本發(fā)明涉及一種磁分離rca合成dna酶檢測金黃色葡萄球菌的方法，屬于食品安全技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)大量存在于自然界中，是一種典型的球型革蘭氏陽性菌。金葡菌對生長環(huán)境要求不嚴(yán)，肉類、魚類、乳制品等絕大多數(shù)食品都可為其提供良好的生長條件，在適宜的溫度下，可產(chǎn)生耐高溫的腸毒素從而引發(fā)食物中毒。我國每年發(fā)生大量由金葡菌引起的食物中毒事件，其主要表現(xiàn)癥狀為嘔吐和腹瀉。因此，對金葡菌作出快速、精確的檢測十分重要。

傳統(tǒng)檢測金葡菌的方法為根據(jù)國標(biāo)法對其進(jìn)行分離培養(yǎng)和生化鑒別，存在檢測耗時(shí)、操作繁瑣、檢測限高等缺點(diǎn)，無法達(dá)到現(xiàn)今食品中微生物安全性的要求。隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，許多新型快速檢測技術(shù)得到了廣泛的研究和應(yīng)用，如pcr技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)、生物傳感器和基因芯片技術(shù)等。

滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(rollingcircleamplification，rca)是近幾年發(fā)展起來的一種等溫條件下的dna復(fù)制技術(shù)，以短寡核苷酸鏈為引物，線性單鏈dna序列形成環(huán)狀模板，運(yùn)用具有鏈置換作用的dna聚合酶使引物生成包含若干串聯(lián)重復(fù)序列互補(bǔ)環(huán)狀模板的線性長鏈dna分子。rca具有操作簡單、高特異性、擴(kuò)增效率高、產(chǎn)物穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。dna酶是一段能形成g-四鏈體的核苷酸序列結(jié)合氯化血紅素后模擬過氧化物酶功能的復(fù)合物，可催化h2o2與魯米諾的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。滾環(huán)擴(kuò)增合成dna酶，結(jié)合了滾環(huán)擴(kuò)增的信號放大作用和dna酶的催化作用，雙重放大。

近年來，許多研究將dna夾心雜交原理結(jié)合納米材料應(yīng)用于致病菌的檢測，但其中也存在著一些檢測限高、靈敏度低和操作復(fù)雜等問題。因此，有必要建立一種檢測限低、靈敏度高且操作簡單的檢測金黃色葡萄球菌的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決目前存在的金黃色葡萄球菌檢測限高等問題，本發(fā)明提供了一種磁分離滾環(huán)擴(kuò)增合成dna酶檢測金黃色葡萄球菌的方法。本發(fā)明方法，將金黃色葡萄球菌的16srdna為一段特異性檢測的目標(biāo)dna片段，使用特異性探針修飾的磁納米粒子來結(jié)合和分離金葡菌的16srdna，不僅利用磁納米粒子的磁性分離作用，還利用探針和金葡菌16srdna間特異性的互補(bǔ)配對作用，從而快速地從復(fù)雜組分中分離金葡菌16srdna，并有效結(jié)合滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)合成的dna酶催化h2o2-魯米諾反應(yīng)系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)信號的雙重放大和檢測。

本發(fā)明利用dna夾心雜交原理設(shè)計(jì)了兩條特異性的探針——捕獲探針和信號探針。將捕獲探針修飾到磁納米粒子表面，該材料可快速地從復(fù)雜組分中結(jié)合和分離金黃色葡萄球菌的目標(biāo)dna序列，再加入包含滾環(huán)擴(kuò)增引物的信號探針與目標(biāo)dna序列互補(bǔ)雜交形成夾心結(jié)構(gòu)，然后滾環(huán)擴(kuò)增引物與相應(yīng)包含dna酶互補(bǔ)序列的模板互補(bǔ)配對引發(fā)滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)合成dna酶，利用dna酶進(jìn)行催化h2o2-魯米諾化學(xué)發(fā)光反應(yīng)系統(tǒng)，根據(jù)相對發(fā)光值的變化來定量檢測金葡菌。在一定范圍內(nèi)，金黃色葡萄球菌的濃度與相對發(fā)光值的變化呈線性相關(guān)，可達(dá)到對金黃色葡萄球菌定量檢測的目的。

本發(fā)明方法，包括如下步驟：

(5)先將捕獲探針與親和素修飾的磁納米粒子(avidin-mnps)混勻、孵育，使捕獲探針修飾到磁納米粒子表面，得到捕獲探針功能化的磁納米粒子；所述捕獲探針功能化的磁納米粒子能夠結(jié)合金黃色葡萄球菌的目標(biāo)dna序列；

