本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及l(fā)ncrna在肝癌診療中的應(yīng)用，具體的涉及l(fā)ncrnaensg00000267751。

背景技術(shù)：

肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位于我國惡性腫瘤發(fā)病率的第三位，死亡率位于腫瘤相關(guān)死亡率的第二位。目前，肝癌的治療技術(shù)不斷提升，如手術(shù)切除、肝移植、放化療等，手術(shù)治療是肝癌治療的主要手段，但大多數(shù)肝癌患者確診時已經(jīng)處于肝癌晚期，失去了手術(shù)治療的時機，而肝癌又缺乏其他有效的治療手段，導(dǎo)致肝癌的5年生存率較低。因發(fā)病機制的復(fù)雜性與不確定性導(dǎo)致肝癌缺乏有效的早期診斷手段和治療手段，目前尚不清楚肝癌發(fā)病的主要因素或重要因子，因而尚不能針對這些因素研發(fā)有效針對肝癌的治療藥物。系統(tǒng)的揭示肝癌的發(fā)病機制，明確肝癌細胞內(nèi)各分子之間的調(diào)控關(guān)系，尋找在肝癌發(fā)病過程中起重要作用的致病因子，對肝癌患者的早期診斷和有效治療肝癌藥物的研發(fā)，豐富肝癌的治療手段或者治療方式，提高肝癌患者的預(yù)后有著極其重要的意義。

lncrna是長度大于200個核苷酸的非編碼rna。在細胞所包含的rna中，lncrna所占的比例遠遠超過了人們所熟知的mrna，mirna等，lncrna所占的比例高達90％以上，而mrna只占到2％左右。近年來研究表明，lncrna在劑量補償效應(yīng)、表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等眾多生命活動中發(fā)揮重要作用，成為研究的熱點。越來越多的研究表明，lncrna在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著舉足輕重的作用，這無疑為揭示腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制帶來了新的希望。因此系統(tǒng)、深入的研究并闡明lncrna在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及分子機制對肝癌的早期診斷、分子靶向藥物的研發(fā)，治療手段的改善，患者生存率的提高有著深遠的意義。

基因芯片技術(shù)的應(yīng)用對于研究各類分子的表達譜有著明顯的優(yōu)勢，我們可以通過基因芯片篩技術(shù)快速、大規(guī)模、高通量的篩選出在疾病進展過程中差異表達基因。本發(fā)明通過1ncrna基因芯片技術(shù)分析10對肝癌組織及其配對癌旁組織中l(wèi)ncrna差異表達譜，初步篩選出肝癌組織與癌旁組織中差異表達的lncrna，然后通過qrt-pcr的方法對基因芯片的結(jié)果進行驗證，最終篩選出在肝癌發(fā)生、發(fā)展中起重要作用的lncrna。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的之一，提供一種診斷早期肝癌的產(chǎn)品，使患者在早期就得以治療，進而提高生存率和生活質(zhì)量。

本發(fā)明的目的之二，提供一種治療手段和藥物組合物，實現(xiàn)肝癌的精準分子治療。

本發(fā)明的目的之三，提供一種篩選治療肝癌的潛在藥物的方法，所述潛在藥物可以有效的降低ensg00000267751的表達水平。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了檢測ensg00000267751基因表達水平的試劑在制備診斷早期肝癌產(chǎn)品中的用途。

進一步，所述ensg00000267751在肝癌患者中表達上調(diào)。

進一步，所述試劑包括rt-pcr、實時定量pcr、原位雜交、northernblotting、芯片或高通量測序平臺檢測用試劑。

其中，所述用rt-pcr診斷肝癌的試劑至少包括一對特異擴增ensg00000267751基因的引物；所述用實時定量pcr診斷肝癌的試劑至少包括一對特異擴增ensg00000267751基因的引物；所述用原位雜交診斷肝癌的試劑包括：與ensg00000267751基因的核酸序列雜交的探針；所述用芯片診斷肝癌的試劑包括與ensg00000267751基因的核酸序列雜交的探針。

本發(fā)明提供了一種診斷早期肝癌的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品包括芯片、核酸膜條、或試劑盒；其中，所述芯片包括固相載體；以及固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括特異性地對應(yīng)于ensg00000267751的部分或全部序列；所述核酸膜條包括基底和固定于所述基底上的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括特異性地對應(yīng)于ensg00000267751的部分或全部序列；所述試劑盒包括可以檢測ensg00000267751表達水平的芯片、核酸膜條或pcr反應(yīng)試劑。

固相載體可采用基因芯片領(lǐng)域的各種常用材料，例如但不限于尼龍膜，經(jīng)活性基團(如醛基、氨基等)修飾的玻片或硅片、未修飾的玻片、塑料片等。

“探針”指能與另一分子的特定序列或亞序列或其它部分結(jié)合的分子。除非另有指出，術(shù)語“探針”通常指能通過互補堿基配對與另一多核苷酸(往往稱為“靶多核苷酸”)結(jié)合的多核苷酸探針。根據(jù)雜交條件的嚴謹性，探針能和與該探針缺乏完全序列互補性的靶多核苷酸結(jié)合。探針可作直接或間接的標記，其范圍包括引物。雜交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位雜交測定法。

