，具有預(yù)防結(jié)腸炎的作用。

附圖說明

為了更清楚的說明本發(fā)明實施例的技術(shù)方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單的介紹，顯而易見的，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01菌落形態(tài)；

圖2發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01的菌體形態(tài)(l000×)；

圖3不同組小鼠結(jié)腸長度與重量的變化(a：不同組小鼠結(jié)腸照片；b：不同組小鼠結(jié)腸長度；c：不同組小鼠結(jié)腸重量)；

圖4不同組小鼠結(jié)腸病理學(xué)觀察(a：正常組；b：模型組；c：低濃度組；d：高濃度組)；

圖5不同組小鼠血清中炎癥相關(guān)因子水平(a：inf-γ因子水平；b：il-12因子水平；c：tnf-α因子水平；d：il-6因子水平)；

圖6不同組小鼠結(jié)腸中炎癥相關(guān)蛋白水平(a：iκbα蛋白水平；b：nf-κbp65蛋白水平；c：inos蛋白水平；d：cox-2蛋白水平)。

生物材料保藏

本發(fā)明的發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01于2015年12月29日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，編號為cctccm2015792。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整的描述，顯然所描述的實施例僅是本發(fā)明的一部分實施例，不是全部的實施例，基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有付出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

實施例1

發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01的分離、純化及初步鑒定，該實施例按照下述步驟進行：

(1)lactobacillusfermentumhy01的分離、純化

以無菌操作吸取樣品(四川省紅原縣牧民家自然發(fā)酵牦牛酸乳)1ml加入至9ml滅菌生理鹽水混合作成1∶10的均勻稀釋液，并繼續(xù)作一定比例的稀釋。選擇合適梯度的稀釋液，用無菌槍頭各吸取100μl分別涂布到mrs固體平板培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48h，觀察記錄菌落形態(tài)，如圖1所示。用接種環(huán)從平板表面挑取不同菌落接種于mrs液體培養(yǎng)基中，置37℃，100r/min搖床培養(yǎng)18h；重復(fù)以上步驟連續(xù)活化2代后進行涂片革蘭氏染色鏡檢，如圖2所示，確定為g+菌的繼續(xù)活化，直至得到純菌落(鏡檢無雜菌)并保存，具體操作參照《微生物學(xué)實驗技術(shù)》。

實驗結(jié)果顯示，從四川紅原的十二份樣品中共分離出乳酸菌43株。

(2)lactobacillusfermentumhy01的初步鑒定

革蘭氏染色：取典型菌落涂片，進行革蘭氏染色，在微生物顯微鏡油鏡下觀察菌體形態(tài)及其排列方式。挑取視野清晰、形態(tài)典型的菌株，進行拍照。結(jié)果表明，從樣品中分離純化出的菌株均為革蘭氏染色陽性。

實施例2

lactobacillusfermentumhy01的體外篩選

乳酸菌是正常腸道菌的一部分，作為益生菌的首要條件之一，是能在胃和小腸前段存活，被篩選的菌株應(yīng)具有足夠的耐酸性和酸性環(huán)境下生長發(fā)育的特性，有必要對發(fā)酵乳桿菌lactobacillusfermentumhy01的耐酸性進行分析。

(1)益生菌耐受ph3.0人工胃液的篩選

人工胃液的配制：nacl0.2％、胃蛋白酶0.35％、用1m的hcl調(diào)整ph值為3.0后，在無菌操作臺中用真空泵抽濾除菌后備用。

益生菌對人工胃液耐受性的測定：取5ml已經(jīng)活化好的菌株培養(yǎng)液，在無菌操作臺中倒入已滅菌10ml離心管中，經(jīng)3000r/min離心10min收集菌體，加入5ml滅菌生理鹽水混勻制成菌懸液，取1ml菌懸液與9mlph3.0的人工胃液混合，搖勻，置于恒溫振蕩器中培養(yǎng)(37℃，100r/min)，并分別在0h和3h取樣，用mrs瓊脂培養(yǎng)基涂布37℃培養(yǎng)48h。用平板計數(shù)法測定活菌數(shù)，計算其存活率(％)：存活率(％)＝3h的活菌數(shù)/0h的活菌數(shù)×100％，結(jié)果如表1所示。

