本發(fā)明涉及一種antiafpcar-t細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用，屬于基因修飾細(xì)胞及腫瘤治療技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

原發(fā)性肝癌(hepatocellularcarcinoma，簡(jiǎn)稱(chēng)：hcc)居惡性腫瘤發(fā)病率的第五位,全球每年死亡人數(shù)約100萬(wàn)。目前，大部分原發(fā)性肝癌患者缺乏有效的治療手段,總的生存率僅為3％-5％。肝移植雖已成為治療原發(fā)性肝癌的重要手段，但供體短缺、手術(shù)損傷、免疫排斥以及費(fèi)用高昂等問(wèn)題構(gòu)成了肝臟器官移植技術(shù)發(fā)展的主要障礙。因此，有必要探索一種新的、有效治療途徑。隨著分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)及免疫學(xué)的飛速發(fā)展，以免疫治療為基礎(chǔ)的生物治療已顯示出良好的應(yīng)用前景。

嵌合抗原受體t細(xì)胞(chimericantigenreceptortcell，簡(jiǎn)稱(chēng)：car-tcell)是通過(guò)基因修飾的手段，使能特異性識(shí)別靶抗原的單克隆抗體的單鏈可變區(qū)(singlechainfvdomain，簡(jiǎn)稱(chēng)：scfv)表達(dá)在細(xì)胞表面，同時(shí)通過(guò)跨膜區(qū)與人工設(shè)計(jì)的細(xì)胞胞內(nèi)的活化增殖信號(hào)域相耦連。表達(dá)car的t細(xì)胞可通過(guò)scfv直接識(shí)別并結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面的腫瘤相關(guān)抗原，car將信號(hào)傳入t細(xì)胞內(nèi)，激活t細(xì)胞分泌細(xì)胞因子包括穿孔素、顆粒酶、inf-γ、tnf-α等，從而發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。因此，car-t細(xì)胞是主要組織相容性復(fù)合體(majorhistocompatibilitycomplex，簡(jiǎn)稱(chēng)：mhc)非限制性的，其應(yīng)用的關(guān)鍵是確定一種腫瘤相關(guān)抗原，在腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)，而在正常組織中無(wú)表達(dá)或者低表達(dá)。

甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，簡(jiǎn)稱(chēng)：afp)是胎兒時(shí)期肝臟內(nèi)合成的一種糖蛋白,成人后血清中水平很低,發(fā)生惡變的肝細(xì)胞則又可恢復(fù)其合成的能力，其在70％-80％的原發(fā)性肝癌(hcc)中有較高的表達(dá)水平。研究證實(shí)將表達(dá)mafp基因的小鼠肝癌細(xì)胞株hepa1-6接種c57bl/6j小鼠，再用插入afp基因的質(zhì)粒dna免疫小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種治療性的免疫afp質(zhì)粒dna能誘發(fā)較強(qiáng)的特異性ctl免疫反應(yīng)。還有研究應(yīng)用afp來(lái)源的免疫優(yōu)勢(shì)多肽疫苗治療iv期hcc患者，6例患者中5例顯示afp多肽在體內(nèi)具有免疫原性,能在血清afp水平較高的患者中刺激抗原特異性t細(xì)胞。因此，afp作為肝癌細(xì)胞的特異性抗原,可作為car-t細(xì)胞抗腫瘤治療的一個(gè)理想靶點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種antiafpcar-t細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用，該細(xì)胞經(jīng)過(guò)t細(xì)胞修飾和改造得到，并且能夠特異性識(shí)別和殺傷afp高表達(dá)的肝癌細(xì)胞，適用于相應(yīng)腫瘤疾病的預(yù)防和治療。

