本發(fā)明屬于植物育性基因調(diào)控領(lǐng)域，具體涉及一種含有地塞米松誘導(dǎo)系統(tǒng)的表達(dá)載體；還涉及該表達(dá)載體的用途。
背景技術(shù)：
：隱性核不育材料不育性遺傳穩(wěn)定、受外界環(huán)境條件影響小，雜交制種安全，易于配制高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗組合，但是由于缺乏有效的保持和繁殖體系，限制了其在種子商業(yè)化生產(chǎn)上的應(yīng)用。美國杜邦先鋒公司(美國專利us5426041)通過在核不育材料中導(dǎo)入與不育基因同源且能恢復(fù)育性的基因、花粉致死基因和篩選基因，實(shí)現(xiàn)了核不育系的繁殖制種。轉(zhuǎn)基因植株后代由于攜帶恢復(fù)育性基因而表現(xiàn)為花粉可育，即成為保持系。由于花粉致死基因的存在，轉(zhuǎn)基因后代只產(chǎn)生一種花粉，即只帶有核不育基因的花粉。這樣所結(jié)的種子也就只有兩種基因型，一種是與轉(zhuǎn)基因前的植株相同的具有純合隱性核不育基因的種子，另一種是與轉(zhuǎn)基因植株相同的攜帶有轉(zhuǎn)基因片段的種子。然后通過篩選基因(如熒光、殺蟲劑)將兩種種子區(qū)分開，前者作為不育系用于生產(chǎn)上雜交種的制種，后者作為保持系繼續(xù)繁殖獲得不育系和保持系，實(shí)現(xiàn)一系兩用。擬南芥ms1基因是控制花粉發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，利用化學(xué)誘變劑甲基磺酸乙酯(ems)篩選，已獲得了該基因的雄性不育突變體ms1-1(zoea.等，theplantjournal，2001，28(1):27-39)；該基因不僅在油菜等雙子葉植物中功能保守，而且在水稻和大麥等單子葉植物中具有極高的功能相似性(gjfernández等，plantbiotechnologyjournal,2014,12(6):765–777；huil等，plantphysiology,2011,156(2):615-30)?；瘜W(xué)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)是一種調(diào)控基因表達(dá)的技術(shù)手段，已在基因功能分析、rna沉默等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。利用糖皮質(zhì)激素受體能結(jié)合包括地塞米松等在內(nèi)的甾類激素的原理(wagnerd.等，science,1999,285(5427):582)，將地塞米松誘導(dǎo)系統(tǒng)轉(zhuǎn)入隱性核不育擬南芥中，從而對不育性進(jìn)行保持，有可能成為將隱性核不育基因用于商業(yè)化生產(chǎn)的有效途徑。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明目的在于提供一種含有地塞米松誘導(dǎo)系統(tǒng)的表達(dá)載體。本發(fā)明另一目的在于提供上述含有地塞米松誘導(dǎo)系統(tǒng)的表達(dá)載體的制備方法。本發(fā)明第三目的在于提供上述表達(dá)載體在誘導(dǎo)植物隱性核不育育性恢復(fù)上的用途。本發(fā)明第四目的在于提供一種獲得含有地塞米松誘導(dǎo)系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因擬南芥的方法。本發(fā)明第五目的在于提供用于鑒定上述含有塞米松誘導(dǎo)系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因植物的分子標(biāo)記。本發(fā)明第六目的在于提供用于鑒定上述含有塞米松誘導(dǎo)系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因植物的引物對。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種含有地塞米松誘導(dǎo)系統(tǒng)的表達(dá)載體，所述的表達(dá)載體含有一個(gè)融合基因，在融合基因的上游為擬南芥ms1基因的啟動(dòng)子序列；其中所述的融合基因由擬南芥ms1基因和小鼠糖皮質(zhì)激素受體甾醇結(jié)合域基因片段組成。上述表達(dá)載體中所述的擬南芥ms1基因由seqidno.2所示的核苷酸序列組成。上述表達(dá)載體中所述的小鼠糖皮質(zhì)激素受體甾醇結(jié)合域基因片段由seqidno.1所示的核苷酸序列組成。