所述探針具有與靶點基因的特定的堿基序列互補的堿基序列。這里，所謂“互補”，只要是雜交即可，可以不是完全互補。這些多核苷酸通常相對于該特定的堿基序列具有80％以上、優(yōu)選90％以上、更優(yōu)選95％以上、特別優(yōu)選100％的同源性。這些探針包括dna、rna、pna、zna、lna，及他們的組合，或其修飾之后的形式。該寡核苷酸探針也包括被修飾的寡核苷酸骨架。一些實例中，寡核苷酸探針至少包含連續(xù)的9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或者更多個與全長或部分靶標多核苷酸互補或者相同的核苷酸序列。一條寡核苷酸探針可能包含兩段或更多段互補序列。一些實例中，寡核苷酸探針的5’或3’末端有活性基團，比如氨基，用于將該探針連接到基底材料上。

探針可通過多種方式連接到微陣列芯片的基底材料上。這些方式包括但不限于已列出來的方式：(1)基于光刻技術(shù)的原位合成，例如affymetrix公司生產(chǎn)的高密度寡核苷酸陣列；(2)在玻璃、硅、尼龍或硝酸纖維上進行中低密度的點樣或者印制；(3)屏蔽選擇性合成；(4)在尼龍或硝酸纖維形成的雜交膜上打點雜交。寡核苷酸也可通過液相非共價鍵地固定到基底材料上，可利用微孔、微管道或毛細管等結(jié)構(gòu)形成液相環(huán)境。

進一步，所述pcr反應(yīng)試劑包括擴增ensg00000267751的引物，所述擴增ensg00000267751的引物序列如seqidno.5～6所示。

本發(fā)明中基因檢測試劑盒或基因芯片可用于檢測包括ensg00000267751基因在內(nèi)的多個基因(例如，與肝癌相關(guān)的多個基因)的表達水平，將肝癌的多個標志物同時進行檢測，可大大提高肝癌診斷的準確率。

本發(fā)明提供了一種ensg00000267751基因的用途，用于制備預(yù)防或治療肝癌的藥物組合物。

進一步，所述藥物組合物包括ensg00000267751功能性表達的抑制劑，所述抑制劑能夠抑制ensg00000267751或涉及ensg00000267751上游或下游途徑的物質(zhì)的表達。

進一步，所述抑制劑是針對ensg00000267751的sirna。

本發(fā)明提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包括ensg00000267751功能性表達的抑制劑，所述抑制劑可以在dna水平或rna(即基因產(chǎn)物)水平上起作用。

進一步，所述藥物組合物還包括與ensg00000267751功能性表達的抑制劑配伍的其他藥類以及藥學上可接受的載體和/或輔料。

進一步，所述載體包括(但并不限于)：稀釋劑、賦形劑如乳糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、淀粉、水等、填充劑如淀粉、蔗糖等；粘合劑如單糖漿、葡萄糖溶液、淀粉溶液、纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯烷酮；濕潤劑如甘油；崩解劑如干淀粉、海藻酸鈉、海帶多糖粉末、瓊脂粉末、碳酸鈣和碳酸氫鈉；吸收促進劑季銨化合物、十二烷基硫酸鈉等；表面活性劑如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸鈉、硬脂酸單甘油酯、十六烷醇等；致濕劑如甘油、淀粉等；吸附載體如淀粉、乳糖、斑脫土、硅膠、高嶺土和皂粘土等；潤滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣和鎂、聚乙二醇、硼酸粉末等。

本發(fā)明提供了一種ensg00000267751基因的用途，用于篩選預(yù)防或治療肝癌的潛在物質(zhì)。

進一步，篩選預(yù)防或治療肝癌潛在物質(zhì)的步驟包括：

候選物質(zhì)處理表達或含有ensg00000267751基因的體系；和

檢測所述體系中ensg00000267751基因的表達；

其中，若所述候選物質(zhì)可降低ensg00000267751基因的表達或活性(優(yōu)選顯著降低，如低20％以上，較佳的低50％以上，更佳的低80％以上)，則表明該候選物質(zhì)是預(yù)防或治療肝癌的潛在物質(zhì)。

進一步，上面所述的體系包括(但不限于)：細胞體系、亞細胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動物體系。

在本發(fā)明中，sirna可以包括部分純化的rna、相當純的rna、合成的rna、或重組產(chǎn)生的rna、以及通過添加、刪除、替換和/或改變一個或多個核苷酸而與天然存在的rna不同的經(jīng)改變了的rna。這樣的改變可以包括添加非核苷酸材料至例如sirna的末端(一個或多個)或至sirna的一個或多個內(nèi)部核苷酸，包括使sirna抵抗核酸酶消化的修飾。

本發(fā)明在篩選有效的sirna序列時，通過大量的比對分析，從而找出最佳的有效片段。在本發(fā)明的具體實施方式中，本發(fā)明人設(shè)計合成了多種sirna序列，并將它們分別通過轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染肝癌細胞系進行驗證，結(jié)果檢測出干擾效果較好的干擾分子，它們分別具有seqidno.13、seqidno.14所示的序列，進一步地在細胞水平實驗，結(jié)果證明對于細胞實驗而言抑制效率非常高。

本發(fā)明的核酸抑制物如sirna可以化學合成，也可以通過一個重組核酸結(jié)構(gòu)里的表達盒轉(zhuǎn)錄成單鏈rna之后進行制備。sirna等核酸抑制物，可通過采用適當?shù)霓D(zhuǎn)染試劑被輸送到細胞內(nèi)，或還可采用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)被輸送到細胞內(nèi)。

