本發(fā)明為藥物合成領(lǐng)域，具體為一種多肽藥物比伐盧定的合成方法。

背景技術(shù)：

比伐盧定，英文名bivalirudin，商品名angiomax，由美國medicines公司申請，2000年12月經(jīng)fda批轉(zhuǎn)在美國上市，作為一種直接凝血酶抑制劑，它來源于水蛭素衍生物，是一種化學(xué)合成的含20個氨基酸的多肽，是凝血酶直接的、特異的、可逆性抑制劑。其相對分子質(zhì)量為2180.29，分子式：c98h138n24o33，氨基酸序列為：d-phe-pro-arg-pro-gly-gly-gly-gly-asn-gly-asp-phe-glu-glu-ile-pro-glu-glu-tyr-leu-oh。早期的臨床研究顯示，比伐盧定抗凝療效確切，且出血事件的發(fā)生率較低，和傳統(tǒng)的肝素抗凝治療相比更為安全，對于接受經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(pci)的患者，比伐盧定可用于替代肝素，并且隨著對比伐盧定臨床試驗的不斷研究，其在別的適應(yīng)癥方面亦表現(xiàn)出了不錯的治療效果，因此比伐盧定的未來應(yīng)用前景極為廣闊。

關(guān)于比伐盧定的制備方法，國內(nèi)外已有大量報道。合成方法包括了固相合成、液相合成、固液相合成，本專利主要關(guān)注比伐盧定固相合成方法。

多數(shù)已報道的固相合成方法采用氨基酸逐個偶聯(lián)合成，周期長，逐步偶聯(lián)時樹脂反應(yīng)難以完全，因固相載體選用的取代值限制，總收率較低，同時雜質(zhì)較多，純化困難，且隨著反應(yīng)進(jìn)行，樹脂上的肽段變長，對于后上的活性較低的氨基酸，反應(yīng)困難或不完全。而部分報道雖對上述方法有所改進(jìn)，在逐個偶聯(lián)的氨基酸中，部分肽段采用一次性接入的制備方法，但對于后續(xù)的其他氨基酸接入，對于氨基酸接入反應(yīng)的難易度及完全度是一樣的，不會有改善。

本發(fā)明采用兩個肽片段分別固相合成，每個片段的收率都很高，且接入點選擇gly處，由于其活性強(qiáng)，且空間位阻小，使比伐盧定總收率也很高，且經(jīng)檢測比伐盧定中未發(fā)現(xiàn)光學(xué)異構(gòu)體，同時反應(yīng)條件溫和，成本低，條件簡單，易于產(chǎn)業(yè)化。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有方法合成收率低、生產(chǎn)成本高、產(chǎn)品純化困難等技術(shù)的不足，提出一種新的比伐盧定的制備及純化方法，該方法顯著提高了比伐盧定的收率與純度，反應(yīng)條件簡單可控，易于工業(yè)化生產(chǎn)。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

以2-cl-resin為載體，通過固相合成方法，以2-cl-resin為載體，以保護(hù)的氨基酸為原料，氨基酸投料量與樹脂載樣量按一定摩爾比，經(jīng)縮合、脫保護(hù)依次得到保護(hù)的肽片段，由兩個肽片段固相合成比伐盧定，兩個肽片段主要在gly處按一定摩爾比連接，包括10肽+10肽片段法，12肽+8肽片段法，13肽+7肽片段法，最后經(jīng)裂解劑脫掉保護(hù)基及樹脂，并經(jīng)高效液相制備純化、冷凍干燥，得比伐盧定純品，其中優(yōu)選10肽+10肽片段制備純化法。

1、其中，所述的一種比伐盧定的制備及純化方法中，10肽+10肽片段法，制備及純化步驟如下：

(1)以2-cl-resin為載體，通過固相合成方法，以fmoc和/或boc保護(hù)氨基酸為原料，氨基酸投料量與樹脂載樣量按一定摩爾比，縮合、脫保護(hù)依次得到保護(hù)的[1-10]肽樹脂，從樹脂上裂解下來后進(jìn)行純化，純化過程中加入有機(jī)溶劑，飽和烷烴、醚類、醚類與烷烴類溶劑的混合溶劑，優(yōu)選正己烷、正庚烷、乙醚、mtbe、ea-pe、ch2cl2，得到白色固體片段1，片段1的結(jié)構(gòu)如下：

boc-d-phe-pro-arg(pbf)-pro-gly-gly-gly-gly-asn(trt)-gly-oh；

(2)以2-cl-resin為載體，通過固相合成方法，以fmoc保護(hù)氨基酸為原料，氨基酸投料量與樹脂載樣量按一定摩爾比，縮合、脫保護(hù)依次得到保護(hù)的[11-20]肽樹脂，記為片段2，結(jié)構(gòu)如下：

fmoc-asp(otbu)-phe-glu(otbu)-glu(otbu)-ile-pro-glu(otbu)-glu(otbu)-tyr(tbu)-leu-樹脂；

