本發(fā)明屬于氨基酸制備
技術領域：
，具體涉及一種精制谷氨酸的發(fā)酵工藝。
背景技術：
：谷氨酸，是一種酸性氨基酸。分子內含兩個羧基，化學名稱為α-氨基戊二酸。谷氨酸是里索遜1856年發(fā)現(xiàn)的，為無色晶體，有鮮味，微溶于水，而溶于鹽酸溶液，等電點3.22。大量存在于谷類蛋白質中，動物腦中含量也較多。谷氨酸在生物體內的蛋白質代謝過程中占重要地位，參與動物、植物和微生物中的許多重要化學反應。味精由谷氨酸制備而得。谷氨酸棒桿菌是微生物工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸的主要菌株。人們一直通過各種方法改造菌株以提高氨基酸的產(chǎn)量，早期應用最廣泛的為各種條件下的誘變育種，而隨著氨基酸生物代謝途徑的揭秘，有目的的在分子水平上對代謝途徑進行改造也漸漸顯露其優(yōu)勢，另外，中游的發(fā)酵條件優(yōu)化過程以及下游的回收凈化過程也是一個重點。但是，對于氨基酸分泌過程的研究，卻起步較晚，而且人們一直把注意力集中在細胞膜氨基酸的轉運蛋白上。申請人前期主要研究培養(yǎng)基組分以及菌株配伍方面對谷氨酸發(fā)酵效率的影響，取得了一定的效果，參見專利技術“一種新的谷氨酸生產(chǎn)方法”以及“一種谷氨酸高產(chǎn)酸工藝”?，F(xiàn)有技術中谷氨酸的提取方法有低溫等電法、等電—離交法。其中，低溫等電法是將發(fā)酵液加酸調至谷氨酸的等電點，使谷氨酸的溶解度降低，從而沉淀析出，結晶收率通常可以達到75％以上，如果采用低溫等電法(10℃)，則收率可達到80％。等電—離交工藝是將發(fā)酵液等電結晶后，母液繼續(xù)用酸調整到ph1.7，然后用強酸性陽離子交換樹脂吸附并用氨水洗脫，總收率可達96％。但是此法酸堿用量大、廢水量大，成本較高，而且等電離交工藝產(chǎn)生的廢水很難處理，環(huán)境污染問題非常嚴重。技術實現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明提供了一種精制谷氨酸的發(fā)酵工藝。本發(fā)明是通過如下方案來實現(xiàn)的：一種精制谷氨酸的發(fā)酵工藝，其包括如下步驟：步驟1）制備種子液，步驟2）制備發(fā)酵液，步驟3）分離，步驟4）濃縮、結晶。具體地，所述發(fā)酵工藝包括如下步驟：步驟1）制備種子液：將谷氨酸棒桿菌(corynebacteriumglutamicum)atcc13761接種到種子培養(yǎng)基中，在32℃，100rpm搖床培養(yǎng)12h，得到的谷氨酸棒桿菌種子液；步驟2）制備發(fā)酵液：將氨酸棒桿菌種子液以8％接種量接種到發(fā)酵罐，發(fā)酵時間共為48小時；0-46小時，控制溫度為32℃，常壓，其中，在第40小時，添加曲拉通x-100；第47-48小時，控制溫度為39-40℃，壓強為3-3.5個大氣壓，其中，在第43小時，添加氯化鈉；發(fā)酵過程中，通過自動流加氨水控制ph在4.5；并通過流加葡萄糖溶液將殘?zhí)强刂圃诓坏陀?.0wt％，發(fā)酵至48h停止，得發(fā)酵液；步驟3）分離：利用高速碟片分離機對發(fā)酵液進行離心，收集上層谷氨酸料液和菌體蛋白沉淀；谷氨酸料液經(jīng)過超濾膜超濾，收集濾過液；步驟4）濃縮、結晶：然后濃縮成原體積三分之一的濃縮液；往一級等電罐中流加上述濃縮液，同時加入濃硫酸調節(jié)使等電罐中溶液的ph為3.5，溫度控制在22℃，經(jīng)過一級等電點罐的液體再依次經(jīng)過二級等電點罐，同時加入濃硫酸調ph值，其中，二級等電點罐ph控制3.3，溫度10℃；經(jīng)過二級等電點罐的液體再依次經(jīng)過三級等電點罐，同時加入濃硫酸調ph值，其中，三級等電點罐ph控制3.2，溫度5℃；離心獲得結晶的谷氨酸。優(yōu)選地，所述種子培養(yǎng)基的組分為(質量百分比)：葡萄糖3％、玉米漿3％、尿素1％，k2hpo40.2％、na2hpo40.2％、硫酸錳0.01％、mgso40.01％，115℃滅菌15min，調ph為4-4.5。