本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體的涉及肺腺癌相關(guān)的mirna、組合物及其應(yīng)用，更具體的涉及mir-6087、mir-7976、mir-7705、mir-6744-5p及其組合物在制備肺腺癌診斷制劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：肺癌是死亡率較高的惡性腫瘤之一，主要包括小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，臨床發(fā)病中以非小細(xì)胞肺癌居多，約占80％，非小細(xì)胞肺癌進(jìn)一步可以細(xì)分為腺癌和鱗癌兩大類(lèi)型。近年來(lái)隨著精準(zhǔn)醫(yī)療的不斷發(fā)展，肺癌的個(gè)體化治療要求對(duì)肺癌進(jìn)行分子水平的精準(zhǔn)分型，雖然已經(jīng)有很多報(bào)道披露部分肺癌的診斷分子標(biāo)志物，但是仍不能滿(mǎn)足需求，需要更多的分子標(biāo)志物助力肺癌的分子分型、靶向治療以及預(yù)后判斷。mirna是一類(lèi)長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸的非編碼內(nèi)源性小rna，具有多種生物學(xué)功能，對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育、生理功能尤其在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展等過(guò)程產(chǎn)生重大影響，與mrna相比，mirna在體外更穩(wěn)定，在體內(nèi)代謝周期更長(zhǎng)，因而更適合作為腫瘤分子標(biāo)記物。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)mirna和肺癌的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，例如yanaiharan等研究表明肺癌患者有約有66％的人的mir-21表達(dá)水平至少有2倍以上的上調(diào)，weiss等研究發(fā)現(xiàn)mirna-128b缺失的肺癌細(xì)胞對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼十分敏感。本發(fā)明對(duì)4對(duì)癌組織及癌旁組織的樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并運(yùn)用生物信息學(xué)方法進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)之前從未被報(bào)道過(guò)的與肺腺癌相關(guān)的分子標(biāo)志物，其中，mir-6087、mir-7976在癌組織中表達(dá)低于癌旁組織，mir-7705、mir-6744-5p在癌組織中的表達(dá)量高于癌旁組織，進(jìn)一步，熒光定量pcr實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了高通量測(cè)序的分析，表明mir-6087、mir-7976、mir-7705、mir-6744-5p很有可能成為新的肺腺癌診斷標(biāo)志物，本發(fā)明為臨床肺腺癌的精準(zhǔn)診斷提供了潛在的分子標(biāo)志物，具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種肺腺癌診斷試劑，所述肺腺癌診斷試劑能夠檢測(cè)肺腺癌樣本中mirna和/或其前體的表達(dá)情況，或者mirna調(diào)控的靶基因的表達(dá)，檢測(cè)所述mirna選自下列中的一種或幾種：mir-6087、mir-7976、mir-7705、mir-6744-5p。優(yōu)選的，所述mirna為mir-7705或mir-6744-5p或二者的組合。優(yōu)選的，所述mirna為mir-7705、mir-6744-5p和mir-6087的組合。所述mir-6087序列見(jiàn)序列表seqidno1，其前體mir-6087序列見(jiàn)序列表seqidno2；所述mir-7976序列見(jiàn)序列表seqidno3，其前體mir-7976序列見(jiàn)序列表seqidno4；所述mir-7705序列見(jiàn)序列表seqidno5，其前體mir-7705序列見(jiàn)序列表seqidno6；所述mir-6744-5p序列見(jiàn)序列表seqidno7，其前體mir-6744-5p序列見(jiàn)序列表seqidno8。所述的樣本為腫瘤組織或外周血。進(jìn)一步，肺腺癌診斷試劑基于高通量測(cè)序方法和/或基于定量pcr方法和/或基于探針雜交方法檢測(cè)肺腺癌樣本中mirna和/或其前體的轉(zhuǎn)錄或基于免疫方法檢測(cè)肺腺癌樣本中其成熟mirna調(diào)控的靶基因的表達(dá)情況。