(3)片段1與片段2按一定摩爾比固相接入片段2樹脂，得到序列為：boc-d-phe-pro-arg(pbf)-pro-gly-gly-gly-gly-asn(trt)-gly-asp(otbu)-phe-glu(otbu)-glu(otbu)-ile-pro-glu(otbu)-glu(otbu)-tyr(otbu)-leu-樹脂

使用裂解劑脫掉保護(hù)基及樹脂，并經(jīng)高效液相制備純化、冷凍干燥，即得比伐盧定純品。

根據(jù)所述的一種比伐盧定的制備及純化方法，其中步驟(1)與(2)中所用到的2-cl-resin取代度為0.5mmol～2.0mmol/g，優(yōu)選為0.8～1.5mmol/g；

所述脫保護(hù)試劑為20％哌啶dmf溶液，縮合過程中所用的縮合劑組合為hatu或dic與hobt的組合。

根據(jù)所述的一種比伐盧定的制備及純化方法，其中，縮合過程中所使用的有機(jī)堿為dipea、tea、nmr中的任意一種。

根據(jù)所述一種比伐盧定的制備及純化方法，其中，氨基酸縮合反應(yīng)時間為0.5-4小時。

根據(jù)所述一種比伐盧定的制備及純化方法，其中，氨基酸與樹脂載樣量摩爾比為2∶1～5∶1。

根據(jù)所述一種比伐盧定的制備及純化方法，其中，步驟(1)中片段1的裂解劑為ch2cl2-tfe(比例為1～4∶1，v/v)或者ch2cl2-tfe-acoh(6～8∶1～2∶1～2，v/v/v)，優(yōu)選ch2cl2-tfe(4∶1)，ch2cl2-tfe-acoh(8∶1∶1)。

根據(jù)所述一種比伐盧定的制備及純化方法，其中，步驟(1)中片段1的純化步驟中，加入飽和烷烴、醚類、ch2cl2、醚類與烷烴類溶劑的混合溶劑、ch2cl2，優(yōu)選正己烷、正庚烷、乙醚、mtbe、ea-pe，ch2cl2。

根據(jù)所述一種比伐盧定的制備及純化方法，其中，片段1與片段2的摩爾比為1.1～2∶1。

根據(jù)所述一種比伐盧定的制備及純化方法，其中，步驟(3)中比伐盧定肽樹脂的裂解劑為ch2cl2-tfa(1～4∶1)或tfa-tips-h2o(90～95∶2.5～5∶2.5～5)，優(yōu)選tfa-tips-h2o(90～95∶2.5～5∶2.5～5)。

根據(jù)所述一種比伐盧定的制備及純化方法，其中，步驟(3)中純化使用高效液相色譜法，純化條件：以十八烷基鍵合硅膠為固定相(ymc公司的triartprepc18-s)，色譜柱規(guī)格為250×30mm，粒徑10μm，粒空隙12nm，流動相a：0.1％三氟乙酸水溶液，流動相b：0.1％三氟乙酸乙腈溶液，檢測波長210nm，設(shè)置洗脫梯度。

2、其中，所述的一種比伐盧定的制備及純化方法中，12肽+8肽片段法，制備及純化步驟如下：

(1)以2-cl-resin為載體，通過固相合成方法，以fmoc和/或boc保護(hù)氨基酸為原料，氨基酸投料量與樹脂載樣量按一定摩爾比，經(jīng)縮合、脫保護(hù)依次得到保護(hù)的[1-8]肽樹脂，從樹脂上裂解下來后進(jìn)行純化，純化過程中加入有機(jī)溶劑，飽和烷烴、醚類、醚類與烷烴類溶劑的混合溶劑，優(yōu)選正己烷、正庚烷、乙醚、mtbe、ea-pe、ch2cl2，得到白色固體片段1，片段1的結(jié)構(gòu)如下：

boc-d-phe-pro-arg(pbf)-pro-gly-gly-gly-gly-oh；

(2)以2-cl-resin為載體，通過固相合成方法，以fmoc保護(hù)氨基酸為原料，氨基酸投料量與樹脂載樣量按一定摩爾比，縮合、脫保護(hù)依次得到保護(hù)的[9-20]肽樹脂，記為片段2，結(jié)構(gòu)如下：

fmoc-asn(trt)-gly-asp(otbu)-phe-glu(otbu)-glu(otbu)-ile-pro-glu(otbu)-glu(otbu)-tyr(tbu)-leu-樹脂。

