本發(fā)明涉及細(xì)菌檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種熒光pcr定量檢測(cè)b族鏈球菌的前處理方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

b族鏈球菌(groupbstreptococcus，gbs)也稱無(wú)乳鏈球菌，是一種寄生于人類泌尿生殖道及下消化道的條件致病菌，健康人群帶菌率可達(dá)35％，一般健康人群感染并不致病。但定植于產(chǎn)婦生殖道的b族鏈球菌，可在分娩時(shí)垂直傳播給新生兒，而新生兒b族鏈球菌感染所引起的新生兒敗血癥、腦膜炎和肺炎等癥致死率極高，并可導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。據(jù)統(tǒng)計(jì)約10％～30％的孕婦有感染gbs，其中40％～70％在分娩過(guò)程中會(huì)傳遞給新生兒。如果新生兒帶了這種菌，大約有1％～3％會(huì)出現(xiàn)早期侵入性感染，其中有5％會(huì)導(dǎo)致死亡。早在20世紀(jì)70年代b族鏈球菌就已經(jīng)被證實(shí)為圍產(chǎn)期母嬰感染的重要致病菌之一。2010年美國(guó)疾病預(yù)防中心制定了《圍產(chǎn)期gbs預(yù)防指南》，建議孕婦于妊娠34～37周進(jìn)行g(shù)bs篩查。

目前，b族鏈球菌的診斷方法主要有培養(yǎng)法、免疫學(xué)方法、微生物自動(dòng)分析鑒定系統(tǒng)和熒光pcr方法。其中，培養(yǎng)法的特異性和敏感性高，但臨床檢測(cè)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)(至少需要24～48h，甚至更長(zhǎng)時(shí)間)、過(guò)程繁瑣、需要使用特殊的培養(yǎng)介質(zhì)以及易受雜菌影響，不適用于大范圍檢測(cè)。免疫學(xué)方法，如：乳膠凝集實(shí)驗(yàn)(latexagglutination，la)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzymelinkedimmunosorbentassay，elisa)，協(xié)同凝集試驗(yàn)(countercurrentimmunoelectrophotesis，coa)及對(duì)流免疫電泳(countercurrentimmunoelectrophotesis，cie)等，雖然特異性可以高達(dá)95％，但是敏感性不夠，檢出率較低。美國(guó)fda已于1997年發(fā)出了這些方法假陰性和假陽(yáng)性率均很高的可行度警告。微生物自動(dòng)分析鑒定系統(tǒng)能全面自動(dòng)化地對(duì)微生物進(jìn)行鑒定、檢驗(yàn)，但耗時(shí)長(zhǎng)、鑒定過(guò)程繁瑣，對(duì)工作人員的經(jīng)驗(yàn)要求高，設(shè)備昂貴，成本高，不利于大范圍推廣。