上述表達(dá)載體中所述的擬南芥ms1基因的啟動(dòng)子序列由seqidno.3所示的核苷酸序列組成。上述表達(dá)載體中所述的融合基因由seqidno.10所示的核苷酸序列組成。上述含有地塞米松誘導(dǎo)系統(tǒng)的表達(dá)載體的制備方法，包括如下步驟：(1)、以小鼠肝臟的cdna為模板，以gr-f和gr-r為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得小鼠糖皮質(zhì)激素受體甾醇結(jié)合域基因片段，命名為gr；其中所述的引物gr-f和gr-r為：gr-f：5’-cagcaagccactgcaggagtct-3’(seqidno.4)，gr-r：5’-tcatttttgatgaaacagaagcttt-3’(seqidno.5)；(2)、以野生型擬南芥ler花的cdna為模板，以ms1-f和ms1-r為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得不含終止密碼子的擬南芥ms1基因，命名為ms1cds；其中所述的引物ms1-f和ms1-r為：ms1-f：5’-tccccccgggctagactagtatggcgaatctgattcgaaca-3’(seqidno.6)，ms1-r：5’-ctagtctagagggtaaaaaagagagaggaataaga-3’(seqidno.7)；(3)、以野生型擬南芥ler的dna為模板，用ms1pro-f和ms1pro-r為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得擬南芥ms1基因的啟動(dòng)子序列，命名為ms1promoter；其中所述的引物ms1pro-f和ms1pro-r為：ms1pro-f：5’-cggggtaccgagaccctctctcatcttgcgtgt-3’(seqidno.8)，ms1pro-r：5’-ctagtctagacgaatcagaaatttggtttgatcttga-3’(seqidno.9)；(4)、回收步驟(1)的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物gr；用t4連接酶將gr與pmd19-t載體過夜連接，得連接產(chǎn)物；然后將所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5a，37℃過夜培養(yǎng)；將陽性單克隆菌過夜擴(kuò)大培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒，即獲得gr的克隆載體，命名為pmd19t-gr；(5)、回收步驟(2)的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物ms1cds；將步驟(4)所得的pmd19t-gr和ms1cds分別用xmai和xbai進(jìn)行雙酶切，得酶切產(chǎn)物；將酶切產(chǎn)物回收，再用t4連接酶連接，獲得ms1cds和gr的融合基因，命名為ms1cds-gr；再轉(zhuǎn)化，構(gòu)建成該融合基因的克隆載體，命名為pmd19t-ms1cds-gr；(6)、回收步驟(3)的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物ms1promoter；將pcactn載體和ms1promoter分別用kpni和xbai進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物回收，再用t4連接酶連接、轉(zhuǎn)化，構(gòu)建成ms1promoter的克隆載體，命名為pcactn-ms1promoter；(7)、將步驟(5)所得克隆載體pmd19t-ms1cds-gr用spei和sali進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物回收，獲得ms1和gr的融合基因，命名為ms1cds-gr；(8)、將步驟(6)所得的克隆載體pcactn-ms1promoter用xbai和sali進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物回收，獲得線性化的ms1promoter的克隆載體；(9)、用t4連接酶將步驟(7)所得的融合基因ms1cds-gr和步驟(8)所得的線性化的ms1promoter的克隆載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌dh5a并進(jìn)行質(zhì)粒提取，獲得含有地塞米松誘導(dǎo)系統(tǒng)的表達(dá)載體，命名為pms1pro-ms1cds-gr；將pms1pro-ms1cds-gr載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌eha105菌株中，轉(zhuǎn)化后所得菌株命名為eha105-pms1pro-ms1cds-gr。