(3)片段1與片段2按一定摩爾比固相接入片段2樹脂，得到序列為：boc-d-phe-pro-arg(pbf)-pro-gly-gly-gly-gly-asn(trt)-gly-asp(otbu)-phe-glu(otbu)-glu(otbu)-ile-pro-glu(otbu)-glu(otbu)-tyr(otbu)-leu-樹脂

使用裂解劑脫掉保護(hù)基及樹脂，并經(jīng)高效液相制備純化、冷凍干燥，即得比伐盧定純品。

根據(jù)所述的一種比伐盧定的制備及純化方法，其中步驟(1)與(2)中所用到的2-cl-resin取代度為0.5mmol～2.0mmol/g，優(yōu)選為0.8～1.5mmol/g；

所述脫保護(hù)試劑為20％哌啶dmf溶液，縮合過程中所用的縮合劑組合為hatu或dic與hobt的組合。

根據(jù)所述的一種比伐盧定的制備及純化方法，其中，縮合過程中所使用的有機(jī)堿為dipea、tea、nmr中的任意一種。

根據(jù)所述一種比伐盧定的制備及純化方法，其中，氨基酸縮合反應(yīng)時間為0.5-4小時。

根據(jù)所述一種比伐盧定的制備及純化方法，其中，氨基酸與樹脂載樣量摩爾比為2∶1～5∶1。

根據(jù)所述一種比伐盧定的制備及純化方法，其中，步驟(1)中片段1的裂解劑為ch2cl2-tfe(比例為1～4∶1，v/v)或者ch2cl2-tfe-acoh(6～8∶1～2∶1～2，v/v/v)，優(yōu)選ch2cl2-tfe(4∶1)，ch2cl2-tfe-acoh(8∶1∶1)。

根據(jù)所述一種比伐盧定的制備及純化方法，其中，步驟(1)中片段1的純化步驟中，加入飽和烷烴、醚類、ch2cl2、醚類與烷烴類溶劑的混合溶劑、ch2cl2，優(yōu)選正己烷、正庚烷、乙醚、mtbe、ea-pe，ch2cl2。

根據(jù)所述一種比伐盧定的制備及純化方法，其中，片段1與片段2的摩爾比為1.1～2∶1。

根據(jù)所述一種比伐盧定的制備及純化方法，其中，步驟(3)中比伐盧定肽樹脂的裂解劑為ch2cl2-tfa(1～4∶1)或tfa-tips-h2o(90～95∶2.5～5∶2.5～5)，優(yōu)選tfa-tips-h2o(90～95∶2.5～5∶2.5～5)。

根據(jù)所述一種比伐盧定的制備及純化方法，其中，步驟(3)中純化使用高效液相色譜法，純化條件：以十八烷基鍵合硅膠為固定相(ymc公司的triartprepc18-s)，色譜柱規(guī)格為250×30mm，粒徑10μm，?？障?2nm，流動相a：0.1％三氟乙酸水溶液，流動相b：0.1％三氟乙酸乙腈溶液，檢測波長210nm，設(shè)置洗脫梯度。

3、其中，所述的一種比伐盧定的制備及純化方法中，13肽+7肽片段法，制備及純化步驟如下：

(1)以2-cl-resin為載體，通過固相合成方法，以fmoc和/或boc保護(hù)氨基酸為原料，氨基酸投料量與樹脂載樣量按一定摩爾比，縮合、脫保護(hù)依次得到保護(hù)的[1-7]肽樹脂，從樹脂上裂解下來后進(jìn)行純化，純化過程中加入有機(jī)溶劑，飽和烷烴、醚類、醚類與烷烴類溶劑的混合溶劑，優(yōu)選正己烷、正庚烷、乙醚、mtbe、ea-pe、ch2cl2，得到白色固體片段1，片段1的結(jié)構(gòu)如下：

boc-d-phe-pro-arg(pbf)-pro-gly-gly-gly-oh；

(2)以2-cl-resin為載體，通過固相合成方法，以fmoc保護(hù)氨基酸為原料，氨基酸投料量與樹脂載樣量按一定摩爾比，縮合、脫保護(hù)依次得到保護(hù)的[8-20]肽樹脂，記為片段2，結(jié)構(gòu)如下：

fmoc-gly-asn(trt)-gly-asp(otbu)-phe-glu(otbu)-glu(otbu)-ile-pro-glu(otbu)-glu(otbu)-tyr(tbu)-leu-樹脂。