在本發(fā)明中，藥物組合物可以使用不同的添加劑進行制備，例如緩沖劑、穩(wěn)定劑、抑菌劑、等滲劑、螯合劑、ph控制劑及表面活性劑。

緩沖劑可以包括硼酸、磷酸、乙酸、檸檬酸、谷氨酸及相應(yīng)的鹽(它們的堿金屬或堿性稀土金屬鹽，例如鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽及鎂鹽)。等滲劑包括氯化鉀、氯化鈉、糖及甘油。螯合劑包括乙二胺四乙酸鈉及檸檬酸。抑菌劑包括但不限于有效濃度(例如<1％w/v)的芐醇、苯酚、間甲酚、氯丁醇、對羥基苯甲酸甲酯和/或?qū)αu基苯甲酸丙酯。穩(wěn)定劑包括人類血清蛋白、l-氨基酸、糖及纖維素衍生物。l-氨基酸還可以包括甘氨酸、半胱氨酸及谷氨酸中的任意一個。糖類包括單糖，例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖等；糖醇，例如甘露醇、纖維醇、木糖醇等；二糖，例如蔗糖、麥芽糖、乳糖等；多聚糖，例如葡聚糖、羥丙基淀粉、硫化軟骨素、透明質(zhì)酸等及它們的衍生物。纖維素衍生物包括甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙甲基纖維素及羥甲基纖維素鈉。表面活性劑包括離子或非離子表面活性劑，例如聚氧化乙烯烷基酯、山梨聚糖單?；ァ⒅舅岣视王?。

本發(fā)明的藥物還可包括藥學上可接受的涂層材料包括(但不限于)，快速分解涂層材料、染色劑、腸溶性聚合物、增塑劑、水溶性聚合物、水不溶性聚合物、染料、色素、其他崩散劑。常見快速分解涂層材料包括opadry；腸溶性聚合物包括甲基內(nèi)烯酸聚合物、磷羥丙甲基纖維素苯二甲酸酯、羥丙甲基纖維素乙酸酯、羥丙甲基纖維素琥珀酸酯、羥甲乙基纖維素、乙酰磷苯二甲酸纖維素；增塑劑包括聚乙二醇(peg)、丙二醇等。

本發(fā)明所述的藥物組合物可口服給藥、非胃腸道給藥、通過吸入噴霧給藥、局部給藥、直腸給藥、鼻給藥、頰給藥、陰道給藥或通過植入的貯藥裝置給藥。優(yōu)選口服給藥或注射給藥。本發(fā)明的藥物組合物可含有任何常用的無毒可藥用載體、輔料或賦形劑。在某些情況下，藥用酸、堿或緩沖劑可用來調(diào)節(jié)制劑的ph以提高所配制的化合物或其給藥劑型的穩(wěn)定性。本文所用術(shù)語非胃腸道包括皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、動脈內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞠內(nèi)、損傷部位內(nèi)、和顱內(nèi)注射或輸注技術(shù)。只要能達到目標組織，本發(fā)明所述藥物組合物可以通過任何途徑給予受體。

本發(fā)明藥物組合物可以以任何口服劑型的形式口服給藥，包括但不限于膠囊、片劑、乳劑和水懸浮液、分散劑和溶液。對于口服片劑，常用載體包括乳糖和玉米淀粉。一般還加入潤滑劑例如硬脂酸鎂。為了以膠囊形式口服給藥，適用的稀釋劑包括乳糖和無水玉米淀粉。當口服施用水懸浮液和/或乳液時，可將活性組分懸浮或溶解在油相中，并與乳化劑和/或懸浮劑合并。如果需要的話，可加入一些甜味劑和/或矯味劑和/或著色劑。適當時，可將用于口服給藥的劑量單位制劑包微囊。例如，通過在聚合物、蠟等中將顆粒物質(zhì)包衣或包埋，也可制備所述制劑已延長或維持釋放。本發(fā)明的藥物組合物可以用于降低內(nèi)源性的ensg00000267751過表達，通過降低ensg00000267751的表達，從而治療因ensg00000267751表達上調(diào)導(dǎo)致的肝癌。

在本發(fā)明中，可將抑制ensg00000267751表達的化合物作為裸rna與遞送試劑一起作為核酸(如重組質(zhì)?；虿《据d體)給受試者施用，所述核酸包含抑制ensg00000267751表達的序列。遞送試劑可以是親脂試劑、聚陽離子、脂質(zhì)體、微囊等。

脂質(zhì)體可由多種磷脂形成，如膽甾醇、硬脂基胺或磷脂酰膽堿。脂質(zhì)體可以增加基因產(chǎn)物或核酸的血液半衰期?？蓮臉藴实男纬尚∧遗莸闹|(zhì)(其通常包括中性或帶負電荷的磷脂和固醇例如膽固醇)形成用于本發(fā)明的合適的脂質(zhì)體。通常，通過考慮入目的脂質(zhì)體的大小和血流中直追半衰期等因素，指導(dǎo)脂質(zhì)的選擇。

用于本發(fā)明的脂質(zhì)體可包含將脂質(zhì)體靶向細胞的配體分子。結(jié)合癌細胞中普遍存在的受體的配體例如結(jié)合腫瘤細胞抗原的單克隆抗體是優(yōu)選的。還可對用于本發(fā)明的脂質(zhì)體進行修飾，以避免被單核巨噬細胞系統(tǒng)和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除。此類修飾的脂質(zhì)體具有存在于表面上或整合入脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)中的調(diào)理作用抑制部分。優(yōu)選的，脂質(zhì)體可包含調(diào)理作用抑制部分和配體兩者。