而近年來(lái)興起的熒光pcr方法在很大程度上克服了上述方法的缺點(diǎn)。熒光定量pcr技術(shù)是基于傳統(tǒng)pcr技術(shù)并結(jié)合光譜技術(shù)而發(fā)展起來(lái)的一種更靈敏、更特異、更精確的核酸檢測(cè)技術(shù)。檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性高，能動(dòng)態(tài)反應(yīng)患者治療前、后病原體動(dòng)態(tài)變化及與臨床的關(guān)系，且整個(gè)過(guò)程中避免了傳統(tǒng)pcr需后處理的問(wèn)題，減少了污染。實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)使用一種帶有熒光檢測(cè)裝置的pcr擴(kuò)增儀，熒光檢測(cè)裝置能夠按照一定的程序周期性地發(fā)出特定波長(zhǎng)的激發(fā)光，收集檢測(cè)熒光信號(hào)，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的動(dòng)態(tài)變化實(shí)時(shí)反映pcr的每個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增水平，試驗(yàn)結(jié)束后可通過(guò)軟件自動(dòng)分析獲得擴(kuò)增曲線，根據(jù)擴(kuò)增曲線與熒光閾值線的交點(diǎn)(即ct值)以及擴(kuò)增曲線的形狀，可以判斷陰、陽(yáng)性結(jié)果；如果同一反應(yīng)中有已知濃度的定量參考品或標(biāo)準(zhǔn)品，則可以通過(guò)軟件自動(dòng)分析獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，由此實(shí)現(xiàn)對(duì)未知樣本的定值(即定量檢測(cè))。與傳統(tǒng)的pcr相對(duì)比，其在反應(yīng)體系中增加了一條兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的探針。探針結(jié)構(gòu)完整時(shí)，熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，呈現(xiàn)淬滅效應(yīng)；如果擴(kuò)增過(guò)程中有靶序列的存在，隨著目標(biāo)片段的延伸，探針?lè)肿又饾u被taq酶水解切斷，熒光報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)相互解離，阻斷了二者間熒光能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)被熒光檢測(cè)裝置收集。隨著擴(kuò)增的進(jìn)行，熒光信號(hào)隨著目的片段的擴(kuò)增而呈現(xiàn)線性增強(qiáng)。試驗(yàn)結(jié)束后，可以通過(guò)熒光pcr儀自帶的軟件自動(dòng)分析數(shù)據(jù)，可以獲得陰、陽(yáng)性結(jié)果和樣本濃度的定值結(jié)果，因此，該技術(shù)在靶多核苷酸樣品的檢測(cè)和定量分析中，已逐漸取代傳統(tǒng)的pcr方法，得到十分廣泛的應(yīng)用。研究顯示，實(shí)時(shí)熒光pcr檢測(cè)方法與標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)菌培養(yǎng)方法在gbs檢測(cè)的敏感性和特異性方面均達(dá)90％以上，已得到美國(guó)食品和藥品管理局(fda)的批準(zhǔn)并應(yīng)用于臨床篩檢。

在pcr檢測(cè)前，需要從臨床樣本中提取出核酸作為模板進(jìn)行擴(kuò)增。在目前針對(duì)孕婦的gbs篩查中，樣本的采集一般使用無(wú)菌拭子，拭子頭上使用滌綸、纖維或尼絨等材料，拭子柄為塑料材質(zhì)。在采樣時(shí)，將拭子頭分別放置于生殖道和直腸中旋轉(zhuǎn)采集分泌物。在進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光pcr擴(kuò)增前，需要對(duì)拭子進(jìn)行樣本處理。目前使用的方法是先將采樣后的拭子，放入清洗液中，用震蕩器高速振蕩幾分種，將菌從拭子頭上釋放下來(lái)，制備成標(biāo)本懸浮液，再進(jìn)行后續(xù)的核酸提取等過(guò)程，如將標(biāo)本懸浮液濃縮、洗滌，再加裂解液、煮沸、高速離心等。最后取一定的上清為pcr擴(kuò)增模板。在實(shí)際臨床應(yīng)用中，此方法暴露出諸多不足之處：(1)核酸提取過(guò)程復(fù)雜，需要多種儀器設(shè)備；(2)樣本處理耗時(shí)長(zhǎng)，且在處理樣本時(shí)，經(jīng)過(guò)富集、清洗、煮沸裂解、高速離心等多個(gè)步驟，dna損耗嚴(yán)重；(3)在樣本處理中涉及的高溫加熱等步驟，如果管蓋崩開(kāi)，會(huì)存在氣溶膠污染、樣本損失等風(fēng)險(xiǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供了一種熒光pcr定量檢測(cè)b族鏈球菌的樣本前處理方法及其應(yīng)用，此方法通過(guò)采用b族鏈球菌裂解酶直接在拭子上原位裂解b族鏈球菌，得到的裂解液可直接用于熒光pcr檢測(cè)，解決了現(xiàn)有技術(shù)中樣本處理過(guò)程繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、樣本污染風(fēng)險(xiǎn)等問(wèn)題。

本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：

一種熒光pcr定量檢測(cè)b族鏈球菌的樣本拭子前處理方法，向待測(cè)的拭子上滴加b族鏈球菌裂解酶液，室溫靜置5～30min后，直接從拭子上擠出裂解液，并將裂解液離心，取適量上清液作為熒光pcr擴(kuò)增模板。