(3)片段1與片段2按一定摩爾比固相接入片段2樹脂，得到序列為：boc-d-phe-pro-arg(pbf)-pro-g]y-gly-gly-gly-asn(trt)-gly-asp(otbu)-phe-glu(otbu)-glu(otbu)-ile-pro-glu(otbu)-glu(otbu)-tyr(otbu)-leu-樹脂

使用裂解劑脫掉保護(hù)基及樹脂，并經(jīng)高效液相制備純化、冷凍干燥，即得比伐盧定純品。

根據(jù)所述的一種比伐盧定的制備及純化方法，其中步驟(1)與(2)中所用到的2-cl-resin取代度為0.5mmol～2.0mmol/g，優(yōu)選為0.8～1.5mmol/g；

所述脫保護(hù)試劑為20％哌啶dmf溶液，縮合過程中所用的縮合劑組合為hatu或dic與hobt的組合。

根據(jù)所述的一種比伐盧定的制備及純化方法，其中，縮合過程中所使用的有機(jī)堿為dipea、tea、nmr中的任意一種。

根據(jù)所述一種比伐盧定的制備及純化方法，其中，氨基酸縮合反應(yīng)時間為0.5-4小時。

根據(jù)所述一種比伐盧定的制備及純化方法，其中，氨基酸與樹脂載樣量摩爾比為2∶1～5∶1。

根據(jù)所述一種比伐盧定的制備及純化方法，其中，步驟(1)中片段1的裂解劑為ch2cl2-tfe(比例為1～4∶1，v/v)或者ch2cl2-tfe-acoh(6～8∶1～2∶1～2，v/v/v)，優(yōu)選ch2cl2-tfe(4∶1)，ch2cl2-tfe-acoh(8∶1∶1)。

根據(jù)所述一種比伐盧定的制備及純化方法，其中，步驟(1)中片段1的純化步驟中，加入飽和烷烴、醚類、ch2cl2、醚類與烷烴類溶劑的混合溶劑、ch2cl2，優(yōu)選正己烷、正庚烷、乙醚、mtbe、ea-pe，ch2cl2。

根據(jù)所述一種比伐盧定的制備及純化方法，其中，片段1與片段2的摩爾比為1.1～2∶1。

根據(jù)所述一種比伐盧定的制備及純化方法，其中，步驟(3)中比伐盧定肽樹脂的裂解劑為ch2cl2-tfa(1～4∶1)或tfa-tips-h2o(90～95∶2.5～5∶2.5～5)，優(yōu)選tfa-tips-h2o(90～95∶2.5～5∶2.5～5)。

根據(jù)所述一種比伐盧定的制備及純化方法，其中，步驟(3)中純化使用高效液相色譜法，純化條件：以十八烷基鍵合硅膠為固定相(ymc公司的triartprepc18-s)，色譜柱規(guī)格為250×30mm，粒徑10μm，?？障?2nm，流動相a：0.1％三氟乙酸水溶液，流動相b：0.1％三氟乙酸乙腈溶液，檢測波長210nm，設(shè)置洗脫梯度。

本發(fā)明采用兩個肽片段分別以2-cl-resin固相合成，每個片段的收率都很高，且接入點選擇gly處，由于其活性強(qiáng)，且空間位阻小，使比伐盧定總收率也很高，且不會有光學(xué)異構(gòu)體產(chǎn)生，同時該發(fā)明方法每步反應(yīng)所用縮合劑相同，對工業(yè)化生產(chǎn)非常有利，氨基酸使用比例不高，成本較低。

本發(fā)明涉及的英文縮寫所對應(yīng)的中文名稱見下表：

附圖說明

圖1為未經(jīng)純化的片段1的hplc圖

圖2為純化后的片段1的hplc圖

圖3為純化后的片段1的hrms圖

圖4為未經(jīng)純化的片段1得到的比伐盧定粗肽的hplc圖

圖5為純化片段1后所得比伐盧定粗肽的hplc圖

圖6為純化片段1后所得比伐盧定純品的hplc圖

圖7為純化片段1后所得比伐盧定純品的hrms圖

具體實施方式

根據(jù)下述實施例，可以更好的理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本說明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。

1、10肽+10肽片段法(實施例1-9)

實施例1：樹脂1的制備

固相反應(yīng)器中加入2-氯三苯甲基氯樹脂60.04g(取代度0.8mmol/g)、800ml無水ch2cl2，浸泡30min充分溶脹后除去溶劑，氮氣鼓吹下加入fmoc-gly-oh28.60g(96mmol)、dipea20ml、ch2cl2(800ml)，室溫緩慢攪拌1小時，再加入60ml甲醇繼續(xù)攪拌15分鐘。除去溶劑，樹脂經(jīng)ch2cl2洗滌(600ml×3次)。35℃減壓干燥至恒重，共計干燥15小時，稱重得fmoc-gly-樹脂74.83g，取代度0.83mmol。