本發(fā)明提供一種antiafpcar-t細(xì)胞，所述antiafpcar-t細(xì)胞在t細(xì)胞內(nèi)表達(dá)scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白；所述scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白中，所述scfv用于結(jié)合所述afp蛋白，并且所述scfv的氨基酸序列為第一序列，所述第一序列為：

evqlvqsgaevkkpgesltisckasgysfpnywitwvrqmsggglewmgridpgdsyyttynpsfqghvtisidkstntaylhwnslaasdtamyycaryyvslvdiwgqgtlvtvssggggsggggsggggsqsvltqpakvsgspgqkitisctgtssdvggynyvswyqqhpgkapklmiydvnnrpsevsnrfsgaksgntasltisglqaedeadyycssyttgsrsvfgggtkltvlg

該antiafpcar-t細(xì)胞以afp為靶點(diǎn)，具體地，所述antiafpcar-t細(xì)胞的嵌合抗原受體car包括胞膜外抗原結(jié)合區(qū)、鉸鏈區(qū)和胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)，所述胞膜外抗原結(jié)合區(qū)為scfv，所述鉸鏈區(qū)為igd，所述胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)為cd28–ox40–cd3ζ。圖1為本發(fā)明的antiafpcar的設(shè)計(jì)示意圖，請(qǐng)參考圖1。

進(jìn)一步地，所述scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白中，所述igd的氨基酸序列為第二序列。

具體地，第二序列為：

tftcfvvgsdlkdahltwevagkvptggveegllerhsngsqsqhsrltlprslwnagtsvtctlahpslppqrlmalrepaaqapvklstnllassdppeaa

進(jìn)一步地，所述scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白中，所述cd28的氨基酸序列為第三序列。

具體地，第三序列為：

fwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvrskrsallhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrs

進(jìn)一步地，所述scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白中，所述ox40的氨基酸序列為第四序列，所述cd3ζ的氨基酸序列為第五序列。

具體地，第四序列為：

rrdqrlppdshkppgggsfrtpiqeeqadahstlaki

具體地，第五序列為：

rvkfsrsaeppayqqgqnqlynelnlgrseeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr

進(jìn)一步地，所述scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白中，

所述scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白的氨基酸序列為第六序列。

具體地，第六序列為：

evqlvqsgaevkkpgesltisckasgysfpnywitwvrqmsggglewmgridpgdsyttynpsfqghvtisidkstntaylhwnslkasdtamyycaryyvslvdiwgqgtlvtvssggggsggggsggggsqsvltqpasvsgspgqsitisctgtsskvggynyvswyqqhpgkapklmiydvnnrpsevsnrfsgsksgntasltisglqaedeadyykssyttgsravfgggtkltvlgtftcfvvgsdlkdahltwevagkvptggveegllerhsngsqsqhsrltlpralwnagtsvtctlnhpslppqrlmalrepaaqapvklslnllassdppeaafwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrsrrdqrlppdahkppgggsfrtpiqeeqadahstlakirvkfsrsaeppakqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr

進(jìn)一步地，所述antiafpcar-t細(xì)胞通過(guò)慢病毒感染t淋巴細(xì)胞獲得，所述慢病毒通過(guò)攜帶有所述scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白的慢病毒表達(dá)載體感染293t細(xì)胞得到。

本發(fā)明還提供一種上述任一所述的antiafpcar-t細(xì)胞的制備方法，包括如下步驟：

1)構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體，所述慢病毒表達(dá)載體具有所述

scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白；

2)利用慢病毒包裝質(zhì)粒和所述慢病毒表達(dá)載體感染293t細(xì)胞，獲得慢病毒，所述慢病毒被所述scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白包裝；

3)分離t淋巴細(xì)胞，并用所述慢病毒感染所述t淋巴細(xì)胞，獲得所述antiafpcar-t細(xì)胞，所述antiafpcar-t細(xì)胞的t細(xì)胞內(nèi)表達(dá)所述scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白。

在步驟1)中，通過(guò)基因工程手段，將scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白基因克隆到慢病毒表達(dá)載體上，從而完成對(duì)慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建。在步驟2)中，利用步驟1)所得的慢病毒表達(dá)載體對(duì)293t細(xì)胞感染，獲得被scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白包裝的慢病毒。在步驟3)中，將步驟