(6)將捕獲探針功能化的磁納米粒子與含目標(biāo)dna序列的待測液孵育，然后加入信號探針，使目標(biāo)dna序列與捕獲探針、信號探針生成夾心結(jié)構(gòu)；所述信號探針上包含滾環(huán)擴(kuò)增引物；

(7)加入滾環(huán)擴(kuò)增模板，然后滾環(huán)擴(kuò)增引物與相應(yīng)包含dna酶互補(bǔ)序列的模板互補(bǔ)配對引發(fā)滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)合成dna酶；

(8)利用dna酶進(jìn)行催化h2o2-魯米諾化學(xué)發(fā)光反應(yīng)系統(tǒng)，根據(jù)相對發(fā)光值的變化來定量檢測金黃色葡萄球菌。

在一種實(shí)施方式中，所述方法還包括先配制一定含有不同濃度的目標(biāo)dna序列的標(biāo)準(zhǔn)樣品，建立不同濃度的目標(biāo)dna序列與相對發(fā)光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，當(dāng)檢測待測樣品時(shí)，將利用待測樣品得到的相對發(fā)光值代入到標(biāo)準(zhǔn)曲線中，即得到待測樣品中的目標(biāo)dna序列的濃度。

在一種實(shí)施方式中，所述目標(biāo)dna序列為cctttgacaactctagagatagagccttc(如seqidno:1所示)。

在一種實(shí)施方式中，所述金黃色葡萄球菌是來源于食品中的金黃色葡萄球菌。

在一種實(shí)施方式中，所述含目標(biāo)dna序列的待測液，是提取食品中的金黃色葡萄球菌基因組得到的。

在一種實(shí)施方式中，所述捕獲探針的序列(如seqidno:2所示)為：biotin-ttttttgaaggctctatctct。

在一種實(shí)施方式中，所述信號探針的序列為(如seqidno:3所示)：agagttgtcaaaggttttttaggatcgtgtggtt。

在一種實(shí)施方式中，所述dna酶的序列為：tggctgagttttgggttgggcgggttgggt(如seqidno:5所示)。

在一種實(shí)施方式中，所述相應(yīng)包含dna酶互補(bǔ)序列的模板序列為(5’-3’)：accgactcaaaacccaacccgccctacccaaaacccaacccgccctacccaaacatacacacagca(如seqidno:4所示)。

在一種實(shí)施方式中，所述親和素修飾的磁納米粒子的制備方法是：使用戊二醛交聯(lián)法，將氨基化的磁納米粒子加入到戊二醛和pbs溶液中，混合均勻后室溫下避光反應(yīng)2h，用pbs緩沖液清洗3次后，再加入親和素溶液震蕩避光反應(yīng)6h，pbs緩沖液清洗3次，即獲得親和素修飾的磁納米粒子。

在一種實(shí)施方式中，所述步驟(3)的滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)包括連接反應(yīng)和rca過程；連接反應(yīng)具體是：加入滾環(huán)擴(kuò)增模板，孵育一段時(shí)間使模板兩端與信號探針中的引物序列互補(bǔ)配對，然后加入t4dna連接酶連接反應(yīng)一段時(shí)間使模板兩端連接成環(huán)，再使酶失活；rca過程具體是：加入phi29dna聚合酶進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)一段時(shí)間后，使酶失活。

在一種實(shí)施方式中，所述檢測的過程為：取滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物、hepes緩沖液和氯化血紅素混勻，室溫孵育1h來形成dna酶。在96孔板中加入h2o2母液、魯米諾母液、dna酶和反應(yīng)緩沖液，混和均勻，用多功能酶標(biāo)儀檢測相對發(fā)光值，根據(jù)相對發(fā)光值變化對金黃色葡萄球菌進(jìn)行定量檢測。

在一種實(shí)施方式中，所述磁納米粒子的濃度為0.8～1.2mg/ml。

在一種實(shí)施方式中，所述捕獲探針的的濃度為80～160nmol/l。

在一種實(shí)施方式中，所述連接反應(yīng)的時(shí)間為40～60min。

在一種實(shí)施方式中，所述rca過程中滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)的時(shí)間為40～60min。

在一種實(shí)施方式中，所述方法的具體步驟為：

(1)制備捕獲探針功能化的磁納米粒子

將氨基化磁納米粒子加入到戊二醛和pbs溶液中混勻，避光反應(yīng)，再加入親和素溶液避光反應(yīng)，獲得親和素修飾的磁納米粒子；再取合成的親和素修飾的磁納米粒子和捕獲探針混勻，室溫條件下孵育、清洗，獲得捕獲探針功能化的磁納米粒子；