實施例2：片段1的制備

取實施例1中獲得的fmoc-gly-樹脂70.05g加入至多肽反應(yīng)器中，20％哌啶-dmf溶液600ml加入至上述所得樹脂中，緩慢攪拌30min后除去溶劑，樹脂dmf洗滌(600ml×3次)，然后依次接入其余2-10個保護(hù)的氨基酸，每次偶聯(lián)加入物料的量分別為：fmoc-asn(trt)-oh64.50g(116.46mmol，596.67)，fmoc-gly-oh34.64g(116.46mmol，297.31)，fmoc-gly-oh34.58g(116.46mmol，297.31)fmoc-gly-oh34.57g(116.46mmol，297.31)fmoc-gly-oh34.65g(116.46mmol，297.31)，fmoc-pro-oh39.30g(116.46mmol，337.37)，fmoc-arg(pbf)-oh75.55g(116.46mmol，648.77)，fmoc-pro-oh39.30g(116.46mmol，337.37)，boc-d-phe-oh30.88g(116.46mmol，265.30)hatu44.3g(116.46，380.23)，dipea41ml(232.93mmol)、dmf600ml，接肽完畢后，dmf洗滌(600ml×3次)，dcm洗滌(600ml×3次)，然后加入ch2cl2-三氟乙醇-冰乙酸(8∶1∶1，v/v/v)1100ml，室溫攪拌1小時過濾除去樹脂，濾液充分減壓濃縮，水浴溫度不超過40℃，得到黃色油狀物片段1，所得片段1的hplc圖見圖1。

實施例3：片段1的純化

實施例2所得黃色油狀物加入冷正庚烷300ml，強(qiáng)力攪拌30min，靜置，上層清液變?yōu)榈S色，傾去上層清液，然后再加入ch2cl280ml，攪拌使全部溶解，然后緩慢加入mtbe至960ml，攪拌30min，過濾，濾餅經(jīng)少量mtbe淋洗，得到類白色固體，室溫減壓干燥過夜，稱重得片段85.59g。所得片段1的hplc圖和hrms圖見圖2-圖3。

實施例4：樹脂2的制備

固相反應(yīng)器中加入2-氯三苯甲基氯樹脂50.10g(取代度0.83mmol/g)、800ml無水ch2cl2，浸泡30min充分溶脹后除去溶劑，氮氣鼓吹下加入fmoc-leu-oh29.39g(83.16mmol)、dipea15ml、ch2cl2(650ml)，室溫緩慢攪拌1小時，再加入50ml甲醇繼續(xù)攪拌15分鐘。除去溶劑，樹脂經(jīng)ch2cl2洗滌(500ml×3次)。35℃減壓干燥至恒重，共計干燥15小時，稱重得fmoc-leu-樹脂76.36g。

實施例5：片段2樹脂的制備

取fmoc-leu-樹脂15.11g加入至多肽反應(yīng)器中，20％哌啶-dmf溶液150ml加入至上述所得樹脂中，緩慢攪拌30min后過濾除去溶劑，樹脂dmf洗滌(200ml×3次)，然后依次接入其余2-10個氨基酸，每次偶聯(lián)加入氨基酸的量分別為：fmoc-tyr(tbu)-oh9.45g(20.57mmol，459.55)，fmoc-glu(otbu)-oh8.74g(20.57mmol，425.47)，fmoc-glu(otbu)-oh8.75g(20.57mmol，425.47)，fmoc-pro-oh6.94g(20.57mmol，337.37)，fmoc-ile-oh7.27g(20.57mmol，353.41)，fmoc-glu(otbu)-oh8.75g(20.57mmol，425.47)，fmoc-glu(otbu)-oh8.75g(20.57mmol，425.47)，fmoc-phe-oh7.98g(20.57mmol，387.43)，fmoc-asp(otbu)-oh8.46g(20.57mmol，411.45)，hatu7.82g(20.57mmol，380.23)，dipea8ml(40.14mmol)、dmf120ml，接肽完畢后，dmf洗滌(120ml×3次)，dcm洗滌(200ml×3次)，35℃真空干燥過夜，得到片段2樹脂47.18g。