(2)益生菌耐受不同濃度膽鹽的測定

將活化好的菌種5ml按2％的接種量(100μl)用移液槍分別接種于含0.0％牛膽鹽(即空白)0.05％，0.1％，0.2％和0.3％牛膽鹽(w/v)的mrs-thio培養(yǎng)基(mrs培養(yǎng)基中加0.2％的巰基乙酸鈉)。在恒溫振蕩器中37℃培養(yǎng)24h后，以空白培養(yǎng)基為對照(未接種的mrs-thio培養(yǎng)基)，分別測定上述不同濃度培養(yǎng)基的od值，計算菌株對膽鹽的耐受力。膽鹽耐受力＝含膽鹽的培養(yǎng)基的od值/空白培養(yǎng)基的od值×100％，結(jié)果如表1所示。

表1、lactobacillusfermentumhy01的篩選結(jié)果

篩選結(jié)果表明，lactobacillusfermentumhy01菌株能耐受ph3.0的環(huán)境，且存活率為103.73±8.60％。

通過胃后存活的菌體將與小腸中的膽鹽接觸，本實驗把乳酸菌對膽鹽的抵抗能力用于作為潛在益生菌的一個選擇標(biāo)準(zhǔn)。耐酸性較好的lactobacillusfermentumhy01隨著膽鹽濃度的增加，生長效率逐漸降低，在0.3％膽鹽濃度下的生長效率仍保持在20％以上。

通過以上實驗我們篩選出了耐酸性、耐膽鹽能力較好的lactobacillusfermentumhy01，該菌株已于2015年12月29日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，保藏編號cctccm2015792。

實施例3

dss(葡聚糖硫酸鈉，dextransulfatesodium)誘導(dǎo)結(jié)腸炎實驗：將40只昆明小鼠隨機分成4組，每組10只，雌雄各半，飼養(yǎng)一周后開始實驗，實驗周期為五周。每組小鼠飼養(yǎng)情況如下：實驗期間，飼養(yǎng)在不銹鋼籠中，室溫保持25±2℃，相對濕度50±10％，12h明暗輪換，各組小鼠攝食自由。此外，正常組小鼠每天自由飲水(不含dss)，直到實驗結(jié)束。模型組小鼠第一、二、四周自由飲水(不含dss)，第三周自由飲用含2％dss的水，第五周自由飲用含4％dss的水。低濃度組(10⁹cfu/kg·bw)和高濃度組(10¹⁰cfu/kg·bw)實驗期間每天灌胃相應(yīng)濃度的lactobacillusfermentumhy01菌液，并且均在第三周自由飲用含2％dss的水，第五周自由飲用含4％dss的水，各濃度菌體灌胃量根據(jù)小鼠體重計算。脫頸椎處死小鼠前24h禁水禁食。處死小鼠后，記錄小鼠結(jié)腸的長度與重量，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，高濃度組能夠顯著提高dss誘導(dǎo)結(jié)腸炎的結(jié)腸長度，同時結(jié)腸重量與正常組差異不顯著。

實施例4

小鼠結(jié)腸病理學(xué)觀察：小鼠脫頸椎處死后，取結(jié)腸用10％福爾馬林溶液浸泡，將其固定，做常規(guī)he切片。

實驗期內(nèi)各組小鼠結(jié)腸病理學(xué)觀察如圖4所示。結(jié)果顯示，正常組結(jié)腸粘膜、隱窩完整，固有層無炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象，杯狀細(xì)胞連續(xù)分布；而模型組結(jié)腸粘膜損傷嚴(yán)重、杯狀細(xì)胞減少、固有層細(xì)胞浸潤現(xiàn)象嚴(yán)重，并伴有腸壁增厚。而經(jīng)lactobacillusfermentumhy01處理的結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸粘膜損傷和炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象均得到緩解，說明lactobacillusfermentumhy01處理能夠改善dss導(dǎo)致的結(jié)腸損傷，對預(yù)防結(jié)腸炎的發(fā)生具有促進作用。