(2)目標(biāo)dna序列與探針生成夾心結(jié)構(gòu)

取捕獲探針功能化的磁納米粒子，加入含目標(biāo)dna序列的待測液，室溫后孵，再加入信號探針，室溫孵育生成夾心結(jié)構(gòu)，清洗，加水補(bǔ)至10μl；

(3)滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)

在步驟(2)制備的混合液中加入12.5μl滾環(huán)擴(kuò)增模板，混勻后孵育，使模板兩端與信號探針中的引物序列互補(bǔ)配對，然后加入t4dna連接酶緩沖液和適量的t4dna連接酶，反應(yīng)一段時(shí)間，使模板兩端連接成環(huán)，再于一定條件下孵育使酶失活；清洗后，加入phi29dna聚合酶緩沖液、bsa、dntps、適量phi29dna聚合酶和超純水混勻后，一定條件下進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)一段時(shí)間，并于一定條件孵育使phi29dna聚合酶失活；

(4)滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物的化學(xué)發(fā)光檢測

取擴(kuò)增產(chǎn)物、hepes緩沖液、氯化血紅素母液和超純水混勻，室溫下孵育形成dna酶。在黑色96孔板中加入h2o2母液、魯米諾母液、dna酶和反應(yīng)緩沖液，混和均勻，用多功能酶標(biāo)儀檢測化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的相對發(fā)光值，根據(jù)相對發(fā)光值變化對金葡菌進(jìn)行定量檢測。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果：

(1)本發(fā)明利用夾心雜交原理和磁分離作用，探針修飾的磁納米粒子特異性識別和分離金黃色葡萄球菌的16srdna序列，提高了檢測的準(zhǔn)確性和特異性。

(2)本發(fā)明結(jié)合滾環(huán)擴(kuò)增信號放大作用和dna酶的催化作用，雙重放大，提高了檢測方法的靈敏度。

(3)對金黃色葡萄球菌的檢測限較低，達(dá)到4.2×10¹cfu/ml。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的金黃色葡萄球菌檢測原理示意圖。

圖2為sybrgreeni熒光驗(yàn)證dna序列雜交夾心原理圖。

圖3為不同濃度金黃色葡萄球菌與相對發(fā)光值的關(guān)系曲線。

圖4為tdna檢測的特異性分析。

圖5為金黃色葡萄球菌檢測的特異性分析。

具體實(shí)施方案

如圖1所示，為本發(fā)明的金黃色葡萄球菌檢測原理示意圖。

利用磁納米分離技術(shù)、滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)與dna酶技術(shù)，構(gòu)建了基于磁分離滾環(huán)擴(kuò)增合成dna酶檢測金葡菌。

本發(fā)明方法：設(shè)計(jì)兩條不同的dna探針和目標(biāo)dna(即tdna，如seqidno:1所示)可生成夾心結(jié)構(gòu)，其中probe1為捕獲探針(序列為：biotin-ttttttgaaggctctatctct，如seqidno:2所示)，可經(jīng)生物素-親和素的特異性作用修飾到磁納米粒子上來進(jìn)行分離；而probe2為信號探針(序列為：agagttgtcaaaggttttttaggatcgtgtggtt，如seqidno:3所示)，包含有引發(fā)rca的引物序列可與設(shè)計(jì)的線性rca模板(序列如seqidno:4所示)互補(bǔ)配對，然后開始rca反應(yīng)，產(chǎn)生與環(huán)狀模板互補(bǔ)的長單鏈擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合hemin形成dna酶(序列如seqidno:5所示)，可催化h2o2-魯米諾反應(yīng)系統(tǒng)發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。

如圖2所示，為本發(fā)明方法原理的驗(yàn)證。捕獲探針功能化的磁納米粒子probe1-mnps可用于捕獲tdna，然后再連接包含rca引物的probe2。在tdna的存在下，probe1和tdna間互補(bǔ)配對形成雙鏈結(jié)構(gòu)，可以使熒光染料sybrgreeni嵌入，并通過熒光分光光度計(jì)檢測到較強(qiáng)的熒光信號。相比之下，若沒有加入tdna則反應(yīng)體系中無雙鏈結(jié)構(gòu)形成，故加入熒光染料sybrgreeni后只能檢測到微弱的熒光信號。當(dāng)再加入probe2進(jìn)一步孵育后，形成probe1/tdna/probe2雙鏈夾心結(jié)構(gòu)，則加入熒光染料sybrgreeni后可檢測到更強(qiáng)的熒光信號，表明probe2成功連接到磁納米粒子上。此外，若加入完全錯(cuò)配的mdna4，則也沒有觀察到顯著的熒光信號，證明只有tdna存在下才能特異性形成夾心結(jié)構(gòu)。