優(yōu)選采用northern雜交方法、mirna表達(dá)譜芯片、核酶保護(hù)分析技術(shù)、rake法、原位雜交、基于微球的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肺腺癌樣本中mirna和/或其前體的轉(zhuǎn)錄。優(yōu)選的，所述的用于定量pcr方法包括特異性擴(kuò)增mirna和/或其前體的引物；所述的基于探針雜交方法包括與mirna和/或其前體的核酸序列雜交的探針。進(jìn)一步，擴(kuò)增mir-6087的引物為序列seqidno9；擴(kuò)增mir-7976的引物為序列seqidno10；擴(kuò)增mir-7705的引物為序列seqidno11；擴(kuò)增mir-6744-5p的引物為序列seqidno12。本發(fā)明的目的還在于提供上述mirna和/或其前體在制備肺腺癌診斷工具中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的在于提供一種治療肺腺癌藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包含：(a)化合物或組合物，所述化合物下調(diào)mir-7705或mir-6744-5p的轉(zhuǎn)錄和/或抑制mir-7705或mir-6744-5p成熟mirna的活性；(b)藥劑學(xué)上能接受的載體。進(jìn)一步，采用反義寡核苷酸、antagomirs、mirna海綿、mirnaerasers、targetmasking和/或多靶點(diǎn)反義寡核苷酸的方法下調(diào)mir-7705或mir-6744-5p的轉(zhuǎn)錄和/或阻斷mir-7705或mir-6744-5p的活性。本發(fā)明的目的在于提供一種治療肺腺癌藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包含：(a)化合物或組合物，所述化合物上調(diào)mir-6087或mir-7976的轉(zhuǎn)錄和/或促進(jìn)mir-6087或mir-7976成熟mirna的活性；(b)藥劑學(xué)上能接受的載體。進(jìn)一步，采用基于rna的microrna功能獲得性技術(shù)和/或基因特異性mirmimics技術(shù)上調(diào)mir-6087或mir-7976的轉(zhuǎn)錄和/或促進(jìn)其成熟mirna的活性。優(yōu)選人工合成mir-6087或mir-7976成熟mirna的短發(fā)夾rna(shorthairpinrna，shrna)或通過(guò)調(diào)控啟動(dòng)子上調(diào)mir-6087或mir-7976。定義：現(xiàn)階段檢測(cè)mirna的表達(dá)水平的方法主要包括基于高通量測(cè)序技術(shù)、基于核苷酸雜交和基于pcr的mirna檢測(cè)方法?；谔结橂s交技術(shù)的mirna檢測(cè)方法是一種直接檢測(cè)法，不需要對(duì)樣本rna進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，包括northern雜交方法、mirna表達(dá)譜芯片、核酶保護(hù)分析技術(shù)、rake法、原位雜交、基于微球的流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)。(1)northern雜交又稱(chēng)rna印跡技術(shù)為最經(jīng)典的檢測(cè)真核生物rna大小，估計(jì)其豐度的實(shí)驗(yàn)方法。基本原理如下：首先在載體(如硅片、微球或膜等)上固定mirna樣本，再與經(jīng)過(guò)標(biāo)記的探針雜交，洗滌多余的雜交探針后進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)；也可以在載體上先固定與靶mirna序列互補(bǔ)的dna探針，然后與經(jīng)過(guò)標(biāo)記的樣本mirna雜交，再進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)。信號(hào)標(biāo)記的方法包括同位素標(biāo)記、熒光標(biāo)記和納米金標(biāo)記等。(2)mirna表達(dá)譜芯片原理同樣是使用標(biāo)記探針檢測(cè)固相支持物上的目標(biāo)分子。通過(guò)設(shè)計(jì)芯片上mirna基因及內(nèi)參序列，可精確分析出樣品中相應(yīng)mirna的表達(dá)水平?；蛐酒哂懈咄康膬?yōu)點(diǎn)，可以一次在同一樣本中檢測(cè)出幾百個(gè)基因的全部表達(dá)。luminex公司研制的液相芯片(liquidchip)又稱(chēng)多功能懸浮點(diǎn)陣(multianalytesuspensionarray，masa)，是出的新一代生物芯片技術(shù)。液相芯片體系由許多小球體為主要基質(zhì)構(gòu)成，每種小球體上固定有不同的探針?lè)肿?，為了區(qū)分不同的探針，每一種用于標(biāo)記探針的球形基質(zhì)都帶有一個(gè)獨(dú)特的色彩編號(hào)，將這些小球體懸浮于一個(gè)液相體系中，就構(gòu)成了液相芯片系統(tǒng)。