本發(fā)明的藥物還可與其他治療肝癌的藥物聯(lián)用，其他治療性化合物可以與主要的活性成分同時給藥，甚至在同一組合物中同時給藥。還可以以單獨的組合物或與主要的活性成分不同的劑量形式單獨給予其它治療性化合物。主要成分的部分劑量可以與其它治療性化合物同時給藥，而其它劑量可以單獨給藥。在治療過程中，可以根據(jù)癥狀的嚴重程度、復(fù)發(fā)的頻率和治療方案的生理應(yīng)答，調(diào)整本發(fā)明藥物組合物的劑量。

本發(fā)明藥物組合物可以局部給藥的藥物組合物，可以配制成軟膏、乳膏劑、混懸劑、洗劑、散劑、溶液劑、糊劑、凝膠劑、噴霧劑、氣霧劑或油劑。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，本發(fā)明的實用性并不局限于對本發(fā)明的標志物基因的任何特定變體的基因表達進行定量。在人類中，該基因具有4個注釋轉(zhuǎn)錄本(或剪接變體)：長721bp的ac009005.2-004(ensembl中的轉(zhuǎn)錄本id為enst00000589457.2)、長625bp的ac009005.2-001(ensembl中的轉(zhuǎn)錄本id為enst00000588908.5)、長509bp的ac009005.2-002(ensembl中的轉(zhuǎn)錄本id為enst00000590292.5)、長469bp的ac009005.2-003(ensembl中的轉(zhuǎn)錄本id為enst00000588290.3)。在具體的實施方案中，ensg00000267751基因產(chǎn)物指長轉(zhuǎn)錄物。作為非限制性的實例，標志物基因可具有seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3或seqidno.4指定的cdna序列。在一些實施方案中，其具有與所列的序列至少70％相同或相似的cdna序列，諸如上述所列的序列至少75％、80％、85％90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％相同或相似的cdna序列。

在本發(fā)明中，關(guān)于ensg00000267751的“功能性表達”，意指功能性基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。對于像ensg00000267751的非蛋白編碼基因，“功能性表達”可以在至少兩個水平上失調(diào)。第一，在dna水平上，例如通過基因的缺失或破壞，或者是沒有轉(zhuǎn)錄發(fā)生(在兩種情況下都阻止相關(guān)基因產(chǎn)物的合成)。轉(zhuǎn)錄的缺失可以例如由表觀遺傳的變化(例如dna甲基化)或由功能缺失性突變導(dǎo)致。。如本文中所使用的“功能缺失”或“l(fā)of”突變是，相對于賦予蛋白質(zhì)增強的或新的活性的功能獲得性突變而言，阻止、減少或消除基因產(chǎn)物的功能的突變。功能性缺失可由廣泛的突變類型引起，包括但不限于整個基因或基因部分的刪除、剪接位點突變、由小的插入和刪除引起的移碼突變、無義突變、取代了必需氨基酸的錯義突變、和阻止產(chǎn)物的正確細胞定位的突變。該定義也包括ensg00000267751基因的啟動子或調(diào)控區(qū)域的突變，如果這些突變干擾了基因的功能。無效突變是完全破壞基因產(chǎn)物功能的lof突變。一個等位基因中的無效突變通常將使表達水平降低50％但可能對基因產(chǎn)物的功能具有嚴重影響。值得注意的是，功能性表達也可以因為功能獲得性突變而失調(diào)：通過賦予蛋白質(zhì)新的活性，蛋白質(zhì)的正常功能失調(diào)，表達的功能活性蛋白減少。反之亦然，功能性表達可以例如通過基因復(fù)制或通過缺乏dna甲基化而增加。功能性表達也可以因為功能獲得性突變而失調(diào)：通過賦予蛋白質(zhì)新的活性，蛋白質(zhì)的正常功能失調(diào)，表達的功能活性蛋白減少。反之亦然，功能性表達可以例如通過基因復(fù)制或通過缺乏dna甲基化而增加。

第二，在rna水平上，例如通過缺乏有效的翻譯，例如因為mrna的不穩(wěn)定(例如通過utr變體)，可以導(dǎo)致在轉(zhuǎn)錄物翻譯之前mrna被降解。或者通過缺乏有效的轉(zhuǎn)錄，例如因為突變誘導(dǎo)了新的剪接變體。

本發(fā)明的藥物組合物可以按藥劑學上有效的量進行給藥，本發(fā)明的用語“藥劑學上有效的量”指的是以可適用于醫(yī)學治療或預(yù)防的合理的受惠/危險比率足以治療或預(yù)防疾病的量，可根據(jù)包括疾病的嚴重程度、藥物的活性、患者的年齡、體重、健康、性別、患者對藥物的敏感度、所使用的本發(fā)明組合物的給藥時間、給藥途徑及排出比率、治療時間、與所使用的本發(fā)明的組合物配合或同時使用的藥物的要素及其它醫(yī)學領(lǐng)域中公知的要素來決定有效用量水平。本發(fā)明的藥物組合物可作為單獨的治療劑進行給藥，或是與其它治療劑并用地進行給藥，可以與以往的治療劑依次地或同時地進行給藥。此外，可單次或多次地進行給藥。重要的是，需要對上述要素均加以考慮，并且以無副作用的最少的量可取得最大效果的量進行給藥。