實施例6：片段2樹脂的制備

取fmoc-leu-樹脂60.03g加入至多肽反應(yīng)器中，20％哌啶-dmf溶液600ml加入至上述所得樹脂中，緩慢攪拌30min后過濾除去溶劑，樹脂dmf洗滌(600ml×3次)，然后依次接入其余2-10個氨基酸，每次偶聯(lián)加入氨基酸的量分別為：fmoc-tyr(tbu)-oh37.46g(81.52mmol，459.55)，fmoc-glu(otbu)-oh34.68g(81.52mmol，425.47)，fmoc-glu(otbu)-oh34.68g(81.52mmol，425.47)，fmoc-pro-oh27.50g(81.52mmol，337.37)，fmoc-ile-oh28.81g(81.52mmol，353.41)，fmoc-glu(otbu)-oh34.68g(81.52mmol，425.47)，fmoc-glu(otbu)-oh34.68g(81.52mmol，425.47)，fmoc-phe-oh31.59g(81.52mmol，387.43)，fmoc-asp(otbu)-oh33.53g(81.52mmol，411.45)，hatu30.98g(81.52mmol，380.23)，dipea28ml(163.04mmol)、dmf500ml，接肽完畢后，dmf洗滌(500ml×3次)，得到片段2樹脂。

實施例7：比伐盧定的制備

取實施例2中的片段15.0g溶于dmf80ml中，再加入dic0.91g，hobt0.95g，實施例5中的干燥片段24.7g，緩慢攪拌12小時，之后過濾，樹脂經(jīng)過dmf(50ml×3次)洗滌，加入至切割液三氟乙酸-三異丙基硅-水(95∶2.5∶2.5，v/v/v)40ml中室溫攪拌2小時，過濾，濾液減壓濃縮，殘余物加入約60ml冷乙醚攪拌，得到白色懸浮物，過濾，濾餅35℃減壓干燥過夜得到粗品肽4.90g，經(jīng)過hplc檢測其純度較低，具體見圖4。

實施例8：比伐盧定的制備

取實施例3中的片段150.0g溶于dmf800ml中，再加入dic9.1g，hobt9.5g，實施例5中的片段2g，緩慢攪拌12小時，之后過濾，樹脂經(jīng)過dmf(500ml×3次)洗滌，加入至切割液三氟乙酸-三異丙基硅-水(95∶2.5∶2.5，v/v/v)500ml中室溫攪拌2小時，過濾，濾液減壓濃縮，殘余物加入約600ml冷乙醚攪拌，得到白色懸浮物，過濾，濾餅35℃減壓干燥過夜得到粗品肽50.5g，其hplc圖見圖5。

實施例9：比伐盧定粗品純化

純化條件：以十八烷基鍵合硅膠為固定相(ymc公司的triartprepc18-s)，色譜柱規(guī)格為250×30mm，粒徑10μm，?？障?2nm。流動相a：0.1％三氟乙酸水溶液，流動相b：0.1％三氟乙酸乙腈溶液。檢測波長210nm。設(shè)置洗脫梯度。

粗品肽50.5g，經(jīng)過反相制備色譜制備純化，冷凍干燥得到成品40.7g，收率80.5％，純度99.5％。所得比伐盧定hplc圖和hrms圖見圖6-圖7。

2、12肽+8肽片段法(實施例10-14)

實施例10：樹脂1的制備

固相反應(yīng)器中加入2-氯三苯甲基氯樹脂50.10g(取代度1.0mmol/g)、700ml無水ch2cl2，浸泡30min充分溶脹后除去溶劑，氮氣鼓吹下加入fmoc-gly-oh29.73g(100mmol)、dipea21ml、ch2cl2(700ml)，室溫緩慢攪拌1小時，再加入50ml甲醇繼續(xù)攪拌約15min。除去溶劑，樹脂經(jīng)ch2cl2洗滌(500ml×3次)。35℃減壓干燥至恒重，共計干燥15小時，稱重得fmoc-gly-樹脂64.34g，取代度1.1mmol/g。

實施例11：片段1的制備

取實施例10中獲得的fmoc-gly-樹脂60.03g加入至多肽反應(yīng)器中，20％哌啶-dmf溶液500ml加入至上述所得樹脂中，緩慢攪拌30min后除去溶劑，樹脂dmf洗滌(500ml×3次)，然后依次接入其余2-8個保護(hù)的氨基酸，每次偶聯(lián)加入物料的量分別為：fmoc-gly-oh38.14g(128.3mmol，297.31)，fmoc-gly-oh38.14g(128.3mmol，297.31)，fmoc-gly-oh38.14g(128.3mmol，297.31)，fmoc-pro-oh43.30g(128.3mmol，337.37)，fmoc-arg(pbf)-oh83.25g(128.3mmol，648.77)，fmoc-pro-oh43.31g(128.3mmol，337.37)，boc-d-phe-oh34.04g(128.3mmol，265.30)，hatu48.78g(128.3mmol，380.23)，dipea45ml(256.6mmol)、dmf500ml，接肽完畢后，dmf洗滌(500ml×3次)，dcm洗滌(500ml×3次)，然后加入ch2cl2-三氟乙醇-冰乙酸(8∶1∶1，v/v/v)1200ml，室溫攪拌1小時過濾除去樹脂，濾液充分減壓濃縮，水浴溫度不超過40℃，得到淡黃色粘稠油狀物，然后乙酸乙酯200ml溶解，緩慢加入冷凍mtbe至淡黃色固體大量析出，攪拌30min，過濾，濾餅室溫減壓干燥過夜，得到片段149.87g片段1為：