實施例5

小鼠血清中各因子水平的測定：取0.2ml小鼠動脈血，在4℃，3000r/min離心10min，取上層血清。按照il-6、il-12、tnf-α和inf-γ測試劑盒說明書的方法測定血清中上述因子水平。

實驗期內(nèi)各小組小鼠血清中各因子水平如圖5所示。

相對于結(jié)腸炎對照組，lactobacillusfermentumhy01高低組均能不同程度的下調(diào)血清中促炎因子il-6、il-12、tnf-α和inf-γ的水平，所以lactobacillusfermentumhy01能夠下調(diào)炎癥因子，對預(yù)防炎癥加重具有促進作用。

實施例6

小鼠結(jié)腸中炎癥相關(guān)蛋白的表達(dá)。

取結(jié)腸組織100mg加入裝有1ml高效ripa裂解液的離心管中勻漿，充分勻漿后4℃，12000r/min離心5min，取其上清用bca法分析其蛋白含量。經(jīng)sds-page凝膠電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移到0.45μmpvdf，并用5％bsa室溫封閉2h。然后一抗孵育過夜(4℃)，tbst洗膜5次，每次5min。二抗室溫孵育1h，tbst洗膜3次，每次5min。最后用eclplus化學(xué)發(fā)光顯影。

實驗期內(nèi)各組小鼠結(jié)腸中炎癥相關(guān)蛋白的表達(dá)如圖6所示。

iκbα是iκb蛋白家族中的一員，iκb蛋白具有抑制細(xì)胞內(nèi)無活性nf-κb的作用，在外界條件作用下，iκb表達(dá)的蛋白被磷酸化和被泛素和蛋白酶降解后，使得抑制作用降低，從而激活并釋放nf-κb。研究發(fā)現(xiàn)，被激活nf-κb在潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機制中扮演重要角色，能夠刺激大量促炎因子的分泌，使腸道炎癥加重，并且nf-κb具有調(diào)節(jié)調(diào)控cox-2和inos的轉(zhuǎn)錄因子，炎癥發(fā)生時，二者蛋白水平提高。實驗中，lactobacillusfermentumhy01處理結(jié)果表明，其能有效防止iκbα的降解，使nf-κb從而抑制nf-κbp65蛋白的磷酸化和inos和cox-2蛋白水平的提高，具有預(yù)防結(jié)腸炎的作用，其中，高濃度處理對預(yù)防dss誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎的效果最佳。

應(yīng)用實施例1：利用發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01制造乳酸菌奶飲料

首先，所述發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01原始菌種在溫度-80℃下以磁珠形式保存，或者在溫度4℃下以冷凍干燥菌粉的形式保存?zhèn)溆谩?/p>

然后，可以采用兩種方法制備本發(fā)明的發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01工作發(fā)酵劑：

第一種方法是將上述發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01原始菌種接種于12％(重量)在110℃滅菌10min的脫脂乳中，在37℃條件下培養(yǎng)14-16h至凝乳，連續(xù)培養(yǎng)活化兩代，用作母發(fā)酵劑；將所述母發(fā)酵劑按3-5％(體積)接種于滅菌乳中，培養(yǎng)14-16h至凝乳，此時該凝乳中的活菌數(shù)約10⁹cfu/ml，得到所述的工作發(fā)酵劑，可以直接將這種工作發(fā)酵劑添加到食品中，或者與可共生的制備發(fā)酵乳的商業(yè)發(fā)酵劑如保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌一起使用制備發(fā)酵乳。