本發(fā)明中，術(shù)語“治療”是指不以治愈為目的，而是減緩(減少)靶定的病理狀況或病癥或防止復(fù)發(fā)。如果接受治療有效量的治療劑之后，患者成功地被“治療”，患者顯示出可觀測到的和/或可度量的一種或多種特定疾病的跡象和癥狀的減少或消失。例如，癌細胞數(shù)目顯著減少或癌細胞消失，減少腫瘤尺寸；抑制(即，在某種程度上減緩，及優(yōu)選地停止)腫瘤轉(zhuǎn)移；某種程度上抑制腫瘤生長；使在一定程度上減少和/或減輕與特定癌癥相關(guān)聯(lián)的一種或多種癥狀的時間增加；減少的發(fā)病率和死亡率，以及改善生活質(zhì)量。疾病的跡象或癥狀的減輕能夠為患者感知。治療可以實現(xiàn)完全反應(yīng)—定義為癌癥的所有跡象消失，或部分反應(yīng)—腫瘤尺寸減小，優(yōu)選減小的比例超過50％、更優(yōu)選75％。如果患者感受到疾病穩(wěn)定，患者也被視為得到治療。

本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果：

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了一種與肝癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的lncrna，通過檢測該lncrna的表達水平即可對早期肝癌進行檢測，從而對早期肝癌患者進行治療，提高患者的生存質(zhì)量。

本發(fā)明提供了一種精準醫(yī)療手段和藥物組合物，通過抑制患者中ensg00000267751的表達水平，從而治療肝癌患者。

附圖說明

圖1是利用qpcr檢測ensg00000267751在肝癌患者中的表達情況圖；

圖2是利用tcga數(shù)據(jù)庫交叉驗證ensg00000267751在肝癌患者中的差異表達圖；

圖3是ensg00000267751在肝癌患者中的roc曲線圖；

圖4是檢測ensg00000267751在肝癌細胞中的表達情況圖；

圖5是檢測轉(zhuǎn)染sirna對肝癌細胞中ensg00000267751的表達影響圖；

圖6是利用cck8檢測ensg00000267751對細胞增殖的影響圖；

圖7是檢測ensg00000267751對細胞的克隆形成集落的影響圖；

圖8是檢測ensg00000267751對肝癌細胞凋亡的影響圖；

圖9是transwell小室檢測ensg00000267751基因?qū)Ω伟┘毎w移和侵襲的影響圖；其中，圖a是ensg00000267751基因?qū)Ω伟┘毎w移的影響圖，圖b是ensg00000267751基因?qū)Ω伟┘毎w移的影響圖。

具體的實施方式

下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實施例1篩選與肝癌相關(guān)的基因標志物

1、樣品收集

各收集10例肝癌患者的癌組織以及癌旁組織，患者均知情同意，上述所有標本的取得均通過組織倫理委員會的同意。

2、rna樣品的制備

利用qiagen的組織rna提取試劑盒進行組織rna的提取，具體步驟按說明書操作。

3、逆轉(zhuǎn)錄和標記

用lowrnainputlinearamplificationkit將mrna逆轉(zhuǎn)錄成cdna，同時用cy3分別標記實驗組和對照組。

4、雜交

基因芯片采用康城生物-humanlncrnaarray，按芯片使用說明書的步驟進行雜交。

5、數(shù)據(jù)處理

雜交后芯片用agilent掃描儀掃描,分辨率為5μm，掃描儀自動以100％和10％pmt各掃描1次，2次結(jié)果agilent軟件自動合并。掃描圖像數(shù)據(jù)采用featureextraction進行處理分析，得到的原始數(shù)據(jù)應(yīng)用bioconductor程序包進行后續(xù)數(shù)據(jù)處理。差異基因篩選標準：fdr<0.01，abs(log2fc)>1.5。

6、結(jié)果

與癌旁組織相比，ensg00000267751在肝癌組織中的表達水平顯著上調(diào)。

實施例2qpcr測序驗證ensg00000267751基因的差異表達

1、對ensg00000267751基因差異表達進行大樣本qpcr驗證。按照實施例1中的樣本收集方式收集肝癌組織和癌旁組織樣本各60例。

2、rna提取步驟同實施例1。

3、逆轉(zhuǎn)錄：

采用25μl反應(yīng)體系，每個樣品取1μg總rna作為模板rna，在pcr管中分別加入以下組分：depc水，5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，10mmdntp，0.1mmdtt，30μmoligodt，200u/μlm-mlv，模板rna。42℃孵育1h，72℃10min，短暫離心。

(3)qpcr擴增檢驗

引物設(shè)計：

ensg00000267751基因的引物序列為：

正向引物：5’-atgctactcttccctttg-3’(seqidno.5)

反向引物：5’-gtcctcctcattgtcatc-3’(seqidno.6)

管家基因gapdh的引物序列為：

正向引物：5’-ccgggaaactgtggcgtgatgg-3’(seqidno.7)

反向引物：5’-aggtggaggagtgggtgtcgctgtt-3’(seqidno.8)

采用25μl反應(yīng)體系，每個樣本設(shè)置3個平行管，所有擴增反應(yīng)均重復(fù)三次以上以保證結(jié)果的可靠性。

配制以下反應(yīng)體系：sybrgreen聚合酶鏈式反應(yīng)體系12.5μl，正反向引物(5μm)各1μl，模板cdna2.0μl，無酶水8.5μl。各項操作均于冰上進行。