boc-d-phe-pro-arg(pbf)-pro-gly-gly-gly-gly-oh；

實施例12：樹脂2的制備

固相反應(yīng)器中加入2-氯三苯甲基氯樹脂55.10g(取代度1.1mmol/g)、800ml無水ch2cl2，浸泡30min充分溶脹后除去溶劑，氮氣鼓吹下加入fmoc-leu-oh42.72g(121.22mmol)、dipea20ml、ch2cl2(800ml)，室溫緩慢攪拌1小時，再加入60ml甲醇繼續(xù)攪拌15min。除去溶劑，樹脂經(jīng)ch2cl2洗滌(600ml×3次)。35℃減壓干燥至恒重，共計干燥15小時，稱重得fmoc-leu-樹脂74.25g。

實施例13：片段2樹脂的制備

取fmoc-leu-樹脂35.00g加入至多肽反應(yīng)器中，20％哌啶-dmf溶液400ml加入至上述所得樹脂中，緩慢攪拌30min后過濾除去溶劑，樹脂dmf洗滌(400ml×3次)，然后依次接入其余2-12個氨基酸，每次偶聯(lián)加入氨基酸的量分別為：fmoc-tyr(tbu)-oh26.26g(57.14mmol，459.55)，fmoc-glu(otbu)-oh24.31g(57.14mmol，425.47)，fmoc-glu(otbu)-oh24.31g(57.14mmol，425.47)，fmoc-pro-oh19.26g(57.14mmol，337.37)，fmoc-ile-oh20.20g(57.14mmol，353.41)，fmoc-glu(otbu)-oh24.31g(57.15mmol，425.47)，fmoc-glu(otbu)-oh24.31g(57.14mmol，425.47)，fmoc-phe-oh22.15g(57.14mmol，387.43)，fmoc-asp(otbu)-oh23.51g(57.14mmol，411.45)，fmoc-gly-oh16.97g(57.14mmol，297.31)，fmoc-asn(trt)-oh34.08g(57.14mmol，596.67)，hatu21.73g(57.14mmol，380.23)，dipea20ml(114.28mmol)、dmf400ml，接肽完畢后，dmf洗滌(400ml×3次)，得到片段2樹脂：fmoc-asn(trt)-gly-asp(otbu)-phe-glu(otbu)-glu(otbu)-ile-pro-glu(otbu)-glu(otbu)-tyr(tbu)-leu-樹脂。

實施例14：比伐盧定的制備

取實施例11中的片段140.2g溶于dmf500ml中，再加入dic7.2g，hobt7.7g，實施例13中的片段2，緩慢攪拌12小時，之后過濾，樹脂經(jīng)過dmf(500ml×3次)洗滌，加入至切割液三氟乙酸-三異丙基硅-水(95∶2.5∶2.5，v/v/v)500ml中室溫攪拌2小時，過濾，濾液減壓濃縮，殘余物加入500ml冷乙醚攪拌，得到白色懸浮物，過濾，濾餅35℃減壓干燥過夜得到粗品肽71.4g，經(jīng)過反相制備色譜制備純化，冷凍干燥得到成品51.7g，收率72.4％，純度99.4％。

2、13肽+7肽片段法(實施例15-19)