優(yōu)選地，所述發(fā)酵罐培養(yǎng)基的組分為（質量百分比）：葡萄糖6%，糖蜜3%，玉米漿5%，尿素0.5%，硫酸亞鐵0.02%，硫酸鎂0.02%，磷酸二氫鉀0.01%，ph4-4.5。優(yōu)選地，所述高速碟片機的轉速為4000rpm，離心時間為3min。優(yōu)選地，所述曲拉通x-100的添加量為1-2μg/ml。優(yōu)選地，所述氯化鈉的添加量為10-20μg/ml。本發(fā)明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下幾個方面：本發(fā)明通過提高發(fā)酵培養(yǎng)溫度，可增加分子擴散的速度，提高了谷氨酸的分泌率；增加壓力對細胞的擠壓作用增強,輔助以適當濃度的鹽溶液來改變菌體細胞的滲透壓，細胞表面發(fā)生輕微變形,細胞膜的通透性增加；培養(yǎng)過程后期加入曲拉通x-100，干擾細胞壁的合成，改善菌體細胞壁和細胞膜對催化反應中底物和產(chǎn)物的傳質限制；本發(fā)明通過添加曲拉通x-100以及氯化鈉結合溫度壓強的改變，實現(xiàn)谷氨酸棒桿菌培養(yǎng)與透性化處理的耦合，可以在不需要對培養(yǎng)好的細胞進行后續(xù)透性化處理的情況下減小菌體細胞壁和細胞膜對底物和產(chǎn)物的傳質限制，避免后續(xù)透性化處理細胞的步驟及相關設備運轉的投入；本發(fā)明發(fā)酵產(chǎn)率高，通過分離純化工藝使得谷氨酸純度為90％以上，收率為95%以上，成品顏色感官好，結晶粒均勻；本發(fā)明采用濃縮等電技術，硫酸的消耗最低，大大降低了成本，提高了工業(yè)附加值；常規(guī)菌株在發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸過程中，需流加氨水控制7左右，而發(fā)酵結束時，需向發(fā)酵液中投入大量濃硫酸調節(jié)3左右，本發(fā)明采用低ph值的谷氨酸進行發(fā)酵，可減少氨水和硫酸的消耗，降低了成本。具體實施方式為了使本
技術領域：
的人員更好地理解本申請中的技術方案，下面將結合本申請具體實施例，對本申請的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本申請一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒旧暾堉械膶嵤├?，本領域普通技術人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都應當屬于本發(fā)明保護的范圍。實施例1一種精制谷氨酸的發(fā)酵工藝，其包括如下步驟：將谷氨酸棒桿菌(corynebacteriumglutamicum)atcc13761接種到種子培養(yǎng)基中，在32℃，100rpm搖床培養(yǎng)12h，得到的谷氨酸棒桿菌種子液；所述谷氨酸棒桿菌種子培養(yǎng)基的組分為(以下均為質量百分比)：葡萄糖3％、玉米漿3％、尿素1％，k2hpo40.2％、na2hpo40.2％、硫酸錳0.01％、mgso40.01％，115℃滅菌15min，調ph為4-4.5；將種子液以8％接種量接種到發(fā)酵罐，發(fā)酵時間為48小時；0-46小時，控制溫度為32℃，常壓，其中，在第40小時，添加曲拉通x-100（tritonx-100），添加量為1μg/ml；第47-48小時，控制溫度為39℃，壓強為3個大氣壓，其中，在第43小時，添加氯化鈉，添加量為10μg/ml；發(fā)酵過程中，通過自動流加氨水控制ph在4.5；并通過流加濃度為100g/l的葡萄糖溶液將殘?zhí)强刂圃诓坏陀?.0％，發(fā)酵至48h停止，得發(fā)酵液；其中，發(fā)酵罐培養(yǎng)基為（質量百分比）：葡萄糖6%，糖蜜3%，玉米漿5%，尿素0.5%，硫酸亞鐵0.02%，硫酸鎂0.02%，磷酸二氫鉀0.01%，ph4-4.5；利用高速碟片分離機將谷氨酸料液和菌體蛋白分離；高速碟片機的轉速為4000rpm，時間為3min；谷氨酸料液經(jīng)過超濾膜超濾（超濾膜截留分子量為300da，超濾溫度為35℃），收集濾過液，然后濃縮成原體積三分之一的濃縮液；往一級等電罐中流加上述濃縮液，同時加入濃硫酸調節(jié)使等電罐中溶液的ph為3.5，溫度控制在22℃，經(jīng)過一級等電點罐的液體再依次經(jīng)過二級等電點罐，同時加入濃硫酸調ph值，其中，二級等電點罐ph控制3.3，溫度10℃；經(jīng)過二級等電點罐的液體再依次經(jīng)過三級等電點罐，同時加入濃硫酸調ph值，其中，三級等電點罐ph控制3.2，溫度5℃；離心獲得結晶的谷氨酸。