該系統(tǒng)可以對(duì)同一個(gè)微量樣本中的多個(gè)不同分子同時(shí)進(jìn)行快速的定性、定量分析，這種檢測(cè)技術(shù)被稱(chēng)為fmap(flexiblemultianalyteprofiling)技術(shù)。分子雜交在懸浮溶液中進(jìn)行，檢測(cè)速度極快。(3)核酶保護(hù)分析技術(shù)(rpa)mirna的檢測(cè)還可以采用核酶保護(hù)分析技術(shù)，將標(biāo)記好的探針和待測(cè)rna樣本混合，熱變性后雜交，未雜交的rna和多余的探針用單鏈核酸酶消化，熱失活核酸酶后純化受保護(hù)的rna分子，最后通過(guò)變性page電泳分離探針，顯色。這種基于液相雜交的新方法簡(jiǎn)單快速，靈敏度高，但也只能用于分析已知mirna。(4)rake法rake法(rnaprimedarraybasedklenowemzyme)是在mirnamicroarray的基礎(chǔ)上利用dna聚合酶i的klenow片段，使mirna與固定的dna探針雜交的方法。rake可以敏感特異地檢測(cè)mirna，適用于大量快速的篩選所有己知的mirna。能夠在特定的細(xì)胞和腫瘤中檢測(cè)mirna表達(dá)譜情況。不僅如此，rake法還可以從由福爾馬林固定了的石蠟包埋的組織中分離出mirna并對(duì)其進(jìn)行分析，為從存檔標(biāo)本中分析mirna開(kāi)啟了希望之門(mén)。(5)原位雜交(insituhybridization)原位雜交技術(shù)可直觀了解mirna表達(dá)方式，是觀測(cè)mirna時(shí)空表達(dá)的一種較簡(jiǎn)便的方法，常標(biāo)記方式包括地高辛、生物素、熒光標(biāo)記等。鎖定核酸基礎(chǔ)上的原位雜交(lockednucleicacid(lna)basedinsituhybridization(lna-ish))是當(dāng)前應(yīng)用較多的探針?lè)绞健?6)基于微球的流式細(xì)胞術(shù)(bead-basedflowcytometry)是一種液相芯片技術(shù)，該方法將流式細(xì)胞檢測(cè)與芯片技術(shù)有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，兼有通量大、檢測(cè)速度快、靈敏度高和特異性好等特點(diǎn)。(7)實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)(real-timepcr，rt-pcr)熒光檢測(cè)pcr儀可對(duì)整個(gè)pcr過(guò)程中擴(kuò)增序列的累積速率繪制動(dòng)態(tài)變化曲線。在反應(yīng)混合體系中靶序列的起始濃度越大，要求獲得擴(kuò)增產(chǎn)物某特定產(chǎn)量的pcr循環(huán)數(shù)(一般用特定閾值循環(huán)數(shù)ct來(lái)表達(dá))越少。由于mirna長(zhǎng)度僅為22nt，傳統(tǒng)的qrt-pcr不適合擴(kuò)增如此短的片段?，F(xiàn)今有幾種用于mirna的實(shí)時(shí)定量pcr方法，如加尾法、頸環(huán)法等。頸環(huán)法是一種理想的mirna檢測(cè)qrt-pcr方法：首先設(shè)計(jì)特殊的莖環(huán)結(jié)構(gòu)引物，以待測(cè)mirna為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cdna第一鏈，該cdna一端為莖環(huán)狀引物，莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)被打開(kāi)便增加了cdna的長(zhǎng)度，隨后以合成的cdna為模板設(shè)計(jì)引物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量pcr擴(kuò)增。qrt-pcr具有特異性高、靈敏度好、快速簡(jiǎn)單等多種優(yōu)點(diǎn)。(8)測(cè)序法大部分已知的mirna都是通過(guò)cdna克隆測(cè)序發(fā)現(xiàn)和鑒定的。該法需要先構(gòu)建mirna的cdna文庫(kù)，再進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物隨后克隆到表達(dá)載體上測(cè)序。takada開(kāi)發(fā)了一種改進(jìn)的擴(kuò)增克隆法(mirnaamplificationprofiling，mrap)，mrap法先在mirna的3’端連上接頭，然后用與接頭互補(bǔ)的反轉(zhuǎn)錄引物反轉(zhuǎn)錄。因?yàn)樘囟ǖ姆崔D(zhuǎn)錄酶具有末端脫氧核苷酸酶活性，一些核苷酸(主要是脫氧胞苷酸)會(huì)連接到反轉(zhuǎn)錄出的cdna鏈的3’末端。當(dāng)5’端接頭與cdna鏈的poly(c)粘性末端退火后，加入一對(duì)共用引物即可實(shí)現(xiàn)對(duì)cdna的pcr擴(kuò)增。由于mrap高度靈敏，可以直接用克隆和測(cè)序技術(shù)檢測(cè)少量組織中mirna的表達(dá)量。