進(jìn)一步地，所述的b族鏈球菌裂解酶液包括gbs-plysb酶液和b族鏈球菌裂解酶緩沖液。

進(jìn)一步地，所述gbs-plysb酶的氨基酸序列為：

matyqeyksrsngnaydidgsfgaqcwdgyadyckylglpyanctntgyardiweqrhengilnyfdevevmqagdvaifmvvdgvtpyshvaifdsdagggygwflgqnqggangaynivkipysatyptafrpkvfknavtvtgniglnkgdyfidvsayqqadltttcqqagttktigssrsyretgtmtvtvdalnvrrapntsgeivavykrgesfdydtviidvngyvwvsyiggsgkrnyvatgatkdgkrfgnawgtfk。

進(jìn)一步地，所述gbs-plysb酶液中g(shù)bs-plysb酶的濃度為20～200μg/ml。

進(jìn)一步地，所述的b族鏈球菌裂解酶緩沖液包括tris緩沖液、甘氨酸-naoh緩沖液、hepes緩沖、mes緩沖液中的一種或幾種。

進(jìn)一步地，所述b族鏈球菌裂解酶緩沖液的濃度為10～100mmol/l，ph值為6～8。

一種熒光pcr定量檢測(cè)b族鏈球菌的樣本拭子前處理方法的應(yīng)用，所述方法應(yīng)用于制備檢測(cè)孕婦生殖道或腸道中b族鏈球菌的熒光定量pcr檢測(cè)試劑盒上。

有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，此方法通過(guò)采用b族鏈球菌裂解酶直接在拭子上原位裂解b族鏈球菌，得到的裂解液可直接用于熒光pcr檢測(cè)，解決了現(xiàn)有技術(shù)中樣本處理過(guò)程繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、樣本污染風(fēng)險(xiǎn)等問(wèn)題，且采用本方法熒光pcr定量檢測(cè)b族鏈球菌時(shí)，鏈球菌裂解效果更好，核酸提取效率更高。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為本發(fā)明熒光pcr定量檢測(cè)b族鏈球菌方法流程圖；

圖2為分別以本發(fā)明方法和商業(yè)化試劑盒處理樣本后的裂解液為模板，用于熒光定量pcr檢測(cè)的結(jié)果對(duì)比圖，其中曲線1為在拭子上原位裂解菌體處理所得到的擴(kuò)增曲線，曲線2為商業(yè)化試劑盒處理樣本所得到的擴(kuò)增曲線。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)例僅用來(lái)具體說(shuō)明本發(fā)明的某些實(shí)施例，且不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。對(duì)本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容可以同時(shí)從材料、方法和反應(yīng)條件進(jìn)行改進(jìn)，所有這些改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明的的精神和范圍之內(nèi)。

實(shí)施例1：采用本發(fā)明方法進(jìn)行熒光pcr定量檢測(cè)b族鏈球菌的具體實(shí)施步驟

如圖1所示，首先用拭子采樣，向待測(cè)的拭子上滴加b族鏈球菌裂解酶液，室溫靜置5-30min后，直接從拭子上擠出裂解液(如將拭子頭壓在離心管壁上)，并將擠出的裂解液離心，最后取適量上清液為pcr擴(kuò)增模板至pcr體系中，收集熒光信號(hào)。其顯著特點(diǎn)是不需要將待測(cè)細(xì)菌從拭子上洗下來(lái)制備標(biāo)本懸液，而是將裂解液直接滴在拭子頭上進(jìn)行原位裂解。待裂解完成后，從拭子頭上擠出一定量的裂解液，短暫離心，根據(jù)熒光定量pcr試劑盒的要求，取一定量的上清液作為模板去進(jìn)行pcr擴(kuò)增。該方法能大大簡(jiǎn)化從拭子上提取核酸所需的操作和步驟。

為了便于說(shuō)明本方法的優(yōu)點(diǎn)，下面的具體實(shí)施例中，采用一株臨床分離的無(wú)乳鏈球菌作為模擬樣本，使用商業(yè)化的b簇鏈球菌核酸檢測(cè)試劑盒(熒光pcr法)(泰普生物科學(xué)(中國(guó))有限公司)作為對(duì)照，按其說(shuō)明書(shū)實(shí)驗(yàn)，同時(shí)采用本發(fā)明方法，使用能在常溫下快速裂解鏈球菌的鏈球菌裂解酶試劑盒(試劑盒為武漢賽思銳微生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品編號(hào)：迅裂01)，進(jìn)行對(duì)比測(cè)試。對(duì)于獲得的裂解液模板，采用商業(yè)化的b簇鏈球菌核酸檢測(cè)試劑盒(熒光pcr法)(泰普生物科學(xué)(中國(guó))有限公司)中的pcr試劑進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。