擴增程序為：95℃60s，(95℃15s，60℃15s，72℃45s)×35個循環(huán)。

以sybrgreen作為熒光標記物，在lightcycler熒光實時定量pcr儀上進行pcr反應(yīng)，通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，δδct法進行相對定量。

3、統(tǒng)計學方法

實驗都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標準差的方式來表示，采用spss18.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗，認為當p<0.05時具有統(tǒng)計學意義。

4、結(jié)果

結(jié)果如圖1所示，與癌旁組織相比，ensg00000267751基因在肝癌組織中表達上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)，同rna-sep結(jié)果一致。

實施例3分析ensg00000267751在tcga數(shù)據(jù)庫中的表達情況

1、數(shù)據(jù)收集

從tcga數(shù)據(jù)庫中收集200例肝癌組織和50例癌旁組織的lncrna表達譜數(shù)據(jù)，分析ensg00000267751在肝癌組織和癌旁組織中的表達水平；繪制箱形圖。

2、roc曲線分析

使用r語言中的proc包分析ensg00000267751的受試者工作特征，計算二項精確置信空間，繪制roc曲線。

3、結(jié)果

ensg00000267751的表達水平如圖2所示，相比對照組，ensg00000267751在肝癌組織中表達顯著上調(diào)。

ensg00000267751的roc曲線如圖3所示，ensg00000267751的auc值高達0.8785，且具有較高的特異性和敏感性，說明ensg00000267751應(yīng)用于肝癌的診斷具有較高的準確性。

實施例4ensg00000267751基因在肝癌細胞系中的差異表達

1、細胞培養(yǎng)

人肝癌細胞株hepg2、huh7和正常肝細胞系hl-7702，以含10％胎牛血清和1％p/s的培養(yǎng)基dmem在37℃、5％co2、相對濕度為90％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-3天換液1次，使用0.25％含edta的胰蛋白酶常規(guī)消化傳代。

2、rna的提取

1)當細胞達80-90％融合時終止培養(yǎng)，0.25％胰蛋白酶消化收集細胞于1.5m1ep管中，每管中加入lm1trizol緩慢搖動破碎細胞，冰上放置10min。

2)去蛋白，去dna：每個1.5m1ep管加入0.2ml三氯甲烷，搖晃15s，室溫放置10min。4℃，12000rpm離心15min。

剩余操作步驟同組織中rna提取過程。

3、逆轉(zhuǎn)錄

具體步驟同實施例2.

4、統(tǒng)計學方法

實驗都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標準差的方式來表示，采用spss18.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗，認為當p<0.05時具有統(tǒng)計學意義。

5、結(jié)果

結(jié)果如圖4所示，與正常肝細胞系相比，ensg00000267751基因在肝癌細胞hepg2、huh7中表達均上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)，同rna-sep結(jié)果一致。

實施例5ensg00000267751基因的沉默

1、細胞培養(yǎng)

人肝癌細胞株hepg2，以含10％胎牛血清和1％p/s的培養(yǎng)基dmem在37℃、5％co2、相對濕度為90％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-3天換液1次，使用0.25％含edta的胰蛋白酶常規(guī)消化傳代。

2、sirna設(shè)計

針對ensg00000267751基因的sirna序列：

陰性對照sirna序列(sirna-nc)：

正義鏈為5’-uucuccgaacgugucacgu-3’(seqidno.9)，

反義鏈為5’-acgugacacguucggagaa-3’(seqidno.10)；

sirna1：

正義鏈為5’-acagaaugggauccaaauggg-3’(seqidno.11)，

反義鏈為5’-cauuuggaucccauucuguuu-3’(seqidno.12)；

sirna2：

正義鏈為5’-uaguaaaacaauuaagaugac-3’(seqidno.13)，

反義鏈為5’-caucuuaauuguuuuacuauu-3’(seqidno.14)；

sirna3：

正義鏈為5’-agaacaaagggaagaguagca-3’(seqidno.15)，

反義鏈為5’-cuacucuucccuuuguucuug-3’(seqidno.16)

將細胞按2×10⁵/孔接種到六孔細胞培養(yǎng)板中，在37℃、5％co2培養(yǎng)箱中細胞培養(yǎng)24h；

在無雙抗、含10％fbs的dmem培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑2000(購自于invitrogen公司)的說明書轉(zhuǎn)染。

實驗分為空白對照組(hepg2)陰性對照組(sirna-nc)和實驗組(20nm)(sirna1、sirna2、sirna3)，其中陰性對照組sirna與ensg00000267751基因的序列無同源性，濃度為20nm/孔，同時分別進行轉(zhuǎn)染。

3、qpcr檢測ensg00000267751基因的表達水平

3.1細胞總rna的提取

具體步驟同實施例4。

3.2逆轉(zhuǎn)錄步驟同實施例2。

3.3qpcr擴增步驟同實施例2。

4、統(tǒng)計學方法

實驗都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標準差的方式來表示，采用spss18.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，干擾ensg00000267751基因表達組與對照組之間的差異采用t檢驗，認為當p<0.05時具有統(tǒng)計學意義。

5、結(jié)果

結(jié)果如圖5顯示，相比hepg2、轉(zhuǎn)染空載sirna-nc、sirna1、sirna3組，sirna2組能夠顯著降低ensg00000267751的表達，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。