標(biāo)簽序列克隆法是一種在在基因表達(dá)系列分析(sage)技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展了檢測(cè)效率更高的mirage(mirnasage)克隆法，該法通過(guò)生成大的串聯(lián)子，通過(guò)單個(gè)測(cè)序反應(yīng)可檢測(cè)多個(gè)mirna，明顯提高了檢測(cè)效率。高通量測(cè)序(high-throughputsequencing)又稱(chēng)下一代測(cè)序技術(shù)(nextgenerationsequencing)是對(duì)傳統(tǒng)測(cè)序一次革命性的改變，一次對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條dna分子進(jìn)行序列測(cè)定，極大提高了測(cè)序效率。這類(lèi)大規(guī)模測(cè)序技術(shù)極大的提高了多個(gè)物種遺傳信息的解讀速度，為獲取所有mirna的序列信息，解密mirna圖譜提供了保證。同時(shí)高通量測(cè)序使得對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能，所以又被稱(chēng)為深度測(cè)序(deepsequencing)。高通量測(cè)序平臺(tái)的代表是羅氏公司(roche)的454測(cè)序儀(rochgsflxsequencer)，illumina公司的solexa基因組分析儀(illuminagenomeanalyzer)和abi的solid測(cè)序儀(abisolidsequencer)。基于rna的microrna功能獲得性技術(shù)即通過(guò)外源性補(bǔ)充mirnas合成的前體物質(zhì)來(lái)升高mirnas的水平。例如，可以人工合成與內(nèi)源性mirna序列一致的短發(fā)夾樣rna(shorthairpinrna，shrna)，由聚合酶ii或iii做啟動(dòng)子，以病毒為載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，被dicer酶修飾后載入risc發(fā)揮作用，相當(dāng)于升高pre-mirna的水平，作用效果穩(wěn)定而持久?；蛱禺愋詍irmimics技術(shù)該技術(shù)避免了mirna與基因的非特異性作用。這種人工合成的與靶基因3’utr互補(bǔ)結(jié)合的特異性寡核苷酸鏈，能夠起到與mirna相同的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)作用。包含在本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物的藥劑學(xué)上許可的載體為在制劑時(shí)通常利用的載體，該載體包含乳糖(lactose)、右旋糖(dextrose)、蔗糖(sucrose)、山梨醇(sorbitol)、甘露醇(mannitol)、淀粉、阿拉伯橡膠、磷酸鈣、藻酸鹽(alginate)、凝膠(gelatin)、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)、纖維素(cellulose)、水、糖漿、甲基纖維素(methylcellulose)、羥基苯甲酸甲酯(methylhydroxybenzoate)、丙基羥基苯甲酸丙酯(propylhydroxybenzoate)、滑石、硬脂酸鎂(stearicacidmagnesium)及礦物油(mineraloil)等，但并非局限于此。本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物根據(jù)本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員可以容易實(shí)施的方法，利用藥劑學(xué)上能接受的載體和/或賦形劑來(lái)進(jìn)行制劑化，從而能夠以單位用量形態(tài)制備或者內(nèi)裝在多容量容器內(nèi)來(lái)制備。此時(shí)，劑型是油性或者水性介質(zhì)中的溶液、懸浮液或乳化液形態(tài)，或者也可以是浸膏劑、粉末劑、顆粒劑、片劑或者膠囊劑形態(tài)，還可以包括分散劑或者穩(wěn)定劑。附圖說(shuō)明圖1是mir-6087、mir-7976分別診斷肺腺癌的roc曲線圖圖2是mir-7705、mir-6744-5p分別診斷肺腺癌的roc曲線圖圖3是mir-7705和mir-6744-5p聯(lián)合診斷肺腺癌的roc曲線圖圖4是三種mirna聯(lián)合診斷肺腺癌的roc曲線圖具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照廠商所建議的條件實(shí)施檢測(cè)。實(shí)施例1樣品的收集4例肺腺癌組織及癌旁組織均來(lái)自北京友誼醫(yī)院2015年1月-2016年7月手術(shù)切除的標(biāo)本，所有標(biāo)本均在離體10分鐘以?xún)?nèi)放入液氮罐中，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中儲(chǔ)存。實(shí)施例2總rna提取1提取方法1)取80mg組織塊，加入800μllysis/binding緩沖液，使用勻漿器對(duì)組織塊進(jìn)行勻漿。