實施例2一種精制谷氨酸的發(fā)酵工藝，其包括如下步驟：將谷氨酸棒桿菌(corynebacteriumglutamicum)atcc13761接種到種子培養(yǎng)基中，在32℃，100rpm搖床培養(yǎng)12h，得到的谷氨酸棒桿菌種子液；所述谷氨酸棒桿菌種子培養(yǎng)基的組分為(以下均為質量百分比)：葡萄糖3％、玉米漿3％、尿素1％，k2hpo40.2％、na2hpo40.2％、硫酸錳0.01％、mgso40.01％，115℃滅菌15min，調ph為4-4.5；將種子液以8％接種量接種到發(fā)酵罐，發(fā)酵時間為48小時；0-46小時，控制溫度為32℃，常壓，其中，在第40小時，添加曲拉通x-100（tritonx-100），添加量為1-2μg/ml；第47-48小時，控制溫度為40℃，壓強為3.5個大氣壓，其中，在第43小時，添加氯化鈉，添加量為20μg/ml；發(fā)酵過程中，通過自動流加氨水控制ph在4.5；并通過流加濃度為100g/l的葡萄糖溶液將殘?zhí)强刂圃诓坏陀?.0％，發(fā)酵至48h停止，得發(fā)酵液；其中，發(fā)酵罐培養(yǎng)基為（質量百分比）：葡萄糖6%，糖蜜3%，玉米漿5%，尿素0.5%，硫酸亞鐵0.02%，硫酸鎂0.02%，磷酸二氫鉀0.01%，ph4-4.5；利用高速碟片分離機將谷氨酸料液和菌體蛋白分離；高速碟片機的轉速為4000rpm，時間為3min；谷氨酸料液經(jīng)過超濾膜超濾，收集濾過液，然后濃縮成原體積三分之一的濃縮液；往一級等電罐中流加上述濃縮液，同時加入濃硫酸調節(jié)使等電罐中溶液的ph為3.5，溫度控制在22℃，經(jīng)過一級等電點罐的液體再依次經(jīng)過二級等電點罐，同時加入濃硫酸調ph值，其中，二級等電點罐ph控制3.3，溫度10℃；經(jīng)過二級等電點罐的液體再依次經(jīng)過三級等電點罐，同時加入濃硫酸調ph值，其中，三級等電點罐ph控制3.2，溫度5℃；離心獲得結晶的谷氨酸。實施例3各因素對谷氨酸發(fā)酵產(chǎn)量的影響：設置對照組，其中，對照組1：不改變溫度和壓強，維持溫度為32℃和常壓條件下，其余同實施例1；對照組2：不添加曲拉通x-100和氯化鈉，其余同實施例1；試驗組為實施例1。各組別發(fā)酵液中谷氨酸產(chǎn)量見表1：表1組別對照組1對照組2試驗組谷氨酸產(chǎn)量（g/l）83.191.8119.4實施例4一、壓強梯度試驗：針對發(fā)酵第47-48小時，選擇1-6大氣壓進行測試，其余實驗流程同實施例1，具體發(fā)酵結果見表2：表2大氣壓強度123456谷氨酸產(chǎn)量（g/l）96.5110.1119.4115.6101.496.3溫度梯度試驗：針對發(fā)酵第47-48小時，選擇32-42℃進行測試，其余實驗流程同實施例2，具體發(fā)酵結果見表3：表3溫度℃323436384042谷氨酸產(chǎn)量（g/l）91.394.1103.5115.8121.4107.7結論：適當強度的壓強可以提高谷氨酸產(chǎn)量，壓強過大時，可能會導致菌株活力降低或者死亡，從而導致產(chǎn)酸量下降；適當提高溫度可以增加細胞壁的透過性，從而提高谷氨酸產(chǎn)量，溫度過高時，可能會導致菌株活力降低或者死亡，從而導致產(chǎn)酸量下降。以上列舉的僅是本發(fā)明的最佳具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發(fā)明公開的內容直接導出或聯(lián)想到的所有變形，均應認為是本發(fā)明的保護范圍。當前第1頁12