2)中的慢病毒表達(dá)于人外周血中分離收集的t淋巴細(xì)胞以獲得car-t細(xì)胞。

進(jìn)一步地，在所述步驟1)之前，還包括合成和擴(kuò)增所述scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白基因。具體合成和擴(kuò)增方法可按照本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)手段獲得。

進(jìn)一步地，還包括對(duì)所述慢病毒進(jìn)行純化，并用所述純化后的慢病毒感染所述t淋巴細(xì)胞。一般的，該純化手段可以使用本領(lǐng)域常規(guī)手段進(jìn)行，例如過(guò)濾、超濾等。

本發(fā)明還提供了上述任一所述的antiafpcar-t細(xì)胞在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用，尤其能夠用于afp分子高表達(dá)的肝癌的治療。

本發(fā)明方案具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1、本發(fā)明的antiafpcar-t細(xì)胞將afp抗體用于car-t細(xì)胞的構(gòu)建，能夠?qū)fp蛋白進(jìn)行有效結(jié)合。

2、本發(fā)明提供的antiafpcar-t細(xì)胞制備方法能簡(jiǎn)單、有效的制備具有特異性識(shí)別和殺傷腫瘤的antiafpcar-t細(xì)胞。

3、本發(fā)明的antiafpcar-t細(xì)胞具有高效的腫瘤殺傷活性，能夠用于制備治療肝癌的藥物中，尤其能夠以afp分子為靶抗原，用于afp分子高表達(dá)的肝癌的治療。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明的antiafpcar的設(shè)計(jì)示意圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例的antiafpcar-t細(xì)胞以及未感染的t細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞hepg-2(肝癌)的殺傷效果示意圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例的antiafpcar-t細(xì)胞以及未感染的t細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞hep3b(肝癌)的殺傷效果示意圖；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例的antiafpcar-t細(xì)胞、對(duì)照例以及空白例對(duì)治療肝癌(hepg-2)移植瘤模型小鼠后的小鼠生存期示意圖。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實(shí)施例1

本發(fā)明antiafpcar-t細(xì)胞的制備

1、構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體

通過(guò)常規(guī)的基因工程手段，合成scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白基因序列，將scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白基因序列克隆到慢病毒表達(dá)載體上，獲得scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ慢病毒表達(dá)載體pgreenpuro-car。其中，scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白的各序列如前所述。

2、慢病毒包裝

1)用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10wt％胎牛血清(fetalbovineserum,簡(jiǎn)稱(chēng)：fbs)的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)293t細(xì)胞；

2)將293t細(xì)胞以3x10⁵/cm²的密度傳至直徑15cm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)20h，保證轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞匯合度為80-90％；

用不含血清的1640培養(yǎng)基換液，備用；

3)取兩個(gè)ep管，分別在兩個(gè)ep管中加入1ml1640，將慢病毒載體pgreenpuro-car與pmdlgprre、prsv-rev和pmd2.g質(zhì)粒按照摩爾比1：1：1：1于其中一個(gè)ep管中混勻；在另一個(gè)ep管中加入150ullipo2000，混勻放置5min；將混有l(wèi)ipo2000的1640加入含有質(zhì)粒的ep管中，混勻得混合液，室溫放置20min，然后將混合液逐滴加入上述2)中制備的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，用含10％fbs的1640培養(yǎng)基更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48h后收集細(xì)胞上清液，獲得被scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白包裝的慢病毒。

3、慢病毒純化

將2中獲得的被包裝的慢病毒用0.22μm過(guò)濾膜過(guò)濾，濾液收集在50ml超濾管中，以3000g/min的速度離心45min；將剩余的上層病毒濃縮液轉(zhuǎn)移至ep管，放-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4、cd8+t細(xì)胞的分離