勻漿的過(guò)程中樣品要置于冰上保持低溫狀態(tài)。2)再加入1/10體積homogenateadditive到上述已經(jīng)勻漿的組織樣品中，冰上放置10min。3)加入與lysis/binding緩沖液等量體積的水飽和酚，震蕩45s,10,000×g室溫離心5min。4)小心取出上清到新的試管中，加入1.25倍體積的無(wú)水乙醇，混勻后，移入純化柱中，10,000×g，離心15s，倒掉收集管中的液體。由于柱子的最大的體積只有700μl，因此重復(fù)此步操作，直到所有的上清都過(guò)濾完成。5)向離心柱子中加入700μlmirna洗脫液1，室溫，10,000×g，離心15s,倒掉收集液，換用新的收集管。6)再用500μl洗脫液2/3加入離心柱中，10,000×g，離心10s，重復(fù)這一步驟一次。7)離心1min，10,000×g，棄去多余的液體。8)將上述液體轉(zhuǎn)移到新的離心管，加100μl95℃預(yù)熱的depc處理30s，10,000×g，離心。9)使用nanodrop測(cè)定rna濃度和260nm/280nm的比值。10)得到的rna保存于-80℃冰箱。2提取標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定rna濃度和260nm/280nm的比值：總rna的純度要求是od260/od280值應(yīng)在1.8至2.2之間；rna完整性的檢測(cè)：用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)rna的完整性；根據(jù)測(cè)序公司的要求，小rna測(cè)序總量3μg以上，濃度在300ng/μl以上。實(shí)施例3測(cè)序及數(shù)據(jù)分析由測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序文庫(kù)的建立及上機(jī)測(cè)序，所使用的測(cè)序儀為illumina公司的hiseq2000測(cè)序儀。根據(jù)測(cè)序公司提供的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，fdr<0.001，log2(fc)絕對(duì)值>1，兩組count平均值之差大于100。對(duì)差異表達(dá)mirna人為挑選過(guò)濾中差異表達(dá)明顯的mirna，幾個(gè)之前從未被報(bào)道過(guò)的與肺腺癌相關(guān)的分子標(biāo)志物進(jìn)入我們的研究范圍，其中mir-6087、mir-7976在癌組織中表達(dá)低于癌旁組織，mir-7705、mir-6744-5p在癌組織中的表達(dá)量高于癌旁組織。實(shí)施例4real-timepcr檢測(cè)肺腺癌外周血樣本中mirna的表達(dá)1樣品采集：32例肺腺癌病人外周血樣本和24例健康對(duì)照外周血樣本均來(lái)自北京友誼醫(yī)院，患病組均是經(jīng)過(guò)病理檢測(cè)確診。2mirna提?。菏褂胹igma公司的genelutetm血漿/血清rna小量純化試劑盒(產(chǎn)品編號(hào)rnb500)，具體操作參照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)。3mirna逆轉(zhuǎn)錄表1rt體系組分濃度體積(μl)totalrna-1μgmiscripthispecbuffer5×4nucleicsmix10×2miscriptreversetranscriptasemix-2nuclease-freeh2o-補(bǔ)平至20abi9700型pcr儀上37℃保溫60min使逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)完全后，95℃5min終止反應(yīng)。加入80μlnuclease-freeh2o稀釋至100μl儲(chǔ)存在-20℃冰箱，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。4熒光定量pcr表2rt-pcr體系mirnas的表達(dá)檢測(cè)每次設(shè)置3個(gè)平行管反應(yīng)，microrna-specificprimer引物見(jiàn)表3，以通用的snrnau6作為內(nèi)參。表3microrna-specificprimer引物引物名稱(chēng)編號(hào)序列mir-6087引物seqidno9tgaggcgggggggcgagcmir-7976引物seqidno10tgccctgagacttttgctcmir-7705引物seqidno11aatagctcagaatgtcagttctgmir-6744-5p引物seqidno12tggatgacagtggaggcctpcr程序：95℃10min；40個(gè)循環(huán)(95℃10s，60℃30s)。循環(huán)結(jié)束后利用熔解曲線檢測(cè)產(chǎn)物特異性：從60℃緩慢升溫至97℃，每℃采集5次熒光信號(hào)。5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用originpro8.1軟件進(jìn)行分析。