實施例6cck8檢測細胞增殖實驗

1、細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染步驟同實施例4

2、cck8檢測細胞增殖

1)將對數(shù)增殖期的hepg2細胞接種于96孔板，每孔2×10³個細胞；

2)實驗分三組，分別是空白對照組、轉(zhuǎn)染sirna-nc組和轉(zhuǎn)染sirna1，每組設(shè)6個復(fù)孔；

3)分別在轉(zhuǎn)染0h、24h、48h、72h后加入10μl/孔cck8試劑；

4)2h后使用酶標儀檢測a450的吸光值。

3、統(tǒng)計學方法

實驗都是按照重復(fù)3次來完成的，采用spss18.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析，兩者之間的差異采用t檢驗，認為當p<0.05時具有統(tǒng)計學意義。

4、結(jié)果

圖6所示的結(jié)果顯示：空白對照組同空載組無明顯差異，而轉(zhuǎn)染sirna2組的細胞生長速度明顯低對照組的細胞生長速度，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)，上述結(jié)果表明ensg00000267751的表達能夠促進肝癌細胞的生長。

實施例7軟瓊脂克隆形成實驗

1、用0.25％胰蛋白酶消化處于對數(shù)生長期的細胞，輕輕吹打使之成為單細胞懸液，離心收集細胞沉淀。

2、用含20％胎牛血清的dmem完全培養(yǎng)基重懸，適當稀釋后計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為5×10³個/ml。

3、制備兩個濃度分別為1.2％和0.7％的低溶點瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持在40℃水浴中。

4、1.2％的瓊脂糖和2×dmem培養(yǎng)基1:1混合，加入2×抗生素和20％的小牛血清，取3ml混合液注入直徑6cm平皿中放置5min冷卻凝固，作為底層瓊脂置于co2溫箱中備用。

5、在無菌試管中1:1混合0.7％的瓊脂糖和2×dmem培養(yǎng)基，再向管中加入0.2ml濃度為5×10³個/ml的穩(wěn)定感染細胞懸液，充分混勻，注入上述平皿中，逐漸形成雙瓊脂層，每個實驗組重復(fù)4個樣本。

6、待上層瓊脂凝固后，置入37℃5％co2溫箱中培養(yǎng)，每3天加培養(yǎng)基1.5ml。

7、培養(yǎng)14天后取出培養(yǎng)皿，用1ml濃度為0.005％的龍膽紫染色90min。把平皿放置在倒置顯微鏡下觀察，每組細胞隨機選取10個低倍視野，鏡下技術(shù)形成的細胞克隆數(shù)。

8、結(jié)果

結(jié)果如圖7所示，與對照組相比，轉(zhuǎn)染sirna2的細胞組單細胞克隆集落形成數(shù)顯著降低。

實施例8ensg00000267751基因?qū)Ω伟┘毎蛲龅挠绊?/p>

使用流式細胞儀檢測ensg00000267751基因?qū)毎蛲龅挠绊憽?/p>

1、細胞培養(yǎng)步驟同實施例4。

2、細胞轉(zhuǎn)染步驟同實施例5。

3、步驟

1)將3m110×上樣緩沖液用27m1蒸餾水稀釋。

2)收集細胞樣本并用預(yù)冷的pbs清洗。

3)將細胞加入lml1×上樣緩沖液，300g離心10min，吸出緩沖液。

4)再次加入lml1×上樣緩沖液，將細胞懸液中細胞濃度調(diào)整為1×10⁶個/ml。

5)將細胞懸液取出100μ1，加入ep管中。

6)將5μl的annexinvfitc加入ep管中，混勻ep管中的液體，在室溫下避光孵育10min。

7)向ep管中加入5μ1pi染液，在室溫下避光5min。

8)在ep管中加入500μl的pbs溶液，輕輕混勻，1h內(nèi)上流式細胞儀進行檢測。

3、統(tǒng)計學方法

實驗都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標準差的方式來表示，采用spss18.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用的t檢驗，認為當p<0.05時具有統(tǒng)計學意義。

4、結(jié)果：

結(jié)果如圖8所示，實驗組與對照組相比，細胞凋亡率無顯著的變化(p<0.05)，該結(jié)果說明，ensg00000267751對肝癌細胞的凋亡無明顯的影響。

實施例9細胞遷移及侵襲實驗

1、transwell小室制備

無菌條件下matrigel冰浴融化，用pbs進行20倍稀釋，以50μl/孔的體積鋪在transwell小室的聚碳酸酯膜上。37℃放置4h，待matrigel膠聚合成凝膠后取出，輕輕吸出上層析出液。每孔中加入50μl的含bsa的無血清培養(yǎng)液對基底膜進行水化處理，37℃放置30min。

2、配置細胞懸液

細胞撤血清饑餓處理12-24h，對細胞進行消化處理，終止消化后進行離心，去除上層培養(yǎng)液。用pbs對沉淀細胞進行清洗，加入含有bsa的無血清培養(yǎng)基對其進行重懸。調(diào)整細胞的密度至5×l0⁵個/ml。

3、細胞接種

取細胞懸液200μ1(遷移實驗為100μ1，侵襲實驗為200μ1)加入到transwell小室中。在24孔板下室加入500μ1含fbs的1640培養(yǎng)基。把細胞放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

4、染色

細胞在培養(yǎng)結(jié)束后使用dapi染色。把小室細胞先用pbs漂洗2遍，放入dapi工作液中室溫染色5-20min。用pbs漂洗2遍，放入熒光顯微鏡下觀察并計數(shù)。

5、結(jié)果

結(jié)果如圖9所示，在肝癌細胞轉(zhuǎn)染干擾rna之后，與對照組相比，實驗組的遷移及侵襲能力均有明顯下降，結(jié)果說明ensg00000267751能夠促進肝癌細胞的遷移及侵襲。

