本發(fā)明屬于發(fā)酵
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種l-蘋(píng)果酸的制備、分離以及除雜純化方法。
背景技術(shù)：
：蘋(píng)果酸,又名羥基丁二酸、羥基琥珀酸或1-羥基乙烷二羧酸,分子式為c4h6o5，分子量134.09，結(jié)構(gòu)式為hoocchohch2cooh。蘋(píng)果酸具有右旋（d-型）和左旋（l-型）兩種旋光異構(gòu)體及dl-型外消旋體三種型式產(chǎn)品。l—蘋(píng)果酸用途廣泛。l-蘋(píng)果酸為天然果汁之重要成份，味道柔和，具特殊香味，不損害口腔與牙齒，代謝上有利于氨基酸吸收，不積累脂肪，是新一代的食品酸味劑，被生物界和營(yíng)養(yǎng)界譽(yù)為“最理想的食品酸味劑”。目前在老年及兒童食品中正取代檸檬酸。l—蘋(píng)果酸是人體必需的一種有機(jī)酸，也是一種低熱量的理想食品添加劑。l-蘋(píng)果酸是生物體三羧酸的循環(huán)中間體，口感接近天然果汁并具有天然香味，與檸檬酸相比，產(chǎn)生的熱量更低，口味更好，因此廣泛應(yīng)用于酒類(lèi)、飲料、果醬、口香糖等多種食品中，并有逐漸替代檸檬酸的勢(shì)頭。是目前世界食品工業(yè)中用量最大和發(fā)展前景較好的有機(jī)酸之一。l－蘋(píng)果酸中含有天然的潤(rùn)膚成分，能夠很容易地溶解粘結(jié)在干燥鱗片狀的死細(xì)胞之間的“膠粘物”，從而可以清除皮膚表面皺紋，使皮膚變得嫩白、光潔而有彈性，因此在化妝品配方中備受青睞。l－蘋(píng)果酸可用于藥物制劑、片劑、糖漿中，還可以配入氨基酸溶液中，能明顯提高氨基酸的吸收率；l－蘋(píng)果酸可以用于治療肝病、貧血、免疫力低下、尿毒癥、高血壓、肝衰竭等多種疾病，并能減輕抗癌藥物對(duì)正常細(xì)胞的毒害作用；還可用于制備和合成驅(qū)蟲(chóng)劑、抗牙垢劑等。另外l－蘋(píng)果酸還可以作為工業(yè)清洗劑、樹(shù)脂固化劑、合成材料增塑劑、飼料添加劑等。隨著氨基酸行業(yè)逐步發(fā)展，發(fā)酵法生產(chǎn)技術(shù)l-蘋(píng)果酸也有了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但是l-蘋(píng)果酸的發(fā)酵產(chǎn)量較低，轉(zhuǎn)化率不徹底。申請(qǐng)人之前的發(fā)明專(zhuān)利“一種直接發(fā)酵法生產(chǎn)l-蘋(píng)果酸的方法”以及“一種l-蘋(píng)果酸提取新工藝”通過(guò)優(yōu)化工藝以及菌株合理配伍，大幅度提高了蘋(píng)果酸的產(chǎn)量以及糖酸轉(zhuǎn)化率，但是黃曲霉會(huì)產(chǎn)生一定量的黃曲霉素，產(chǎn)品中會(huì)殘留黃曲霉毒素，后續(xù)分離步驟繁瑣，增加了企業(yè)成本。鑒于上述缺陷，申請(qǐng)人之前的專(zhuān)利技術(shù)“一種制備l-蘋(píng)果酸的方法”采用米曲霉發(fā)酵來(lái)制備蘋(píng)果酸，其采用混合發(fā)酵的方式，取得了較好的蘋(píng)果酸產(chǎn)率；申請(qǐng)人之前的專(zhuān)利技術(shù)“一種l-蘋(píng)果酸提取新工藝”采用中和與酸解以及離子交換與低溫濃縮結(jié)晶等步驟對(duì)蘋(píng)果酸進(jìn)行分離純化，蘋(píng)果酸純度可達(dá)到99%，但是步驟較為繁瑣，而且操作成本高。本發(fā)明在該專(zhuān)利技術(shù)的基礎(chǔ)上對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)進(jìn)行了改進(jìn)，旨在于進(jìn)一步提高蘋(píng)果酸的產(chǎn)率，并且對(duì)蘋(píng)果酸進(jìn)行除雜純化，提高工業(yè)附加值。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種l-蘋(píng)果酸的制備、分離以及除雜純化方法，該方法制得蘋(píng)果酸產(chǎn)量大，除雜純化后產(chǎn)品收率和純度高。本發(fā)明的技術(shù)方案是通過(guò)如下方式來(lái)實(shí)施的：一種l-蘋(píng)果酸的制備、分離以及除雜純化方法，其包括如下步驟：步驟1）發(fā)酵，步驟2）通透化處理，步驟3）分離、除雜，步驟4）純化。