本發(fā)明屬于生物監(jiān)測技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用于表達熒光蛋白的無乳鏈球菌質(zhì)粒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

羅非魚(tilapia)作為淡水優(yōu)良養(yǎng)殖品種之一，在我國南方如廣東、廣西和海南等地區(qū)已大規(guī)模人工養(yǎng)殖，據(jù)農(nóng)業(yè)部漁業(yè)局統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，2015年我國羅非魚養(yǎng)殖產(chǎn)量約178萬t(2016年中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒)，總產(chǎn)量居全球第一位。然而，近年來鏈球菌病嚴(yán)重制約了我國羅非魚產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。自2009年起，我國多個地區(qū)的養(yǎng)殖羅非魚連年暴發(fā)鏈球菌病，其累積死亡率為30％～80％，而且90％以上的臨床菌株是無乳鏈球菌(streptococcusagalactiae)。無乳鏈球菌是魚類重要的病原菌，可感染多種經(jīng)濟魚類，如銀鯧(pampusargenteus)、金鯧(trachinotusblochii)、金頭鯛(sparusauratus)、胭脂魚(lizaklunzingeri)、尼羅羅非魚(oreochromisniloticus)、齊口裂腹魚(schizothoraxprenanti)、鞍帶石斑魚(epinepheluslanceolatus)和寶石鱸(scortumbarcoo)等，其中對羅非魚的危害尤為嚴(yán)重。迄今，世界多個國家和地區(qū)養(yǎng)殖的羅非魚均有感染無乳鏈球菌的相關(guān)報道，如中國、泰國、印度尼西亞、美國、巴西、洪都拉斯、哥倫比亞、哥斯達黎加和厄瓜多爾等。由于我國羅非魚養(yǎng)殖產(chǎn)量大，因此，鏈球菌病的危害也最為嚴(yán)重。我國南方地區(qū)羅非魚主養(yǎng)區(qū)每年均有大規(guī)模的鏈球菌病暴發(fā)，造成的經(jīng)濟損失高達數(shù)億元。

紅色熒光蛋白標(biāo)記的魚源無乳鏈球菌，對于無乳鏈球菌毒力相關(guān)基因、浸染過程、致病機制和病原菌與宿主相互作用等研究奠定了基礎(chǔ)。然而，目前，國內(nèi)外尚無魚源無乳鏈球菌紅色熒光蛋白標(biāo)記菌株的相關(guān)報道，并且也沒有可參考的高效表達紅色熒光蛋白標(biāo)記的魚源無乳鏈球菌的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決上述問題，本發(fā)明的目的之一在于提供了能夠在無乳鏈球菌中高效表達熒光蛋白的強啟動子preca以及用于表達熒光蛋白的無乳鏈球菌的質(zhì)粒。本發(fā)明的目的之二在于提供了用于表達熒光蛋白的無乳鏈球菌質(zhì)粒的構(gòu)建方法。本發(fā)明的目的之三在于提供了用于表達熒光蛋白的無乳鏈球菌質(zhì)粒的應(yīng)用。

本發(fā)明采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)上述技術(shù)問題：

用于表達熒光蛋白的無乳鏈球菌質(zhì)粒，所述載體為pbch-rm質(zhì)粒，所述pbch-rm質(zhì)粒的序列號為seqidno.1。

所述用于表達熒光蛋白的無乳鏈球菌質(zhì)粒的構(gòu)建方法具體步驟為：

(1)啟動子preca的制備：

以魚源無乳鏈球菌基因組為模板，引物為preca-f和preca-r，pcr擴增后通過凝膠電泳，回收目的片段即得啟動子preca片段；啟動子preca片段，序列號為seqidno.2。其中，

preca-f：

caggctagcggtatcggtttaacgggagttgctg

preca-r：

tcgctcacctaagcgcatcactg；

啟動子preca制備的反應(yīng)體系為：5×buffer10μl，dntps4μl，引物preca-f1μl，引物preca-r1μl，dna模板1μl，extaq酶1μl，補h2o至50μl。