上述制備方法步驟(1)、(2)或(3)中所述的pcr的反應(yīng)體系(20ul)為：taq酶0.2ul，dntp2ul，10xbuffer2ul，模板dna1ul，depch2o14.8ul。上述制備方法步驟(1)、(2)或(3)中所述的pcr的反應(yīng)條件為：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，35個(gè)循環(huán)；72℃10min，20℃2min。上述制備方法步驟(2)或(3)中所述的野生型擬南芥ler是指野生型擬南芥lansbergerecta生態(tài)型。本發(fā)明還提供了上述表達(dá)載體在誘導(dǎo)植物隱性核不育育性恢復(fù)上的應(yīng)用。所述的植物是指擬南芥、油菜、水稻、玉米或大豆等。本發(fā)明還提供了一種獲得含有地塞米松誘導(dǎo)系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因擬南芥的方法，包括如下步驟：(1)、以雄性不育突變體ms1-1材料為母本，以野生型擬南芥ler為父本雜交，得f1代；(2)、將步驟(1)所得f1代的花序浸入上述含有地塞米松誘導(dǎo)系統(tǒng)的農(nóng)桿菌(eha105-pms1pro-ms1cds-gr)溶液里3秒，用保鮮膜輕輕的包裹整個(gè)花序；再用黑色塑料袋罩住整個(gè)植株，培養(yǎng)室暗培養(yǎng)24h，然后去除遮蓋物，于長日照下正常培養(yǎng)，收獲種子收種，獲得t0代種子；(3)、將步驟(2)所得t0代種子均勻撒播到含有遺傳霉素g418的平板培養(yǎng)基上，先在4℃預(yù)處理2-3d，然后轉(zhuǎn)入人工培養(yǎng)室，長出的綠色幼苗即為轉(zhuǎn)有地塞米松誘導(dǎo)系統(tǒng)的t0代陽性植株；(4)選擇不結(jié)實(shí)的t0代陽性植株，于幼蕾期均勻地噴施地塞米松溶液，每天1次，直到植株開花結(jié)實(shí)，收獲t1代種子；如此連續(xù)4代繼續(xù)噴施地塞米松溶液，將t0代通過連續(xù)4代自交，且每代噴施地塞米松溶液誘導(dǎo)，最終獲得穩(wěn)定純合的含有地塞米松誘導(dǎo)系統(tǒng)、且受地塞米松誘導(dǎo)育性恢復(fù)的ms1-1背景的轉(zhuǎn)基因擬南芥。上述方法步驟(1)中所述的雄性不育突變體ms1-1是擬南芥ms1基因的隱性核不育基因突變體。雄性不育突變體ms1-1可通過擬南芥tair數(shù)據(jù)庫(www.arabidopsis.org)購買獲得。上述方法步驟(2)中所述的農(nóng)桿菌溶液的制備方法：將上述的農(nóng)桿菌菌株(eha105-pms1pro-ms1cds-gr)接種于含有利福平和卡那霉素(終濃度均為50ug/ml)的液體lb培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)過夜；將菌液于4℃、2000r/min離心5min，再用5％的蔗糖溶液重懸，調(diào)od600值約為0.8，并加入表面活性劑silwetl-77(終濃度為0.05％)，混勻，獲得eha105-pms1pro-ms1cds-gr農(nóng)桿菌溶液。上述方法步驟(3)中所述的地塞米松誘導(dǎo)系統(tǒng)是指含有ms1啟動(dòng)子、以及ms1和gr的融合基因序列(如seqidno.10所示的核苷酸序列)，且能受地塞米松誘導(dǎo)調(diào)控植物育性表達(dá)的系統(tǒng)。上述方法步驟(3)中所述的平板培養(yǎng)基的組成成分及其比例為：每100ml蒸餾水中含ms基礎(chǔ)培養(yǎng)基0.443g，蔗糖3g，植物凝膠0.3g，以及終濃度為10mg/lg418。上述方法步驟(3)中所述的地塞米松溶液的濃度為5umol/l。所述的地塞米松溶液的制備方法，按照比例將地塞米松粉末溶解于無水乙醇中即可。本發(fā)明還提供了用于鑒定上述含有塞米松誘導(dǎo)系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因植物的分子標(biāo)記，所述的分子標(biāo)記由seqidno.1所示的核苷酸序列組成。