上述實施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當指出，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。

sequencelisting

<110>北京泱深生物信息技術(shù)有限公司

<120>lncrna在肝癌診療中的應(yīng)用

<160>16

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>721

<212>dna

<213>人源

<400>1

cgtgtgctctggagattgcatcccacgcaggcagcccccttccgtacaagtaaagtggtc60

tcgctgagaaattttctaagtgctggtttctctttgcgggaccgactcgccgcccccaaa120

tatcccatttggatcccattctgtttcaggagaggctggcggttacctttcttggggaga180

cgcgtccgactgcttcattgtgggggcctcaggagcggaggatcgggtcccgcccgaggt240

gacgcgtaaacccagactctcagcaacgcgggtaggaaggacccttgaagttccgcggcg300

accacgtcggctgaaaccagcagcccaggacaagtggaccagccagcaagacccagacca360

tccaaaccggctgatcctacgacaggacccagatgccagtgaaagtgaccacagccctgc420

tctagtcaccccggaagctgaccagtctacgcacggccgaagcttcgtcaaggaagtaaa480

tgtagttagaaatcttaagcccagtaattttccttgtcatcttaattgttttactattaa540

cctgtcgctttgctcaaccccctcctctgggcaaacatctcttgtccatcctaggtacaa600

acatgctactcttccctttgttcttgctgctctcgctagatctatgtcagaaggagggat660

atgcggagagtttaatttaactaattgttgcctaaaaatcgatgacaatgaggaggacgt720

c721

<210>2

<211>625

<212>dna

<213>人源

<400>2

tggagattgcatcccacgcaggcagcccccttccgtacaagagaggctggcggttacctt60

tcttggggagacgcgtccgactgcttcattgtgggggcctcaggagcggaggatcgggtc120

ccgcccgaggtgacgcgtaaacccagactctcagcaacgcgggtaggaaggacccttgaa180

gttccgcggcgaccacggaactgtgccttcgatctccacagtcggctgaaaccagcagcc240

caggacaagtggaccagccagcaagacccagaccatccaaaccggctgatcctacgacag300

gacccagatgccagtgaaagtgaccacagccctgctctagtcaccccggaagctgaccag360

tctacgcacggccgaagcttcgtcaaggaagtaaatgtagttagaaatcttaagcccagt420

aattttccttgtcatcttaattgttttactattaacctgtcgctttgctcaaccccctcc480

tctgggcaaacatctcttgtccatcctaggtacaaacatgctactcttccctttgttctt540

gctgctctcgctagatctatgtcagaaggagggatatgcggagagtttaatttaactaat600

tgttgcctaaaaatcgatgacaatg625

<210>3

<211>509

<212>dna

<213>人源

<400>3

gagattgcatcccacgcaggcagcccccttccgtacaagagaggctggcggttacctttc60

ttggggagacgcgtccgactgcttcattgtgggggcctcaggagcggaggatcgggtccc120

gcccgaggtgacgcgtaaacccagactctcagcaacgcgggtaggaaggacccttgaagt180

tccgcggcgaccacgtcggctgaaaccagcagcccaggacaagtggaccagccagcaaga240

cccagaccatccaaaccggctgatcctacgacaggacccagatgccagtgaaagtgacca300

cagccctgctctagtcaccccggaagctgaccagtctacgcacggccgaagcttcgtcaa360

ggaagtaaatgtagttagaaatcttaagcccagtaattttccttgtcatcttaattgttt420

tactattaacctgtcgctttgctcaaccccctcctctgggcaaacatctcttgtccatcc480

taggtacaaacatgctactcttccctttg509

<210>4

<211>469

<212>dna

<213>人源

<400>4

tgtggctcacgtctgtactcccagagccttgggaggtcgaggcgggaagatcgcttgagc60

ccgggagctcgagaccagacgcggcaacatggcgagacgcacatctctgcctttaaaaat120

gagaggctggcggttacctttcttggggagacgcgtccgactgcttcattgtgggggcct180

caggagcggaggatcgggtcccgcccgaggtgacgcgtaaacccagactctcagcaacgc240

gggtaggaaggacccttgaagttccgcggcgaccacgtcggctgaaaccagcagcccagg300

acaagtggaccagccagcaagacccagaccatccaaaccggctgatcctacgacaggacc360

cagatgccagtgaaagtgaccacagccctgctctagtcaccccggaagctgaccagtcta420

cgcacggccgaagcttcgtcaaggaagtaaatgtagttagaaatcttaa469

<210>5

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

atgctactcttccctttg18

<210>6

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

gtcctcctcattgtcatc18

<210>7

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

ccgggaaactgtggcgtgatgg22

<210>8

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

aggtggaggagtgggtgtcgctgtt25

<210>9

<211>19

<212>rna

<213>人工序列

<400>9

uucuccgaacgugucacgu19

<210>10

<211>19

<212>rna

<213>人工序列

<400>10

acgugacacguucggagaa19

<210>11

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<400>11

acagaaugggauccaaauggg21

<210>12

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<400>12

cauuuggaucccauucuguuu21

<210>13

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<400>13

uaguaaaacaauuaagaugac21

<210>14

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<400>14

caucuuaauuguuuuacuauu21

<210>15

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<400>15

agaacaaagggaagaguagca21

<210>16

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<400>16

cuacucuucccuuuguucuug21