(2)制備紅色熒光蛋白基因mcherry片段：

以pmcherry-c1質(zhì)粒(takara)為模板，引物：pmche-f和pmche-r；pcr擴增后通過凝膠電泳，回收目的片段即得紅色熒光蛋白基因mcherry片段；紅色熒光蛋白基因mcherry片段，序列號為seqidno.3。其中，

pmche-f：

agtgatgcgcttaggtgagcgaatggtgagcaagggcgaggaggatpmche-r：

gaagatctctacttgtacagctcgtccatg；

(3)啟動子preca與紅色熒光蛋白基因mcherry連接

將步驟(1)中回收的啟動子preca與步驟(2)中回收的紅色熒光蛋白基因mcherry片段按照1：1進行混合作為模板；通過引物preca和pmche-r進行overlappcr，得到preca-mcherry的pcr產(chǎn)物；啟動子preca與紅色熒光蛋白基因mcherry連接的的overlappcr反應(yīng)體系為：5×buffer10μl，dntps4μl，引物preca-f1μl，引物pmche-r1μl，preca模板1μl，mcherry模板1μl，extaq酶1μl，補h2o至50μl。

(4)pcr產(chǎn)物的酶切、連接、轉(zhuǎn)化和鑒定：

將步驟(3)中純化的pcr產(chǎn)物(preca-mcherry)與pbch載體分別進行nhei和bglii雙酶切，分別回收酶切產(chǎn)物；回收后的酶切產(chǎn)物通過t4dna連接酶進行連接。(preca-mcherry)與pbch載體進行連接的反應(yīng)體系：10×buffer2μl，啟動子preca5μl，紅色熒光蛋白基因mcherry5μl，t4連接酶0.5μl，補h2o至20μl。然后使用膠回收試劑盒純化連接產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化無乳鏈球菌感受態(tài)細胞，涂布四環(huán)素(tet)抗性平板，28℃培養(yǎng)2天，篩選有紅色熒光的菌落。根據(jù)pcr擴增及其產(chǎn)物測序、菌落熒光對陽性菌落進行鑒定，得到preca-mcherrypcr產(chǎn)物，序列號為seqidno.4

所述的用于表達熒光蛋白的無乳鏈球菌的質(zhì)粒應(yīng)用，將所述載體應(yīng)用于魚源中表達熒光蛋白無乳鏈球菌，特別是羅非魚和斑馬魚。

制備魚源無乳鏈球菌感受態(tài)細胞：挑取無乳鏈球菌單克隆至1ml無菌bhi液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)過夜，然后加入100ml無菌bhi液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)至od600＝0.6；離心收集菌體，去除上清液，加入20ml10％的無菌甘油，懸浮菌體；進一步離心收集菌體，去除上清液，再次加入20ml10％的無菌甘油，懸浮菌體；離心收集菌體，去上清，加入1ml10％的無菌甘油，懸浮菌體，取100μl菌懸液分裝至1.5ml無菌ep管中，保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

(1)紅色熒光蛋白(mcherryfluorescentprotein)能夠自身催化形成發(fā)色結(jié)構(gòu)并在激發(fā)光作用下發(fā)出紅色熒光。作為報告基因，mcherry是不需要外源底物或輔助因子，就能在活細胞中表達的發(fā)光蛋白，mcherry作為熒光標(biāo)記分子既具有敏感的標(biāo)記檢測率，又沒有放射性的危害，因此可實現(xiàn)在體內(nèi)實時檢測標(biāo)記菌株的情況，在菌體示蹤研究方面具有不可替代的作用。本發(fā)明通過巧妙的引物設(shè)計以及合理的選擇強啟動子，實現(xiàn)了重組質(zhì)粒pbch-rm質(zhì)粒的制備。

(2)本發(fā)明通過將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pbch-rm轉(zhuǎn)入到魚源無乳鏈球菌感受態(tài)細胞中，建立了紅色熒光標(biāo)記的魚源無乳鏈球菌強毒株，便于通過熒光顯微鏡觀察無乳鏈球菌侵染宿主的實時動態(tài)過程，該方法簡單、直觀、實時、可靠，為研究無乳鏈球菌與宿主的相互作用關(guān)系奠定了基礎(chǔ)，不僅能夠顯著的節(jié)約實驗周期，還能夠極大地降低實驗成本。

