本發(fā)明涉及以克氏梭菌發(fā)酵生產(chǎn)己酸的工藝方法，特別是一種利用豆渣的毛霉培養(yǎng)物來提高己酸產(chǎn)量的生產(chǎn)方法。

背景技術(shù)：

己酸是含有六個(gè)碳原子的中鏈脂肪酸，它主要是由克氏梭菌(clostridiumkluyveri)發(fā)酵產(chǎn)生。己酸是濃香型白酒中最重要的有機(jī)酸，有增強(qiáng)濃香型白酒的后味綿甜感作用，己酸與濃香型白酒泥窖發(fā)酵糟醅產(chǎn)生的乙醇，通過酯化反應(yīng)，生成濃香型大曲酒的主體香味成分己酸乙酯，從而改善濃香型白酒的風(fēng)味及口感。因此，己酸含量的高低間接影響成品酒的質(zhì)量，一般己酸含量高，酒中己酸乙酯的含量也高，反之，含量就低。因此，如何提高濃香型白酒發(fā)酵糟醅的己酸濃度，進(jìn)而提高己酸乙酯的濃度，成為發(fā)酵濃香型白酒生產(chǎn)企業(yè)的主要課題。

目前，國內(nèi)外己酸的發(fā)酵水平不一，所采用的方法也是多種多樣，主要采用培養(yǎng)基條件優(yōu)化和調(diào)整發(fā)酵工藝等手段提高其產(chǎn)量，但是采用添加另外一種食品加工副產(chǎn)物的微生物培養(yǎng)產(chǎn)物來提高己酸產(chǎn)量的報(bào)道并不多見；尤其尚未發(fā)現(xiàn)有公布使用豆制品加工副產(chǎn)物豆渣的毛霉培養(yǎng)物來提高己酸產(chǎn)量的報(bào)道，此方法既能提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量，又能實(shí)現(xiàn)廢物再利用，節(jié)約能源，有利于環(huán)境保護(hù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的就是提供一種利用豆制品加工副產(chǎn)物豆渣提高克氏梭菌發(fā)酵生產(chǎn)己酸產(chǎn)量的方法。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

(1)豆渣毛霉培養(yǎng)物的制備

稱取20g新鮮豆渣轉(zhuǎn)入500ml三角瓶中，121℃滅菌15-20min后，接入毛霉菌株actinomucoreleganscicc3118，于15-23℃條件下培養(yǎng)3-7d。再將獲得的培養(yǎng)物放入100℃-150℃的烘箱中干燥，研磨成粉末，得到豆渣毛霉培養(yǎng)物；

(2)克氏梭菌種子培養(yǎng)

從克氏梭菌液體保藏菌種中吸取1ml接入盛有9ml種子培養(yǎng)基的試管中，33-37℃下培養(yǎng)5-8d后，轉(zhuǎn)入裝有90ml種子培養(yǎng)基的100ml三角瓶中，33-37℃下培養(yǎng)5-8d后制得克氏梭菌種子液，作為己酸發(fā)酵試驗(yàn)備用；

種子培養(yǎng)基由下述成分組成：醋酸鈉1-10g/l，k2hpo40.1-10g/l，mgso4?7h2o0.1-10g/l，(nh4)2so40.1-10g/l，酵母膏0.1-20g/l，caco30.1-10g/l，乙醇5-50ml/l，0.1mpa、121℃滅菌30min，接種前加入乙醇。

(3)己酸發(fā)酵培養(yǎng)

將所述克氏梭菌種子液按5-10%的接種量接入己酸發(fā)酵培養(yǎng)基中，33-37℃條件下靜置培養(yǎng)7-20d，在發(fā)酵0-8d一次性添加10-40g/l豆渣毛霉培養(yǎng)物，發(fā)酵結(jié)束后獲得己酸發(fā)酵液；

己酸發(fā)酵培養(yǎng)基由下述成分組成：醋酸鈉1-10g/l，k2hpo40.1-10g/l，mgso4?7h2o0.1-10g/l，(nh4)2so40.1-10g/l，酵母膏0.1-20g/l，caco30.1-10g/l，乙醇5-50ml/l，0.1mpa、121℃滅菌30min，接種前加入乙醇。