一、gbs-plysb酶制備

1.plygbs的催化域、plyss2的細(xì)胞壁結(jié)合域的制備

全序列合成裂解酶plygbs和裂解酶plyss2基因片段(南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司)，合成序列裝入puc57質(zhì)粒中。以plygbs基因?yàn)槟０?，gbs180-f/gbs180-r為引物，擴(kuò)增得plygbs的催化域gbs180的序列，以plyss2基因?yàn)槟０?，plysb-f/plysb-r為引物，擴(kuò)增得plyss2的細(xì)胞壁結(jié)合域。克隆構(gòu)建中所用到的引物和酶切位點(diǎn)信息如下：

gbs180-f:5-ttaaccatgggcatggctacctaccagg-3

gbs180-r:5-tataggatccgatcgttttggtcgtgc-3

plysb-f:5-tataggatcctctcgttcctatcgcgag-3

plysb-r:5-tatactcgagtttaaatgtaccccaag-3

gbs180-f引物下劃線標(biāo)注的是限制性內(nèi)切酶ncoi位點(diǎn)，gbs180-r和plysb-f引物下劃線標(biāo)注的是限制性內(nèi)切酶bamhi位點(diǎn)，plysb-r引物下劃線標(biāo)注的是限制性內(nèi)切酶xhoi位點(diǎn)。

pcr擴(kuò)增基因片段的程序如下：以2μl基因?yàn)槟０澹骷尤胍?μg進(jìn)行pcr擴(kuò)增，pcr反應(yīng)條件為：(1)94℃預(yù)變性5min；(2)94℃變性30sec，62℃，45sec，72℃，45sec，30個(gè)循環(huán)；(3)72℃延伸10min。

2.可溶表達(dá)gbs-plysb蛋白質(zhì)

將上述片段用相應(yīng)的酶消化后連入用ncoi和xhoi消化后的pet28b(+)載體中，得到gbs-plysb的表達(dá)載體pet28b-gbs-plysb。然后將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21(de3)。以gbs180-f/plysb-r為引物對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行pcr驗(yàn)證，可擴(kuò)增得到全長(zhǎng)的gbs-plysb基因。

3.gbs-plysb的表達(dá)純化

將表達(dá)菌株bl21(de3)/pet28b-gbs-plysb用2mm的iptg低溫誘導(dǎo)表達(dá)。收集菌體后超聲破碎，取上清過(guò)ni親和柱，收集250mm洗脫峰，后于pbs中透析過(guò)夜。

透析后的蛋白可進(jìn)一步經(jīng)過(guò)離子交換樹(shù)脂純化，過(guò)hitrapqsepharoseffcolumn(gehealthcare)，收集柱流出物。將柱流出物過(guò)hitrapspsepharoseffcolumn，然后用1m的nacl梯度洗脫，分段收集洗脫峰。將有活性的各管混合后于pbs中透析過(guò)夜，即為純化后的酶液。該酶液進(jìn)一步加入冷凍保護(hù)劑后，即可通過(guò)冷凍干燥制備為凍干粉，便于在低溫和常溫下長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存，保持酶活性。

二、試劑和拭子樣本準(zhǔn)備

按照鏈球菌裂解酶試劑盒說(shuō)明，將其中的復(fù)蘇液加入到鏈球菌凍干粉瓶中混合備用；

裂解酶溶液放入4℃冰箱備用；

按照商業(yè)化試劑盒說(shuō)明，取出10x濃縮清洗液與滅菌純水按1：9(體積比)進(jìn)行稀釋，放入4℃冰箱備用；

計(jì)算需要進(jìn)行的反應(yīng)管數(shù)n(標(biāo)本數(shù)+陰性、陽(yáng)性對(duì)照)后，取出gbs-pcr反應(yīng)液和酶等，將nx44.3μlgbs-pcr反應(yīng)液、nx0.5μltaq酶液、nx0.2μlung加入到一個(gè)離心管并振蕩混勻，瞬時(shí)離心后，分裝至n個(gè)pcr反應(yīng)管中，每管45μl,蓋上管蓋后轉(zhuǎn)移到加樣區(qū)，避光放到4℃冰箱備用。