(3)本發(fā)明使用的無乳鏈球菌菌株是在患病羅非魚體內(nèi)分離出來的，對羅非魚和斑馬魚均具有強致病性。該熒光菌株的成功構(gòu)建有助于研究無乳鏈球菌在不同水生動物之間的水平傳播途徑，分析無乳鏈球菌在宿主體內(nèi)的動態(tài)變化過程以及致病機理，還可用于無乳鏈球菌在宿主體表和腸道入侵途徑與過程等方面的研究。同時以模式動物斑馬魚作為實驗動物，可進行該熒光菌株的感染實驗研究，為無乳鏈球菌感染宿主的致病機理奠定了基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1本發(fā)明實施例中pbch-rm質(zhì)粒圖譜。

圖2本發(fā)明實施例中顯微鏡下觀察的熒光菌株。

具體實施方式

以下所述是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也視為本發(fā)明的保護范圍。下列具體實施方式中如果未注明具體條件的實驗方法，通常按照本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的分子生物學(xué)的常規(guī)方法和條件，這種技術(shù)和條件在文獻中有完整解釋。

下面結(jié)合附圖及具體實施方式對本發(fā)明技術(shù)方案進行詳細描述；顯然，所描述的實施例是本發(fā)明的一部分，而不是全部。本實施方式中的羅非魚源無乳鏈球菌強毒株wc1535菌株和pbch載體均由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所使用并保存。

重組質(zhì)粒pbch-rm的構(gòu)建方法：

(1)啟動子的制備：

以無乳鏈球菌wc1535菌株的基因組dna為模板，以preca-f和preca-r作為上、下游引物，按照常規(guī)方法進行pcr擴增，pcr產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳后，使用凝膠回收試劑盒進行膠回收目的片段，經(jīng)過測序驗證，即可獲得啟動子preca片段，序列號詳見seqidno.2所示。pcr反應(yīng)體系見表1，pcr反應(yīng)條件見表2；

表1pcr擴增體系

表2pcr擴增程序

(2)制備mcherry片段：

以紅色熒光蛋白基因mcherry質(zhì)粒為模板，以pmche-f和pmche-r作為上、下游引物，按照常規(guī)方法進行pcr反應(yīng)，pcr產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳后，使用凝膠回收試劑盒進行膠回收目的片段，經(jīng)過測序驗證，即可獲得啟動子preca片段，序列號詳見seqidno.3所示。pcr反應(yīng)體系見表1，pcr反應(yīng)條件見表2；

(3)啟動子preca與mcherry連接

在引物設(shè)計時，引物pmche-f的上游22個堿基與preca-r引物的部分序列反向互補，因此，這樣設(shè)計有助于啟動子preca與紅色熒光蛋白基因mcherry通過overlappcr反應(yīng)進行連接。以膠回收產(chǎn)物preca和mcherry片段進行1：1混合后作為模板，通過引物preca和pmche-r進行overlappcr。連接物序列號詳見seqidno.4所示。pcr反應(yīng)體系同表1，pcr反應(yīng)條件見表3。

表3pcr擴增程序

(4)pcr產(chǎn)物的連接、純化、轉(zhuǎn)化與鑒定

將步驟(3)純化的pcr產(chǎn)物與pbch載體進行分別進行nhei和bglii雙酶切，并分別回收酶切產(chǎn)物。將酶切產(chǎn)物進行16℃連接過夜。連接體系見表4。通過膠回收試劑盒對連接產(chǎn)物進行回收，并使用雙蒸水洗脫連接產(chǎn)物?；厥盏倪B接產(chǎn)物加入無乳鏈球菌感受態(tài)細胞中，輕輕混勻后加入預(yù)冷的電擊杯中，靜置15min后進行電轉(zhuǎn)(參數(shù)：2300v，200ω，25μf)。立即加入無菌的bhi(腦心浸液培養(yǎng)基)1ml，懸浮菌體，轉(zhuǎn)入至無菌的ep管中，28℃搖床培養(yǎng)3h(180r/min)。收集菌體，涂布于含有四環(huán)素抗性的bhi平板，28℃靜置培養(yǎng)觀察菌落，有紅色熒光的菌落即為陽性，經(jīng)過pcr驗證并進行測序鑒定。通過上述方法構(gòu)建得到的重組質(zhì)粒pbch-rm，其序列為seqidno.1所示，其圖譜如圖1所示。