利用上述分子標(biāo)記鑒定含有塞米松誘導(dǎo)系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括以待測材料的總dna為模板，以gr-f和gr-r為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，所得pcr產(chǎn)物大小為的828bp的基因片段，即為含有塞米松誘導(dǎo)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因植物；其中其中g(shù)r-f由seqidno.4所示的核苷酸序列組成；gr-r由seqidno.5所示的核苷酸序列組成。用于鑒定上述含有塞米松誘導(dǎo)系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因擬南芥的引物對，所述的引物對為gr-f和gr-r；其中g(shù)r-f由seqidno.4所示的核苷酸序列組成；gr-r由seqidno.5所示的核苷酸序列組成。本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：本發(fā)明首次利用糖皮質(zhì)激素受體能結(jié)合地塞米松而被誘導(dǎo)的原理，獲得能受地塞米松誘導(dǎo)而恢復(fù)育性的隱性核不育擬南芥材料，在不改變基因型情況下，能夠自由操控轉(zhuǎn)有該套系統(tǒng)擬南芥的育性，可作為保持系用于生產(chǎn)不育系，從而能用于雜交制種，取代人工去雄，節(jié)約勞力，降低生產(chǎn)成本。同時(shí)，本發(fā)明為其他作物的隱性核不育應(yīng)用該系統(tǒng)提供了模板。附圖說明圖1.本發(fā)明含有地塞米松誘導(dǎo)系統(tǒng)的表達(dá)載體構(gòu)建過程示意圖。圖2.轉(zhuǎn)有地塞米松誘導(dǎo)系統(tǒng)的ms1-gr材料受地塞米松誘導(dǎo)前后的擬南芥植株表型照片；其中1為地塞米松誘導(dǎo)前，2-4分別為3個(gè)受地塞米松誘導(dǎo)后育性得到恢復(fù)的單株。圖3.經(jīng)地塞米松誘導(dǎo)前后的ms1-gr花粉粒對比顯微照片；其中1為地塞米松誘導(dǎo)前，2-4分別為3個(gè)受地塞米松誘導(dǎo)后育性得到恢復(fù)的單株。圖4.轉(zhuǎn)有地塞米松誘導(dǎo)系統(tǒng)的ms1-gr材料受地塞米松誘導(dǎo)的擬南芥莢果照片；其中1為地塞米松誘導(dǎo)前，2-4分別為3個(gè)受地塞米松誘導(dǎo)后育性得到恢復(fù)的單株。圖5.gr分子標(biāo)記的鑒定電泳圖譜；其中1為地塞米松誘導(dǎo)前，2-4分別為3個(gè)受地塞米松誘導(dǎo)后育性得到恢復(fù)的單株。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料野生型擬南芥landsbergerecta生態(tài)型(簡稱ler)，以及擬南芥雄性不育突變體ms1-1等材料均種植在人工培養(yǎng)室，培養(yǎng)條件為：光照強(qiáng)度為4000勒克斯，持續(xù)光照16小時(shí)，溫度25℃，；黑暗處理8小時(shí)，溫度為22℃，空氣相對濕度75％。如無特別說明，以下實(shí)施例中所用方法均為常規(guī)方法，所用試劑均為常規(guī)試劑。實(shí)施例1含有地塞米松誘導(dǎo)系統(tǒng)的表達(dá)載體的構(gòu)建按照如下方法進(jìn)行：(1)、參考網(wǎng)站https://www.ncbi.nlm.nih.gov/公布的小鼠糖皮質(zhì)激素受體基因nr3c1的序列設(shè)計(jì)引物gr-f和gr-r，用于擴(kuò)增編碼該蛋白甾醇結(jié)合域的基因片段：gr-f：5’-cagcaagccactgcaggagtct-3’(seqidno.4)，gr-r：5’-tcatttttgatgaaacagaagcttt-3’(seqidno.5)。以小鼠肝臟的cdna為模板，以gr-f和gr-r為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，命名為gr。其中pcr的反應(yīng)體系(20ul)為：taq酶0.2ul，dntp2ul，10xbuffer2ul，cdna1ul，無rna酶水14.8ul。pcr的反應(yīng)條件為：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，35個(gè)循環(huán)；72℃10min，20℃2min。