步驟(3)中，豆渣毛霉培養(yǎng)物的添加量為20g/l，添加時(shí)間為6d。

豆渣毛霉培養(yǎng)物是利用毛霉菌株actinomucoreleganscicc3118發(fā)酵豆制品加工副產(chǎn)物豆渣所產(chǎn)生的發(fā)酵產(chǎn)物。其制備方法為將斜面保藏的毛霉菌株actinomucoreleganscicc3118活化后接入數(shù)環(huán)到裝有20g新鮮豆渣的500ml三角瓶中，15-23℃、濕度30-70%條件下靜止培養(yǎng)3-7d。將獲得的培養(yǎng)物放入100℃-150℃的烘箱中干燥，研磨成粉末。

經(jīng)測定，在克氏梭菌發(fā)酵0-8d添加10-40g/l豆渣毛霉培養(yǎng)物可提高己酸產(chǎn)量同未添加的對照組相比提高了5.6%-41.76%。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：

(1)明顯提高了己酸產(chǎn)量；

(2)操作簡單，較易實(shí)現(xiàn)；

(3)實(shí)現(xiàn)食品加工副產(chǎn)物的資源化有效利用，降低生產(chǎn)成本。

附圖說明

圖1為己酸發(fā)酵培養(yǎng)基中豆渣毛霉培養(yǎng)物的添加量對己酸產(chǎn)量的影響，在圖1中，橫坐標(biāo)為發(fā)酵時(shí)間(d)，縱坐標(biāo)為發(fā)酵液中所測得的己酸產(chǎn)量(mg/100ml)；

圖2為己酸發(fā)酵不同時(shí)間添加20g/l豆渣毛霉培養(yǎng)物對己酸產(chǎn)量的影響，在圖2中，橫坐標(biāo)為發(fā)酵時(shí)間(d)，縱坐標(biāo)為發(fā)酵液中所測得的己酸產(chǎn)量(mg/100ml)；

圖3為對比例1的發(fā)酵產(chǎn)物己酸產(chǎn)量曲線，在圖3中，橫坐標(biāo)為發(fā)酵時(shí)間(d)，縱坐標(biāo)為發(fā)酵液中所測得的己酸產(chǎn)量(mg/100ml)；

圖4為對比例1中發(fā)酵過程中未添加豆渣毛霉培養(yǎng)物和添加30g/l豆渣毛霉培養(yǎng)物時(shí)分別獲得己酸含量最大時(shí)的氣相色譜圖譜。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

(1)豆渣毛霉培養(yǎng)物的制備

將斜面保藏的毛霉菌株actinomucoreleganscicc3118活化后接入數(shù)環(huán)到裝有20g新鮮豆渣的500ml三角瓶中，20℃、濕度65%條件下靜止培養(yǎng)4d。將獲得的培養(yǎng)物放入110℃的烘箱中干燥，研磨成粉末，得到豆渣毛霉培養(yǎng)物；

(2)克氏梭菌種子培養(yǎng)

從克氏梭菌液體保藏菌種中吸取1ml接入盛有9ml種子培養(yǎng)基(醋酸鈉5g/l，k2hpo40.4g/l，mgso4?7h2o0.2g/l，(nh4)2so40.5g/l，酵母膏15g/l，caco310g/l，乙醇30ml/l。0.1mpa、121℃滅菌30min，接種前加入乙醇)的試管中，35℃下培養(yǎng)7d后，轉(zhuǎn)入裝有90ml種子培養(yǎng)基的100ml三角瓶中，35℃下培養(yǎng)7d后制得克氏梭菌種子液。

(3)己酸發(fā)酵培養(yǎng)

將培養(yǎng)好的克氏梭菌種子液按10%的接種量接入裝有己酸發(fā)酵培養(yǎng)基(醋酸鈉5g/l，k2hpo40.4g/l，mgso4?7h2o0.2g/l，(nh4)2so40.5g/l，酵母膏10g/l，caco310g/l，乙醇30ml/l。0.1mpa、121℃滅菌30min，接種前加入乙醇)的三角瓶中，并在發(fā)酵培養(yǎng)開始后0h分別添加0g/l、10g/l、20g/l、30g/l、40g/l的豆渣毛霉培養(yǎng)物(只添加一次)。然后在35℃條件下靜置培養(yǎng)15d。