統(tǒng)計(jì)方法均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)，p<0.05(差異顯著)和p<0.01(差異非常顯著)定為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果顯示與健康對(duì)照相比，肺腺癌組mir-7705和mir-6744-5p顯著升高，分別約為對(duì)照組的2.5倍和4.7倍，而mir-6087和mir-7976略有降低，分別為對(duì)照組的0.65倍和0.6倍。rt-pcr結(jié)果與高通量數(shù)據(jù)分析結(jié)果一致。實(shí)施例5診斷效能的評(píng)價(jià)分析對(duì)于單個(gè)mirna分子或是診斷模型的效能評(píng)價(jià)的方法為建立受試者工作特征(receiveroperatingcharacteristic，roc)曲線，通過(guò)計(jì)算曲線下面積(areaundercurve)來(lái)判斷診斷的能力。我們將tcga數(shù)據(jù)庫(kù)中有關(guān)肺腺癌的數(shù)據(jù)下載，獲得數(shù)據(jù)集(包括46例對(duì)照組和519例病例組)，進(jìn)而進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，mir-6087、mir-7976、mir-7705和mir-6744-5p診斷肺腺癌的auc為0.452、0.460、0.755和0.318(見(jiàn)圖1和圖2)，除mir-7705和mir-6744-5p聯(lián)合診斷肺腺癌的auc為0.813外(見(jiàn)圖3)，其他mir-7705和其他mirna的組合auc值均小于單獨(dú)mir-7705的auc值，mir-7705、mir-6744-5p和mir-7976聯(lián)合診斷肺腺癌的auc為0.744(見(jiàn)圖4上)，mir-7705、mir-6744-5p和mir-6087聯(lián)合診斷肺腺癌的auc為0.768(見(jiàn)圖4下)。mir-6087、mir-7976、mir-7705和mir-6744-5p聯(lián)合診斷肺腺癌的auc為0.725。分析表明mir-7705和mir-6744-5p聯(lián)合診斷肺腺癌具有疊加效果。雖然已參考各種優(yōu)選實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，可進(jìn)行各種變化，并且可用等同物替代其組件而不背離本發(fā)明的基本范圍。此外，可進(jìn)行許多改動(dòng)來(lái)使特定情況或材料適合于本發(fā)明的教導(dǎo)而不背離其基本范圍。因此，本發(fā)明無(wú)意限定于本文中公開(kāi)的用于進(jìn)行本發(fā)明的特定實(shí)施方案；相反地，本發(fā)明意欲包括落在權(quán)利要求書(shū)范圍內(nèi)的所有實(shí)施方案。sequencelisting<110>北京泱深生物信息技術(shù)有限公司<120>肺腺癌相關(guān)的mirna、組合物及其應(yīng)用<160>12<170>patentinversion3.3<210>1<211>18<212>rna<213>人工序列<400>1ugaggcgggggggcgagc18<210>2<211>49<212>rna<213>人工序列<400>2ggugaggcgggggggcgagcccugaggggcucucgcuucuggcgccaag49<210>3<211>19<212>rna<213>人工序列<400>3ugcccugagacuuuugcuc19<210>4<211>66<212>rna<213>人工序列<400>4ugcccugagacuuuugcucuaauaauuuauucuaauaauaauuuagaucaaaagccucag60ggcaga66<210>5<211>23<212>rna<213>人工序列<400>5aauagcucagaaugucaguucug23<210>6<211>57<212>rna<213>人工序列<400>6aauagcucagaaugucaguucuguuuuaaguaacagaauugauaacugagcaaggaa57<210>7<211>19<212>rna<213>人工序列<400>7uggaugacaguggaggccu19<210>8<211>66<212>rna<213>人工序列<400>8ucacguggaugacaguggaggccuccuggaucucuaggucucagggccucucuugucauc60cugcag66<210>9<211>18<212>dna<213>人工序列<400>9tgaggcgggggggcgagc18<210>10<211>19<212>dna<213>人工序列<400>10tgccctgagacttttgctc19<210>11<211>23<212>dna<213>人工序列<400>11aatagctcagaatgtcagttctg23<210>12<211>19<212>dna<213>人工序列<400>12tggatgacagtggaggcct19當(dāng)前第1頁(yè)12