經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收該pcr產(chǎn)物(方法參照omega回收試劑盒說明書)，送交測序，得序列長度為828bp的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物(見seqidno.1)；然后按照載體說明書將其連接至pmd19-t載體(寶生物公司)，得連接產(chǎn)物；將所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌dh5a(參照薩姆布魯克《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版，科學(xué)出版社，2002年)，37℃過夜培養(yǎng)；最后將陽性單克隆菌過夜擴(kuò)大培養(yǎng)后，參照質(zhì)粒提取試劑盒使用說明書(omega公司)提取質(zhì)粒，即獲得gr的克隆載體，命名為pmd19t-gr(見圖1)。(2)、參考網(wǎng)站http://www.arabidopsis.org/index.jsp公布的野生型擬南芥ler中ms1基因的啟動(dòng)子和cdna序列，分別設(shè)計(jì)引物：ms1pro-f：5’-cggggtaccgagaccctctctcatcttgcgtgt-3’(seqidno.8)，ms1pro-r：5’-ctagtctagacgaatcagaaatttggtttgatcttga-3’(seqidno.9)；ms1-f：5’-tccccccgggctagactagtatggcgaatctgattcgaaca-3’(seqidno.6)，ms1-r：5’-ctagtctagagggtaaaaaagagagaggaataaga-3’(seqidno.7)。以野生型擬南芥ler花的cdna為模板，以ms1-f和ms1-r為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，參照步驟(1)中所述的pcr反應(yīng)體系和反應(yīng)條件以及膠回收方法，獲得不含終止密碼子且序列長度為2016bp(見seqidno.2)的ms1基因片段，命名為ms1cds。將該膠回收產(chǎn)物和步驟(1)所得的克隆載體pmd19t-gr分別用xmai和xbai在37℃下進(jìn)行過夜酶切反應(yīng)(酶切反應(yīng)體系(20ul)為：10xnebbuffer2ul，xmai1ul，xbai1ul，ms1基因片段或克隆載體pmd19t-gr16ul)，然后將酶切產(chǎn)物參照步驟(1)所述方法進(jìn)行回收、t4連接酶(neb公司)連接、轉(zhuǎn)化、菌液pcr以及質(zhì)粒提取，最后構(gòu)建成ms1cds和gr的克隆載體，命名為pmd19t-ms1cds-gr(見圖1)。(3)、以野生型擬南芥ler的dna為模板，以ms1pro-f和ms1pro-r為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，參照步驟(1)中pcr的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件以及膠回收方法，獲得序列長度為2981bp(見seqidno.3)的ms1啟動(dòng)子序列，命名為ms1promoter；對該膠回收產(chǎn)物和載體pcactn分別用kpni和xbai在37℃下進(jìn)行過夜雙酶切反應(yīng)(酶切反應(yīng)體系(20ul)為：10xnebbuffer2ul，kpni1ul，xbai1ul，ms1啟動(dòng)子序列或載體16ul)，然后將酶切產(chǎn)物參照步驟(1)所述方法進(jìn)行回收、t4連接酶(neb公司)連接、轉(zhuǎn)化、菌液pcr以及質(zhì)粒提取，最后構(gòu)建成ms1promoter的克隆載體，命名為pcactn-ms1promoter(見圖1)。(4)、對步驟(2)所得的pmd19t-ms1cds-gr用spei和sali在37℃下進(jìn)行過夜雙酶切反應(yīng)；經(jīng)膠回收后，獲得序列長度為2853bp(見seqidno.10)的ms1和gr的融合基因片段，命名為ms1cds-gr；所述的酶切反應(yīng)體系(20ul)為：10xnebbuffer2ul，spei1ul，sali1ul，pmd19t-ms1cds-gr克隆載體16ul。(5)、對步驟(3)所得的pcactn-ms1promoter用xbai和sali在37℃下進(jìn)行過夜雙酶切反應(yīng)，經(jīng)膠回收后，獲得線性化的克隆載體；所述的酶切反應(yīng)體系(20ul)為：10xnebbuffer2ul，xbai1ul，sali1ul，pcactn-ms1promoter載體16ul。(6)用t4連接酶(neb公司)將步驟(4)所得的ms1cds-gr融合基因片段和步驟(5)所得線性化的克隆載體連接、轉(zhuǎn)化、菌液pcr檢測以及質(zhì)粒提取，最后構(gòu)建成終載體，即含有地塞米松誘導(dǎo)系統(tǒng)的表達(dá)載體，命名為pms1pro-ms1cds-gr(見圖1)。