具體地，所述方法包括如下步驟：步驟1）發(fā)酵：按照米曲霉種子液∶發(fā)酵罐培養(yǎng)基為1∶8的體積比例轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中培養(yǎng)，溫度32℃，培養(yǎng)40h；步驟2）通透化處理：往步驟1）所得發(fā)酵液中添加碳酸鈣和ctab，繼續(xù)發(fā)酵40h，然后控制溫度為39℃，壓強(qiáng)為2個(gè)大氣壓，保溫保壓發(fā)酵6h，停止發(fā)酵，得到l-蘋(píng)果酸發(fā)酵液；發(fā)酵過(guò)程中，控制ph在6.2；并通過(guò)流加葡萄糖溶液將殘?zhí)强刂圃诓坏陀?.0wt％；步驟3）分離、除雜：將l-蘋(píng)果酸發(fā)酵液2000rpm離心10min，去除沉淀，收集上清液，微濾膜過(guò)濾，截留分子量為10000da，微濾溫度為32℃；濾過(guò)液再進(jìn)行超濾，截留分子量為1000da，超濾溫度為32℃，收集透過(guò)液；步驟4）純化：步驟3）所得將透過(guò)液通過(guò)裝填有強(qiáng)堿弱酸型兩性離子交換樹(shù)脂的色譜柱，然后洗脫吸附于樹(shù)脂上的蘋(píng)果酸，將得到的洗脫液減壓蒸餾，真空干燥，得到l-蘋(píng)果酸。優(yōu)選地，米曲霉種子液的濃度為1×1010cfu/ml；優(yōu)選地，所述發(fā)酵罐培養(yǎng)基組分為：碳酸鈣80g/l，葡萄糖60g/l，木糖50g/l，玉米漿12g/l，硫酸銨2g/l，硫酸鎂0.5g/l，磷酸二氫鉀0.2g/l，磷酸氫二鉀0.1g/l，七水硫酸亞鐵0.01g/l，ph值6.2。優(yōu)選地，所述碳酸鈣的添加量為80g/l，所述ctab的添加量為40mg/l。本發(fā)明的有益效果主要包括但是并不限于幾個(gè)方面：本發(fā)明對(duì)現(xiàn)有蘋(píng)果酸發(fā)酵菌株進(jìn)行通透化處理，提高了蘋(píng)果酸的產(chǎn)率；本發(fā)明在發(fā)酵末期通過(guò)提高培養(yǎng)溫度，可增加分子擴(kuò)散的速度；發(fā)酵末期通過(guò)增加壓力對(duì)細(xì)胞的擠壓作用增強(qiáng),細(xì)胞表面發(fā)生輕微變形,細(xì)胞膜的通透性增加；培養(yǎng)過(guò)程后期加入合適劑量的ctab，干擾細(xì)胞壁的合成，改善菌體細(xì)胞壁和細(xì)胞膜對(duì)催化反應(yīng)中底物和產(chǎn)物的傳質(zhì)限制，同時(shí)調(diào)整合適的濃度，避免終濃度過(guò)低，達(dá)不到透性化改造的目的，終濃度過(guò)高則可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡或生長(zhǎng)停滯；本發(fā)明通過(guò)添加ctab結(jié)合溫度壓強(qiáng)的改變，實(shí)現(xiàn)菌株培養(yǎng)與透性化處理的耦合，可以在不需要對(duì)培養(yǎng)好的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)透性化處理的情況下減小菌體細(xì)胞壁和細(xì)胞膜對(duì)底物和產(chǎn)物的傳質(zhì)限制，避免后續(xù)透性化處理細(xì)胞的步驟及相關(guān)設(shè)備運(yùn)轉(zhuǎn)的投入，為提高蘋(píng)果酸產(chǎn)量提供了一個(gè)簡(jiǎn)便方法；本發(fā)明發(fā)酵工藝中添加碳酸鈣來(lái)維持培養(yǎng)液中碳酸鈣的濃度，提高了米曲霉的發(fā)酵效率；本發(fā)明發(fā)酵液中l(wèi)-蘋(píng)果酸產(chǎn)品的分離、除雜純化工藝簡(jiǎn)單可行，收率和純度高，生產(chǎn)成本低，可規(guī)?；a(chǎn)；本發(fā)明純化得到的l-蘋(píng)果酸產(chǎn)品為白色結(jié)晶粉末，收率和純度高，提高了工業(yè)附加值。具體實(shí)施方式為了使本
技術(shù)領(lǐng)域：
的人員更好地理解本申請(qǐng)中的技術(shù)方案，下面將結(jié)合本申請(qǐng)具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更加清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本申請(qǐng)一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本申請(qǐng)中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都應(yīng)當(dāng)屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。實(shí)施例1一種l-蘋(píng)果酸的制備、分離以及除雜純化方法，其包括如下步驟：按照米曲霉種子液（濃度為1×1010cfu/ml)∶發(fā)酵罐培養(yǎng)基為1∶8的體積比例轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中培養(yǎng)，溫度32℃，培養(yǎng)40h，然后添加碳酸鈣和十六烷基三甲基溴化銨(ctab)，碳酸鈣的添加量為80g/l，ctab的添加量為40mg/l，繼續(xù)發(fā)酵4h，然后控制溫度為39℃，壓強(qiáng)為2個(gè)大氣壓，保溫保壓發(fā)酵6h，停止發(fā)酵，得到l-蘋(píng)果酸發(fā)酵液；發(fā)酵過(guò)程中，通過(guò)自動(dòng)流加氨水控制ph在6.2；并通過(guò)流加濃度為200g/l的葡萄糖溶液將殘?zhí)强刂圃诓坏陀?.0％；所述發(fā)酵罐培養(yǎng)基組分為：碳酸鈣80g/l，葡萄糖60g/l，木糖50g/l，玉米漿12g/l，硫酸銨2g/l，硫酸鎂0.5g/l，磷酸二氫鉀0.2g/l，磷酸氫二鉀0.1g/l，七水硫酸亞鐵0.01g/l，ph值6.2；所述米曲霉為米曲霉(aspergillusoryzae)accc30584。