第二種方法是將上述發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01原始菌種接種于mrs液體培養(yǎng)基中，在37℃條件下培養(yǎng)12-16h進行活化，連續(xù)活化兩代，然后將活化培養(yǎng)物按2-4％(體積)接種于mrs培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16-18h，在4℃條件下3000r/min離心15min，去除上清夜，得到細(xì)胞沉淀，將沉淀用一定量的無菌脫脂乳制成懸浮液，得到工作發(fā)酵劑備用。

然后，原料乳在95℃下加熱殺菌20min或在140℃下高溫?zé)釟⒕?s，然后冷卻到4℃，再加入前面所述的發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01工作發(fā)酵劑，使其濃度達(dá)到10⁶cfu/ml以上，在4℃冷藏保存即得到含發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01活菌的乳酸菌奶飲料。

在本發(fā)明中，所述的mrs液體培養(yǎng)基是本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的，是索萊寶公司銷售的用于乳桿菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基。

所述的加熱殺菌是例如使用上海沃迪自動化裝備股份有限公司銷售的tw10d1000型管式殺菌機進行的。

所述的高溫?zé)釟⒕抢缡褂帽本┯聞?chuàng)嘉業(yè)機械設(shè)備有限公司銷售的yc-104型板式超高溫殺菌機進行的。

應(yīng)用實施例2：利用發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01制造乳粉

按照上述乳酸菌奶飲料的制備方法制備，只是原料乳在95℃下加熱殺菌20min或在140℃下高溫?zé)釟⒕?s，然后冷卻到37℃，再以原料乳體積的4％接菌量接種前面所述的發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01工作發(fā)酵劑，再在37℃下發(fā)酵16h，得到發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01發(fā)酵乳；然后所述的發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01發(fā)酵乳按照1∶3(v∶v)加到上述滅菌原料乳中，進行均質(zhì)，真空濃縮、噴霧干燥得到含發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01的乳粉。

所述的均質(zhì)是例如使用常州市均質(zhì)機械有限公司銷售的gjb500-40小型均質(zhì)機進行的。

所述的濃縮是例如使用上海偉宙輕工機械有限公司銷售的真空濃縮鍋進行的。

所述的噴霧干燥是例如使用上海沃迪科技有限公司銷售的實驗型噴霧干燥機進行的。

應(yīng)用實施例3：利用發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01制造膠囊制品

將原料乳在140℃高溫?zé)釟⒕?s，然后冷卻至37℃，以原料乳體積的4％接菌量接種本發(fā)明的發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01工作發(fā)酵劑，在37℃下發(fā)酵16h，得到發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01發(fā)酵乳。將發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01發(fā)酵乳以1∶3(v∶v)加入滅菌后的原料乳中均質(zhì)，經(jīng)真空濃縮、噴霧干燥處理后得到乳粉，將得到的乳粉裝到膠囊中制成膠囊制品。

應(yīng)用實施例4：利用發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01制備發(fā)酵乳

按照上述乳酸菌奶飲料的制備方法制備，只是原料乳在95℃下加熱殺菌20min或在140℃下高溫?zé)釟⒕?s，然后冷卻到37℃，再按照3-5％(體積)加入前面所述的發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01工作發(fā)酵劑，再加入3-5％(體積)可共生的制備發(fā)酵乳商品發(fā)酵劑，混勻后在37℃下混菌發(fā)酵至滴定酸度以乳酸計0.6-0.7％，然后冷卻至4℃，再進行冷藏保存得到所述的發(fā)酵乳。

所述的商品發(fā)酵劑優(yōu)選的是保加利亞乳桿菌或嗜熱鏈球菌。

在本發(fā)明的意義上，所述的原料乳是一種或多種選自脫脂奶、鮮奶、復(fù)原奶的原料乳。

以上所述，僅為本發(fā)明的具體實施例，但本發(fā)明的特征并不局限于此，任何熟悉該項技術(shù)的人在本發(fā)明領(lǐng)域內(nèi)，可輕易想到的變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在以下本發(fā)明的申請專利范圍中。