然后將該終載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌eha105菌株(方法參照薩姆布魯克《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版，科學(xué)出版社，2002年)，將轉(zhuǎn)化后的陽性菌株命名為eha105-pms1pro-ms1cds-gr。實(shí)施例2含有地塞米松誘導(dǎo)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因擬南芥的制備按照如下方法進(jìn)行：(1)、以雄性不育突變體ms1-1(購自擬南芥tair數(shù)據(jù)庫www.arabidopsis.org)為母本，以野生型擬南芥ler為父本雜交，獲得f1代種子；待該f1代植株生長至花蕾期時(shí)備轉(zhuǎn)化；(2)、農(nóng)桿菌溶液的制備：將實(shí)施例1中所得的陽性農(nóng)桿菌菌株eha105-pms1pro-ms1cds-gr接種于含有利福平和卡那霉素(終濃度均為50ug/ml)的液體lb培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)過夜；將菌液于4℃、2000r/min離心5min，再用5％的蔗糖溶液重懸，調(diào)od600值約為0.8，并加入表面活性劑silwetl-77(終濃度為0.05％)，混勻，獲得eha105-pms1pro-ms1cds-gr農(nóng)桿菌溶液；(3)、將步驟(1)所得f1代擬南芥的花序浸入步驟(2)所得的農(nóng)桿菌溶液里3秒，并輕輕攪動(dòng)使整個(gè)花序覆蓋一層液體，隨后用吸水紙輕輕的吸干多余的農(nóng)桿菌液體，用保鮮膜輕輕的包裹整個(gè)花序；再用黑色塑料袋罩住整個(gè)植株，培養(yǎng)室暗培養(yǎng)24h后去除遮蓋物，于長日照下正常培養(yǎng)收種，獲得t0代種子。(4)、將100ml的1/2ms固體培養(yǎng)基(100ml蒸餾水中含ms基礎(chǔ)培養(yǎng)基0.443g，蔗糖3g，植物凝膠0.3g)，經(jīng)滅菌后(滅菌條件為120℃，15min)置于超凈工作臺冷卻到50℃左右，再加入遺傳霉素g418(終濃度為10mg/l)，搖勻后倒成培養(yǎng)基平板，備用。(5)、取(3)中所得的t0代種子均勻撒播到(4)的培養(yǎng)基平板上，平板正面朝上，先在4℃預(yù)處理2-3d，然后轉(zhuǎn)入人工培養(yǎng)室；7d后長出的綠色幼苗，即為轉(zhuǎn)有地塞米松誘導(dǎo)系統(tǒng)的t0代陽性植株，隨后轉(zhuǎn)移到土質(zhì)培養(yǎng)基生長。(6)、選擇不結(jié)實(shí)的t0代陽性植株，于幼蕾期均勻地噴施濃度為5umol/l的地塞米松溶液，每天1次，直到植株開花結(jié)實(shí)，收獲t1代種子；隨后如此連續(xù)4代繼續(xù)噴施地塞米松溶液，將t0代陽性植株通過連續(xù)4代自交，且每代噴施地塞米松溶液誘導(dǎo)，最終獲得穩(wěn)定純合帶有地塞米松誘導(dǎo)系統(tǒng)且受地塞米松誘導(dǎo)育性恢復(fù)好的ms1-1背景的轉(zhuǎn)基因擬南芥3株(見圖2)，將該材料命名為ms1-gr。實(shí)施例3含有地塞米松誘導(dǎo)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因擬南芥育性恢復(fù)材料鑒定試驗(yàn)(一)、花粉育性鑒定和莢果長度的比較(1)在實(shí)施例2獲得的ms1-gr和受地塞米松誘導(dǎo)后育性得到恢復(fù)單株的盛花期，分別選取三朵小花的花藥并擠出花粉粒，經(jīng)孔雀綠染液(其組成成分及其比例見表1)染色10min，然后在光學(xué)顯微鏡下觀察，拍照記錄。(2)在實(shí)施例2獲得的ms1-gr和受地塞米松誘導(dǎo)后育性得到恢復(fù)單株的成熟初期，分別取3個(gè)莢果在體式顯微鏡下解剖，并觀察種子形態(tài)。表1孔雀綠染液的組成成分及其比例成分含量(100ml)苯酚5g水合三氯乙醛5g橙黃g(1％的水溶液)0.5ml孔雀石綠(1％的95％酒精溶液)1ml冰醋酸2ml酸性品紅(1％的水溶液)5ml95％酒精溶液10ml甘油25ml滅菌超純水50ml結(jié)果(見圖3)ms1-gr花藥內(nèi)無花粉粒，受地塞米松誘導(dǎo)后育性得到恢復(fù)單株的花藥內(nèi)均含有可育花粉粒；所獲得的3株穩(wěn)定純合帶有地塞米松誘導(dǎo)系統(tǒng)經(jīng)地塞米松誘導(dǎo)后的單株均能正常結(jié)實(shí)(見圖4)。