片段1的結(jié)構(gòu)：boc-d-phe-pro-arg(pbf)-pro-gly-gly-gly-oh；

實施例15：重復(fù)實施例10的方法，制備fmoc-gly-樹脂，得到fmoc-gly-樹脂63.24g

實施例16：片段1的制備

取實施例15中獲得的fmoc-gly-樹脂60.00g加入至多肽反應(yīng)器中，20％哌啶-dmf溶液500ml加入至上述所得樹脂中，緩慢攪拌30min后除去溶劑，樹脂dmf洗滌(500ml×3次)，然后依次接入其余2-7個保護(hù)的氨基酸，每次偶聯(lián)加入物料的量分別為：fmoc-gly-oh38.77g(130.4mmol，297.31)，fmoc-gly-oh38.77g(130.3mmol，297.31)，fmoc-pro-oh43.98g(130.4mmol，337.37)，fmoc-arg(pbf)-oh84.60g(130.4mmol，648.77)，fmoc-pro-oh44.01g(130.4mmol，337.37)，boc-d-phe-oh34.60g(130.4mmol，265.30)，hatu49.58g(130.4mmol，380.23)，dipea45ml(260.8mmol)、dmf500ml，接肽完畢后，dmf洗滌(500ml×3次)，dcm洗滌(500ml×3次)，然后加入ch2cl2-三氟乙醇-冰乙酸(8∶1∶1，v/v/v)1200ml，室溫攪拌1小時過濾除去樹脂，濾液充分減壓濃縮，水浴溫度不超過40℃，得到淡黃色粘稠油狀物，然后乙酸乙酯200ml溶解，緩慢加入冷凍mtbe至淡黃色固體大量析出，攪拌30min，過濾，濾餅室溫減壓干燥過夜，得到片段145.46g，片段1為：

boc-d-phe-pro-arg(pbf)-pro-gly-gly-gly-oh

實施例17：樹脂2的制備

固相反應(yīng)器中加入2-氯三苯甲基氯樹脂35.10g(取代度1.1mmol/g)、550ml無水ch2cl2，浸泡30min充分溶脹后除去溶劑，氮氣鼓吹下加入fmoc-leu-oh27.32g(77.22mmol)、dipea26ml、ch2cl2(550ml)，室溫緩慢攪拌1h，再加入45ml甲醇繼續(xù)攪拌15min。除去溶劑，樹脂經(jīng)ch2cl2洗滌(500ml×3次)。35℃減壓干燥至恒重，共計干燥15小時，稱重得fmoc-leu-樹脂46.64g。

實施例18：片段2樹脂的制備

取實施例17中樹脂242.00g加入至多肽反應(yīng)器中，20％哌啶-dmf溶液500ml加入至上述所得樹脂中，緩慢攪拌30min后過濾除去溶劑，樹脂dmf洗滌(500ml×3次)，然后依次接入其余2-13個氨基酸，每次偶聯(lián)加入氨基酸的量分別為：fmoc-tyr(tbu)-oh39.96g(86.90mmol，459.55)，fmoc-glu(otbu)-oh36.97g(86.90mmol，425.47)，fmoc-glu(otbu)-oh36.97g(86.90mmol，425.47)，fmoc-pro-oh29.32g(86.90mmol，337.37)，fmoc-ile-oh30.70g(86.90mmol，353.41)，fmoc-glu(otbu)-oh36.97g(86.90mmol，425.47)，fmoc-glu(otbu)-oh36.97g(86.90mmol，425.47)，fmoc-phe-oh33.67g(86.90mmol，387.43)，fmoc-asp(otbu)-oh35.75g(86.90mmol，411.45)，fmoc-gly-oh25.83g(86.90mmol，297.31)，fmoc-asn(trt)-oh51.85g(86.90mmol，596.67)，fmoc-gly-oh25.83g(86.90mmol，297.31)，hatu33.04g(86.90mmol，380.23)，dipea30ml(173.80mmol)、dmf600ml，接肽完畢后，dmf洗滌(600ml×3次)，得到片段2樹脂：

fmoc-gly-asn(trt)-gly-asp(otbu)-phe-glu(otbu)-glu(otbu)-ile-pro-glu(otbu)-glu(otbu)-tyr(tbu)-leu-樹脂；

實施例19：比伐盧定的制備

取實施例16中的片段145.0g溶于dmf500ml中，再加入dic10.9g，hobt11.7g、實施例18中的片段2，緩慢攪拌12小時，之后過濾，樹脂經(jīng)過dmf(500ml×3次)洗滌，加入至切割液三氟乙酸-三異丙基硅-水(95∶2.5∶2.5，v/v/v)600ml中室溫攪拌2h，過濾，濾液減壓濃縮，殘余物加入600ml冷乙醚攪拌，得到白色懸浮物，過濾，濾餅35℃減壓干燥過夜得到粗品肽79.4g，經(jīng)過反相制備色譜制備純化，冷凍干燥得到成品56.9g，收率71.7％，純度99.5％。

本發(fā)明所闡述的實施例并不是對本發(fā)明的限定，上述實施例和說明書中描述的僅為本發(fā)明的優(yōu)選例，任何本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)常規(guī)手段可以預(yù)見或者微調(diào)的變化和改進(jìn)，均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。