此外，加入10nmol/ltdna的實(shí)驗(yàn)組與未加tdna的空白組經(jīng)rca反應(yīng)后經(jīng)多功能酶標(biāo)儀m5所檢測到的相對發(fā)光值，可以清楚看出，實(shí)驗(yàn)組的相對發(fā)光值遠(yuǎn)大于空白組，表明只有在tdna存在下，mnps才能修飾上雙鏈夾心結(jié)構(gòu)，并且probe2才能進(jìn)行后續(xù)的rca反應(yīng)，使得實(shí)驗(yàn)組生成大量的dna酶來催化h2o2-魯米諾反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生強(qiáng)烈的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。而當(dāng)不存在tdna情況下，probe2不能修飾到mnps上，無法進(jìn)行后續(xù)的rca反應(yīng)和dna酶生成，h2o2-魯米諾反應(yīng)系統(tǒng)在mnps的催化作用下進(jìn)行微弱的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，只能形成微弱的相對發(fā)光值。將實(shí)驗(yàn)組相對發(fā)光值減去空白組得到實(shí)際相對發(fā)光值，且后續(xù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)實(shí)際相對發(fā)光值和tdna濃度呈一定線性關(guān)系。由此進(jìn)一步表明，建立的雙鏈夾心結(jié)構(gòu)結(jié)合mnps分離技術(shù)的特異性強(qiáng)，并利用rca技術(shù)和dna酶技術(shù)來放大信號，可以用于金葡菌的快速檢測。

下面是對本發(fā)明進(jìn)行具體描述。

實(shí)施例1

(1)制備捕獲探針功能化的磁納米粒子

500μl氨基化磁納米粒子加入到150μ戊二醛和1350μlpbs溶液中混勻，避光反應(yīng)2h，用pbs緩沖液清洗3次，再加入500μl一定濃度的親和素震蕩避光反應(yīng)6h，pbs緩沖液清洗3次，獲得親和素修飾的磁納米粒子。再取240μl合成的親和素修飾的磁納米粒子和10μl捕獲探針混勻，室溫條件下孵育30min，用te緩沖液清洗3次后，獲得捕獲探針功能化的磁納米粒子。

(2)16srdna序列與探針生成夾心結(jié)構(gòu)

取30μl捕獲探針功能化的磁納米粒子，加入含16srdna序列(即含目標(biāo)dna)的待測液，室溫后孵育30min，用te緩沖液清洗3次，再加入3μl信號探針，室溫孵育30min生成夾心結(jié)構(gòu)，用te緩沖液清洗3次后，加超純水補(bǔ)至10μl。

(3)滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)

在上述制備的混合液中加入12.5μl滾環(huán)擴(kuò)增模板，混勻后在37℃條件下孵育30min，使模板兩端與信號探針中的引物序列互補(bǔ)配對，然后加入2.5μl10×t4dna連接酶緩沖液和適量的t4dna連接酶，37℃反應(yīng)1h，使模板兩端連接成環(huán)，再于65℃條件下孵育10min使酶失活。用te緩沖液清洗3次，加入5μl10×phi29dna聚合酶緩沖液、2μlbsa、2μldntps、適量phi29dna聚合酶和20.5μl超純水混勻后，30℃條件下進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)1h，并于65℃孵育10min使聚合酶失活。

(4)滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物的化學(xué)發(fā)光檢測

取50μl擴(kuò)增產(chǎn)物、100μlhepes緩沖液、0.2μl氯化血紅素母液和50μl超純水混勻，室溫下孵育1h形成dna酶，再將dna酶稀釋10²倍。在黑色96孔板中加入10μlh2o2母液、10μl魯米諾母液、10μldna酶和170μl反應(yīng)緩沖液，混和均勻，用多功能酶標(biāo)儀檢測化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的相對發(fā)光值，根據(jù)相對發(fā)光值變化對金黃色葡萄球菌進(jìn)行定量檢測。

(5)對金黃色葡萄球菌檢測的反應(yīng)條件優(yōu)化。優(yōu)化結(jié)果為：磁納米粒子濃度為1.0mg/ml，捕獲探針濃度為100nmol/l，擴(kuò)增時(shí)間為50min，連接時(shí)間為50min。