(二).利用分子標(biāo)記對育性恢復(fù)材料的遺傳背景進(jìn)行鑒定提取實(shí)施例2獲得的ms1-gr和受地塞米松誘導(dǎo)后育性得到恢復(fù)單株的dna，以gr-f和gr-r為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增；其pcr的反應(yīng)體系(20ul)為：taq酶0.2ul，dntp2ul，10xbuffer2ul，dna1ul，超純水14.8ul；pcr的反應(yīng)條件為：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，35個(gè)循環(huán)；72℃10min，20℃2min。將所得pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳。結(jié)果(見圖5)ms1-gr和3株恢復(fù)材料分別獲得長度為828bp的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，說明均含有ms1-gr誘導(dǎo)系統(tǒng)，由此說明該套利用核不育轉(zhuǎn)基因擬南芥篩選育性恢復(fù)材料的方法是成功的。sequencelisting<110>四川農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>一種含有地塞米松誘導(dǎo)系統(tǒng)的表達(dá)載體及其應(yīng)用<160>10<170>patentinversion3.5<210>1<211>828<212>dna<213>musmusculus<400>1caagccactgcaggagtctcacaagacacttcggaaaatcctaacaaaacaatagttcct60gcagcattaccacagctcacccctaccttggtgtcactgctggaggtgattgaacccgag120gtgttgtatgcaggatatgatagctctgttccagattcagcatggagaattatgaccaca180ctcaacatgttaggtgggcgtcaagtgattgcagcagtgaaatgggcaaaggcgatacca240ggcttcagaaacttacacctggatgaccaaatgaccctgctacagtactcatggatgttt300ctcatggcatttgccctgggttggagatcatacagacaatcaagtggaaacctgctctgc360tttgctcctgatctgattattaatgagcagagaatgtctctaccctgcatgtatgaccaa420tgtaaacacatgctgtttgtctcctctgaattacaaagattgcaggtatcctatgaagag480tatctctgtatgaaaaccttactgcttctctcctcagttcctaaggaaggtctgaagagc540caagagttatttgatgagattcgaatgacttatatcaaagagctaggaaaagccatcgtc600aaaagggaagggaactccagtcagaactggcaacggttttaccaactgacaaagcttctg660gactccatgcatgaggtggttgagaatctccttacctactgcttccagacatttttggat720aagaccatgagtattgaattcccagagatgttagctgaaatcatcactaatcagatacca780aaatattcaaatggaaatatcaaaaagcttctgtttcatcaaaaatga828<210>2<211>2016<212>dna<213>arabidopsisthaliana<400>2atggcgaatctgattcgaacagaccatcagcaacatattccaaagaagaggaagagaggg60gaaagtagagtttttaggctgaagacgttcggagagtctggacatccagctgagatgaac120gagttgtcttttcgagataacctcgctaaactacttgagtttggtcactttgagagctcc180ggtctaatgggaagttggtcttttcagctcgagattcaacgaaatccaaatcctctctat240gttcttctctttgtcgtagaagagcccatcgaagcctctctcaatctccgttgcaaccat300tgccaatatgttggttggggaaatcaaatgatatgcaacaagaagtaccatttcgtgatc360ccctcaaaggaaacaatggcggcttttttaaaactggaaggtggaggctacgcttttccc420gaaaaggaaagtttctcccatcttgtggagcttcaaggccatgtccttcacggcttcttt480cactccaacggatttggtcacttgctctctctcaacggcattgaaaccggctccgactta540accggtcatcaggtcatggatttgtgggaccggctctgcaccggtttaaaggccaggaaa600atagggttgaatgacgcgtcgcacaaaaaaggaatggagttgaggctgctgcatggggta660gcaaaaggagagccatggttcggtcgttggggctaccggttcgggtcagggacatacgga720gtgactcaaaagatttacgagaaggcacttgagtcggtccgtaacatacccttgtgcttg780cttaaccatcacctaaccagccttaaccgagaaactccaatcctcttgtcaaagtaccaa840agtttatccaccgagccattgatcactctcagtgacctcttcaggttcatgcttcatctc900cattcacgtcttccaagagataactacatgagtaactcccgaaaccaaatcatctccatt960gatagtaccaactgcagatggtctcaaaaacggatccaaatggctatcaaagtggtcata1020gagtcactgaaaagagtcgaataccgatggatatcgagacaagaagtgagggatgcagct1080agaaattacattggggacactggtttgcttgattttgtgttgaagtcgcttgggaaccag1140gtggttggaaactatttggtccgacgtagtctaaatccggtgaagaaagtgctagagtat1200tccttggaggatatatcaaatttgttaccaagtagtaacaatgaactcataacccttcaa1260aaccaaaactcaatggggaagatggcgacaaacggtcacaataagatcacaagaggtcaa1320gttatgaaagacatgttttatttttacaaacacattctcatggactacaagggagtgtta1380ggccccataggaggtatattgaaccaaatcggaatggcttcaagagcaatcctcgacgct1440aagtacttcatcaaagagtatcactacattagagatacatcggcgaaaacgttacactta1500gatcgaggggaagaattaggaatattctgcacgatcgcgtggaaatgtcatcatcataac1560aacgagataaaagttcctccacaagaatgcattgtagtgaagaaagatgcaacattgagt1620gaagtgtacggagaggcagaaagagtgtttagagatatctattgggaactaagagacgtc1680gtggtggagtcagtggtgggtggtcaaatagagatcacaagggtcgatgaaatggccttg1740aatgggaataagggattggtgttagaagggaacgtaggaatgatgatgaacattgaagtg1800acgaaatgttatgaagatgatgataaaaagaaggataagagaatagagtgtgagtgtgga1860gcaacggaagaagatggagagagaatggtgtgttgtgatatttgtgaagtatggcaacac1920acaaggtgtgttggtgttcaacacaatgaggaagtgcctcgcatttttctttgtcaaagt1980tgtgatcaacatcttattcctctctcttttttaccc2016<210>3<211>2981<212>dna<213>arabidopsisthaliana<400>3gagaccctctctcatcttgcgtgtatcttctcctctatctatatatatataacagccact60aacatgcagacatcaaactatctctctttaaatctcaagaacaagaactaaactactact120agtcttcaccaaggtaaagctactttggaacccgagaaccaagttaatttgttctcatcg180aattttttttgttctcatatgttgaaattttgttattgtcatcttcactttttgattgat240cgatagaaaaataagtattcaattgatc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