模擬樣本制備和拭子采樣：取少量保存的無(wú)乳鏈球菌液，在超凈臺(tái)接種到lb培養(yǎng)基中37℃過(guò)夜培養(yǎng)，取5ml到15ml離心管中，10000r/min離心5min，去上清，取5ml泰普試劑盒中的清洗液重懸菌體，再用清洗液稀釋1000倍后的菌液作為模擬分泌物。取無(wú)菌拭子(一次性使用拭子(女性拭子)，江蘇康健醫(yī)療用品有限公司)2支，分別將拭子頭浸入到菌液中5s取出,將采集好的無(wú)菌拭子放回?zé)o菌拭子套管中，完成采樣。

三、樣本處理：

方法a：按商業(yè)化試劑盒說(shuō)明書(shū)中的方法。

在拭子套管中加入1ml清洗液，用振蕩器高速震蕩2min制成標(biāo)本懸浮液。取出全部樣本放入1.5ml離心管中，13000r/min離心5min去上清，加入50微升清洗液重懸。樣本管中加入1管試劑盒中的提取固形物，用強(qiáng)力震蕩器(美國(guó)vortex-genie)高速渦旋震蕩5min。將震蕩后的樣本管，95℃水浴2min,立即冰浴2-5min后，13000r/min離心1min，取5μl上清液到pcr體系中擴(kuò)增。

方法b：在拭子上原位裂解b族鏈球菌進(jìn)行熒光pcr檢測(cè)

在拭子頭上滴加濃度為20μg/ml的族鏈球菌裂解酶液gbs-plysb酶液100μl，將拭子放回拭子套管中，室溫靜置10min。從套管中取出拭子，將拭子頭插入一個(gè)1ml的無(wú)菌塑料移液器槍頭中，擠壓出約20-50μl的裂解液到一個(gè)1.5ml的無(wú)菌離心管中。將裂解液13000r/min離心1min，取上清5μl用于pcr擴(kuò)增。

四、熒光實(shí)時(shí)定量pcr檢測(cè)：

1.設(shè)定pcr程序：

37℃，2min；

94℃，2min；

循環(huán)10次：94℃，20s；55℃，45s；

循環(huán)30次：94℃，20s；55℃，45s。

采用bio-radcfxconnect熒光定量pcr儀，gbs檢測(cè)熒光素為fam。在第四階段的55℃，45s階段收集熒光信號(hào)，所得到的擴(kuò)增曲線如圖2所示。

本實(shí)例中，商業(yè)化試劑盒的方法所得到的擴(kuò)增曲線的ct值為16.20，棉拭子上原位裂解b族鏈球菌法所得到的擴(kuò)增曲線的ct值為12.8。從定性結(jié)果來(lái)看，兩者都得到了陽(yáng)性結(jié)果，沒(méi)有影響結(jié)果的判讀。但從數(shù)值上來(lái)看，拭子上原位裂解b族鏈球菌法的提取效率比商業(yè)化試劑盒方法的ct值小，裂解效果相對(duì)較好，其原因在于采用目前商業(yè)化試劑盒中的方法處理樣本時(shí)，需要將菌從拭子上釋放下來(lái)，該過(guò)程不會(huì)100％的釋放，且在標(biāo)本懸液的后續(xù)離心濃縮等處理中，一部分的菌也可能損失，導(dǎo)致最終得到的核酸模板數(shù)較少。而在本發(fā)明方法中，菌無(wú)需從拭子上釋放，直接在原位被所加的b族鏈球菌裂解酶液裂解，拭子上的菌能100％得到裂解，且沒(méi)有后續(xù)處理過(guò)程，所釋放出來(lái)的核酸量更多。更重要的是，相對(duì)于商業(yè)化試劑盒的樣本處理方法，拭子原位裂解法的步驟縮短，操作簡(jiǎn)便，時(shí)間只需要12min左右，而商業(yè)化方法需要25min左右。此外，在整個(gè)處理過(guò)程中，本發(fā)明方法不需要震蕩器、干浴鍋和冰浴等設(shè)備，有助于節(jié)省樣本處理成本。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。