將l-蘋(píng)果酸發(fā)酵液2000rpm離心10min，去除沉淀，收集上清液，微濾膜過(guò)濾，截留分子量為10000da，微濾溫度為32℃；濾過(guò)液再進(jìn)行超濾，截留分子量為1000da，超濾溫度為32℃，收集透過(guò)液，將透過(guò)液通過(guò)裝填有強(qiáng)堿弱酸型兩性離子交換樹(shù)脂的色譜柱，然后洗脫吸附于樹(shù)脂上的蘋(píng)果酸，將得到的洗脫液減壓蒸餾，真空干燥，得到l-蘋(píng)果酸。上述l-蘋(píng)果酸經(jīng)檢測(cè)，產(chǎn)品純度為99%以上，硫酸鹽、氯化物、透光率、重金屬含量等相關(guān)指標(biāo)均符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求。實(shí)施例2各因素對(duì)米曲霉發(fā)酵液中蘋(píng)果酸產(chǎn)量的影響：l-蘋(píng)果酸的測(cè)定：采用2,7—萘二酚顯色法，取樣品溶液1.0ml，加入6.0ml分析純的濃硫酸，再加入0.1ml2,7—萘二酚溶液，接著在100℃水浴中加熱20min，取出待冷卻至室溫后，于385nm下進(jìn)行比色測(cè)定，以蒸餾水作對(duì)照校正儀器零點(diǎn)。用標(biāo)準(zhǔn)樣品先作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以蘋(píng)果酸含量為橫坐標(biāo)，385nm處吸收值即od385為縱坐標(biāo)，通過(guò)未知樣品在385nm處的od值，則可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的蘋(píng)果酸含量。設(shè)置對(duì)照組，其中，對(duì)照組1：不提高溫度和壓強(qiáng)，其余同實(shí)施例1；對(duì)照組2：不添加ctab，其余同實(shí)施例1；試驗(yàn)組為實(shí)施例1。各組別發(fā)酵液中蘋(píng)果酸的產(chǎn)量見(jiàn)表1：表1組別對(duì)照組1對(duì)照組2實(shí)施例1蘋(píng)果酸產(chǎn)量（g/l）82.193.7128.9實(shí)施例31、ctab梯度試驗(yàn)：以實(shí)施例1為例，檢測(cè)了ctab的添加時(shí)間對(duì)產(chǎn)酸量的影響，具體見(jiàn)表2：表2時(shí)間h203040506070蘋(píng)果酸產(chǎn)量（g/l）104.5113.6117.4128.9124.9118.32、壓強(qiáng)梯度試驗(yàn)：針對(duì)發(fā)酵末期6小時(shí)，選擇1-5大氣壓進(jìn)行測(cè)試，其余實(shí)驗(yàn)流程同實(shí)施例1，具體發(fā)酵結(jié)果見(jiàn)表3：表3大氣壓強(qiáng)度12345蘋(píng)果酸產(chǎn)量（g/l）113.5128.9124.3109.698.73、溫度梯度試驗(yàn)：針對(duì)發(fā)酵末期6小時(shí)內(nèi)，選擇33-43℃進(jìn)行測(cè)試，其余實(shí)驗(yàn)流程同實(shí)施例1，具體發(fā)酵結(jié)果見(jiàn)表4：表4溫度℃3236394143酸產(chǎn)量（g/l）101.3112.4128.9113.598.6結(jié)論：適當(dāng)提高溫度和壓強(qiáng)可以增加米曲霉細(xì)胞壁的透過(guò)性，從而提高蘋(píng)果酸產(chǎn)量，但是壓強(qiáng)或溫度過(guò)高時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致菌株活力降低或者死亡，從而導(dǎo)致蘋(píng)果酸量下降；ctab的添加時(shí)間對(duì)蘋(píng)果酸產(chǎn)量影響也較大，最終選擇在第50小時(shí)添加。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方式對(duì)本案作了詳盡的說(shuō)明，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所作的修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。當(dāng)前第1頁(yè)12