(4)己酸含量的檢測方法

發(fā)酵過程中，每隔1d取樣，以2-乙基丁酸為內(nèi)標(biāo)，采用氣相色譜法測定發(fā)酵液中己酸含量。

氣相色譜條件：儀器為agilent7890a，cp-wax57cb(50m×0.25mmi.d×0.20μmfilmthickness)石英毛細(xì)管色譜柱；進(jìn)樣口溫度240℃；柱箱起始溫度：100℃(1min)；升溫速率：10℃/min；柱箱終溫度：220℃(2min)；檢測器溫度：250℃；載氣：氮?dú)?；流速：約2.0ml/min，進(jìn)樣量1μl。

(5)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。當(dāng)豆渣毛霉培養(yǎng)物的添加量為0g/l、10g/l、20g/l、30g/l、40g/l時(shí)，各處理組獲得己酸濃度最高值分別達(dá)到701.02mg/100ml，743.13mg/100ml，784.46mg/100ml，825.49mg/100ml和740.28mg/100ml。其中當(dāng)豆渣毛霉培養(yǎng)物的添加量為30g/l時(shí)，己酸含量明顯高于對照組，較對照組提高了17.75%。

實(shí)施例2

(1)豆渣毛霉培養(yǎng)物的制備同實(shí)施例1；

(2)克氏梭菌種子培養(yǎng)同實(shí)施例1；

(3)己酸發(fā)酵培養(yǎng)

將培養(yǎng)好的克氏梭菌種子液按10%的接種量接入裝有己酸發(fā)酵培養(yǎng)基(同實(shí)例1)的三角瓶中，35℃條件下靜置培養(yǎng)；整個(gè)發(fā)酵過程只添加一次并且分別在發(fā)酵過程中0d，2d，4d，6d和8d時(shí)往發(fā)酵培養(yǎng)基中添加30g/l的豆渣毛霉培養(yǎng)物。

(4)己酸含量的檢測方法同實(shí)施例1；

(5)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖2可以看出，整個(gè)發(fā)酵過程在發(fā)酵時(shí)間為0d，2d，4d，6d和8d時(shí)往發(fā)酵培養(yǎng)基中添加30g/l的豆渣毛霉培養(yǎng)物，產(chǎn)量比較穩(wěn)定，其己酸含量發(fā)酵第12d時(shí)，均達(dá)到最大值，分別為824.5mg/100ml，877.43mg/100ml，907.49mg/100ml，934.91mg/100ml和992.34mg/100ml(參考圖2)。這說明發(fā)酵過程中在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)添加定量的豆渣毛霉培養(yǎng)物均可以得到較高的己酸產(chǎn)量，其中發(fā)酵第6d添加30g/l的豆渣毛霉培養(yǎng)物時(shí)己酸產(chǎn)量最高。

對比例1

(1)豆渣毛霉培養(yǎng)物的制備同實(shí)施例1；

(2)克氏梭菌種子培養(yǎng)同實(shí)施例1；

(3)己酸含量的檢測方法同實(shí)施例1；

(4)己酸發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的克氏梭菌種子液以10%的接種量接種于己酸發(fā)酵培養(yǎng)基(同實(shí)施例1)的三角瓶中，35℃條件下靜置培養(yǎng)15d，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為12d時(shí)，己酸含量最高達(dá)到702.13mg/100ml(參見圖3未添加豆渣毛霉培養(yǎng)物曲線)；在發(fā)酵的6d，向己酸發(fā)酵培養(yǎng)基中添加30g/l的豆渣毛霉培養(yǎng)物，發(fā)酵液中己酸含量最高達(dá)到995.19mg/100ml(參見圖3添加豆渣毛霉培養(yǎng)物曲線)。通過對比例和實(shí)施例可以看出，添加豆渣毛霉培養(yǎng)物所得己酸產(chǎn)量比未添加的己酸產(chǎn)量提高41.76%(參照圖3-4)。