1)全血倒入50ml離心管，室溫離心20分鐘，控制離心力ref為700g(普通離心)；

2)取上述離心下部細(xì)胞成分，加杜氏磷酸鹽緩沖液dpbs至50ml；

3)分別取25ml上述液體加到20ml人淋巴細(xì)胞分離液,將離心管室溫離心15分鐘，控制離心力ref為800g；

5)取白膜層細(xì)胞，加入dpbs，補(bǔ)足至50ml；

6)離心10分鐘，控制離心力ref為600g，棄上清液，得外周血單個(gè)細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcell，簡(jiǎn)稱(chēng)：pbmc)；

7)采用cd8+t細(xì)胞磁珠分選試劑盒分選cd8+t細(xì)胞。

5、慢病毒載體感染t淋巴細(xì)胞

用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10wt％fbs的rpmi1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)cd8+t細(xì)胞，第一天加入抗cd3單克隆抗體活化；第三天加入150moi的3中純化后的慢病毒(antiafpcar)，16h后將培養(yǎng)基更換為含有50iu/ml重組人il-2的rpmi1640完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)10-20天，得到antiafpcar-t細(xì)胞。

實(shí)施例2

對(duì)實(shí)施例1制備的antiafpcar-t細(xì)胞體外抗腫瘤效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，包括以下步驟：

以穩(wěn)定表達(dá)afp的肝癌細(xì)胞系hepg-2和hep3b作為靶細(xì)胞，分別用慢病毒載體pgreenpuro-car感染的t細(xì)胞(即，實(shí)施例1制得antiafpcar-t細(xì)胞)和未感染的t細(xì)胞制得效應(yīng)細(xì)胞，將靶細(xì)胞按照密度1x10⁵個(gè)/ml接種96孔板，每孔100μl，按照5:1，10:1，20:1效靶比將效應(yīng)細(xì)胞加入靶細(xì)胞，置于5％co2,37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h，采用wst-1檢測(cè)細(xì)胞活力，計(jì)算殺傷效率。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例的antiafpcar-t細(xì)胞以及未感染的t細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞hepg-2(肝癌)的殺傷效果示意圖；圖3為本發(fā)明實(shí)施例的antiafpcar-t細(xì)胞以及未感染的t細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞hep3b(肝癌)的殺傷效果示意圖。

圖2和圖3結(jié)果表明，表達(dá)afpcar的t淋巴細(xì)胞對(duì)afp陽(yáng)性肝癌細(xì)胞具有很強(qiáng)的殺傷作用。

實(shí)施例3

對(duì)實(shí)施例1制備的antiafpcar-t細(xì)胞體內(nèi)抗腫瘤效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，包括以下步驟：

取6周齡雌裸鼠15只，右腋下皮下注射5x10⁶hepg-2(肝癌)細(xì)胞，待腫瘤長(zhǎng)到60mm³大小，腫瘤模型隨機(jī)分成3組：對(duì)照組、antiafpcar-t細(xì)胞組、t細(xì)胞組；對(duì)照組尾靜脈注射生理鹽水200ul/次，每周2次；antiafpcar-t細(xì)胞組尾靜脈注射antiafpcar-t細(xì)胞1×10⁷個(gè)/次，每周2次；t細(xì)胞組尾靜脈注射t細(xì)胞1×10⁷個(gè)/次，每周2次；統(tǒng)計(jì)100天內(nèi)小鼠生存狀態(tài)，做生存率曲線。圖4為本發(fā)明實(shí)施例的antiafpcar-t細(xì)胞、對(duì)照例以及空白例對(duì)治療肝癌(hepg-2)移植瘤模型小鼠后的小鼠生存期示意圖。

圖4結(jié)果表明，antiafpcar-t細(xì)胞相對(duì)于未感染的t細(xì)胞以及空白例可延遲afp高表達(dá)的肝癌移植瘤小鼠模型的生存期。

最后應(yīng)說(shuō)明的是：以上各實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制；盡管參照前述各實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的范圍。