(6)金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)檢測曲線的建立。取500μl不同濃度的金黃色葡萄球菌菌懸液用煮沸法提取dna，再采用本方法進(jìn)行定量檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為：在最優(yōu)條件下，金黃色葡萄球菌濃度在5.5×10¹～5.5×10⁶cfu/ml范圍內(nèi)與相對發(fā)光值呈線性正相關(guān)(如圖3所示)，r²＝0.991，檢測限為4.2×10¹cfu/ml。

(7)人工污染實(shí)際樣品中金黃色葡萄球菌的檢測：將自來水、桶裝水和牛奶樣品經(jīng)過紫外照射殺菌后，把不同濃度的金黃色葡萄球菌菌懸液加入其中并混勻。取500μl各樣品用水煮法提取金黃色葡萄球菌的dna，再采用本方法進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中求得對應(yīng)的實(shí)際樣品中可被檢測到的金葡菌菌落數(shù)，同時(shí)將平板計(jì)數(shù)法作為對照試驗(yàn)進(jìn)行比較，檢測結(jié)果參見表1。從表1可以得出兩種方法所得的測定結(jié)果基本一致，表明構(gòu)建的檢測金葡菌的新方法可以應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測分析。

表1人工污染實(shí)際樣品中金黃色葡萄球菌的檢測結(jié)果

實(shí)施例2：目標(biāo)dna(tdna)的特異性分析

特異性是基于夾心雜交原理建立的，即探針與目標(biāo)序列之間特異性的互補(bǔ)配對作用。

在磁納米粒子濃度為1.0mg/ml，捕獲探針濃度為100nmol/l，擴(kuò)增時(shí)間為50min，連接時(shí)間為50mi的條件下，將等體積等濃度tdna(序列如seqidno:1所示)和堿基錯(cuò)配dna序列(mdna1、mdna2、mdna3和mdna4，與tdna相比，分別為一個(gè)堿基錯(cuò)配dna、兩個(gè)堿基錯(cuò)配dna、三個(gè)堿基錯(cuò)配dna、隨機(jī)序列dna；序列分別如seqidno:6～seqidno:9所示，)作為檢測對象，用于評價(jià)本實(shí)驗(yàn)的特異性。

如圖4所示，不同dna序列檢測得到不同的相對發(fā)光值，從中可看出tdna對應(yīng)的相對發(fā)光值明顯高于mdna1、mdna2、mdna3和mdna4。此外，根據(jù)圖4還可以推斷出，堿基錯(cuò)配的數(shù)目越多，檢測得到的相對發(fā)光值越低，其中隨機(jī)序列mdna4與空白對照結(jié)果相近。以上分析結(jié)果表明，堿基的錯(cuò)配會影響探針與tdna的互補(bǔ)配對作用，從而影響probe1-mnps捕獲tdna以及tdna與probe2的雜交作用，以及rca反應(yīng)的進(jìn)行和dna酶的生成，最終使得相對發(fā)光值的降低，從而可確保對tdna檢測的特異性。故推斷，基于序列如seqidno:1所示的tdna構(gòu)建的檢測方法具有較高的特異性。

實(shí)施例3：金黃色葡萄球菌的特異性分析

基于核酸探針與金葡菌16srdna特異性互補(bǔ)配對的原理。

使用金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌和痢疾志賀氏菌作為待測樣品，采用實(shí)施例1的方法對檢測效果進(jìn)行了考察和比較，并以te緩沖液為空白對照。

由圖5可以看出金葡菌的相對發(fā)光值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于沙門氏菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌和痢疾志賀氏菌，表明實(shí)施例1的方法對金葡菌具有良好的特異性。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。

序列表

<110>江南大學(xué)

<120>一種磁分離rca合成dna酶檢測金黃色葡萄球菌的方法

<160>9

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

cctttgacaactctagagatagagccttc29

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

ttttttgaaggctctatctct21

<210>3

<211>34

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

agagttgtcaaaggttttttaggatcgtgtggtt34

<210>4

<211>66

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

accgactcaaaacccaacccgccctacccaaaacccaacccgccctacccaaacatacac60

acagca66

<210>5

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

tggctgagttttgggttgggcgggttgggt30

<210>6

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

cctttgacaactttagagatagagccttc29

<210>7

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

cctttgacaactttagagatagatccttc29

<210>8

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

cctttaacaactttagagatagatccttc29

<210>9

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

ctactaatgctcctggattcatcacttca29