表4連接體系

(5)熒光菌株觀察

構(gòu)建好的熒光菌株用無菌水稀釋后涂到載玻片上，使用熒光顯微鏡，在40×10的放大倍數(shù)下觀察，能夠觀察到高效表達紅色熒光蛋白的菌體，如圖2所示。穩(wěn)定性試驗表明，紅色熒光菌株傳至30代，其紅色熒光仍能夠穩(wěn)定高效表達，而且質(zhì)粒穩(wěn)定率可達100％。紅色熒光無乳鏈球菌人工腹腔注射感染健康羅非魚，其半數(shù)致死劑量為ld50＝6.2×10⁷cfu/ml，該熒光菌株與野生株相比，它們對羅非魚的半數(shù)致死劑量無顯著性差異(p>0.5)。而且，從感染后的羅非魚體內(nèi)可以觀察到并且能夠分離到紅色熒光無乳鏈球菌。

序列表

申請人：中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所

發(fā)明名稱：用于表達熒光蛋白的無乳鏈球菌質(zhì)粒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

seqidno.1pbch-rm質(zhì)粒的序列：

1gatccgaattcggatctaaagagtaatttaatagagtgaggtgaattttggaatttataa

61gatttgccttactcattttttgttgtgagcttgacaattctccacttttatggtataata

121agcttaaggaggtaggctagcggtatcggtttaacgggagttgctggtcctgatgagttg

181gaaggataccctgcaggtacagtttttattgggattgcaacccctgaaggcgtttcttct

241attaaagtatcgattggagggaagagccgctcagatgtccgtcatatcagtactttacat

301gcttttgacctggtgcgtagggctttattaaagatataatatttgttataattagtagaa

361cgatttctaaatttgaatcaacctagattcatagaaatataaggagaagacattggctaa

421aaaaacgaaaaaagcagaagaaattactaagaaattcggtgatgaacgtcgaaaagcctt

481agatgatgctttgaaaaatattgaaaaagattttggtaagggcgcagtgatgcgcttagg

541tgagcgaatggtgagcaagggcgaggaggataacatggccatcatcaaggagttcatgcg

601cttcaaggtgcacatggagggctccgtgaacggccacgagttcgagatcgagggcgaggg

661cgagggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggtggccc

721cctgcccttcgcctgggacatcctgtcccctcagttcatgtacggctccaaggcctacgt

781gaagcaccccgccgacatccccgactacttgaagctgtccttccccgagggcttcaagtg

841ggagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggcgtggtgaccgtgacccaggactcctccct

901gcaggacggcgagttcatctacaaggtgaagctgcgcggcaccaacttcccctccgacgg

961ccccgtaatgcagaagaagaccatgggctgggaggcctcctccgagcggatgtaccccga

1021ggacggcgccctgaagggcgagatcaagcagaggctgaagctgaaggacggcggccacta

1081cgacgctgaggtcaagaccacctacaaggccaagaagcccgtgcagctgcccggcgccta

1141caacgtcaacatcaagttggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggaaca

1201gtacgaacgcgccgagggccgccactccaccggcggcatggacgagctgtacaagtagag

1261atctagatctcaggaattgtcagataggcctaatgactggcttttataatatgagataat

1321gccgactgtactttttacagtcggttttctaatgtcactaacctgccccgttagttgaag

1381aaggtttttatattacagctccagatcctctagagtcgacctctgagagggcctcagagc

1441tatctaaagccgagggatatataaataccctagaaaatcattcgaagagcttagaagcga

1501aaatagagtgtttagagagtgataatctacaattggaaaaacaaaaggcgacaaaactcg

1561aagcgaaagcgttgaacgagagtgagttgcgagaactaaagcctaagaagaattttctag

1621gaaaagagcattatgagttaagtcctgaacaatttgaagggttgaaggcagaagtttatc

1681gtagtagaactctattgcaccacaaagatattgaactggagcaagcaaaacgtcaagtat

1741ctctgagagcctctaaaaactattttacagctagtttagagcgagctaaggaaaaagcta

1801aaggtgagagtatagaccgtcttaaaagcgaaataaagcgactaaaaaacgaaaattcaa

1861ttttacgtcagcaaaatgacaagatgctagggaaattaagagagttaatgcctgataaag

1921cctttaagaatttgttatcagaacttaaggcgattaagccaatcgtgaatataattaaaa

1981aggctattgaaaagagcttgttctgagcgatttatgccgtgaaagctatttgacaataag

2041cagtgacagagtacgctaggacgtgccgagccgaaaggctttagcgtttcggacggacac

2101ggacaaaggacggcagtcactggttacttgttgtcaaatagaccatgcatggaataaaaa

2161gcgtcaaaagtcttgagtggatgataccctatggtactctattcgccttttgactttttt

2221gctataatttaagtgtcgccagttcttccgtcaggtaatgcgaacttagactggaggtga

2281gcgttgtgaagacattcctcgagcttgtctttgtcccttttgtggttggcgttgctgcag

2341aagtagtcgctgattggctaattcagcgtatcaaagacaaaggcgaccaaaaatagcttg

2401agttcttttagaacaaaaaagaaagacagtagttgcacctactgtctttcttttgcgttg

2461tgcttttagttcctcgaacttttagcgtcaagcatattatatcatggggcgagaaattct

2521gtcaaaataatgctataatgcttttgaggcacctcagcgatacggtcggtggtgtgaatc

2581tcatttacgtagggcgactggaaacggatagctcaaagggcgcgtttgagtgtcgggtgt

2641gggactgccttcagcttcgggctgtaaagacccctgatacttttgaatgagatgaccctt

2701tggggtcttttttgtttttttagggagatgttgtgggggattttttctccgaaaaaatct

2761aaaatatgggggggctactacgaccccccctatagtgccgagtgccaaaatcaaaaaaaa

2821aacgcctttagccttagagctgcaagggtttgaggctcgtcaaatctcggcgacttttcg

2881gcgacttttcggcgactttttagagattttttgggaaaaatacgaaaaagattgcattga

2941gtgcacggttatgctactatagttttataaaattttgagaggtgacgcatgaaaaaaaga

3001ttgacgataacattaagtgaatcggtacttgaaaatcttgaaaaaatggcaagagagatg

3061gggttatcaaaatctgcaatgatttctgttgccttggaaaattacaagaaaggtcaagaa

3121aaataaaaaaagccgtgctggcaggcactggctaaagtcaaacatttcttgggtatatta

3181tactttatggctaaagaaaaagcaagatacttcacttttttactttatcctgaatcaatt

3241ccaagcgactgggagctgaaacttgaaacgcttggagtgccgatggcaattagtccattg

3301catgataaggataagagtagtatcaaaggacaaaaatataagaaagctcattatcatgtg

3361ctttatatagctaaaaatccagttactgcagatagtgtacgtaaaaagattaaattattg

3421cttggtgaaaaaagtcttgcaatggtgcaggttgttctcaatgtcgaaaatatgtatttg

3481tatttaacgcacgagagcaaggacgctattgctaagaagaaacatgtttatgataaggct

3541gatataaagctaatcaataattttgatattgaccgttatgtgacgttagatgtcgaggaa

3601aagaccgaacttttcaatgtggttgtatcgcttattcgtgcgtacactctccaaaatatt

3661tttgatttgtatgatttcattgacgaaaatggagaaacttatgggttgactataaatttg

3721gttaacgaagttattgcagggaaaactggttttatgaaattgttgtttgacggagcttat

3781caacgtagtaagcgtggaacaaagaacgaagagagataaaaagttgatctttgtgaaaac

3841tacagaaagtaaagaatgaaaagagtaatgctaacatagcattacggattttatgaccga

3901tgatgaagaaaagaatttgaaacttagtttatatgtggtaaaatgttttaatcaagttta

3961ggaggaattaattatgaagtgtaattaatgtaacagggttcaattaaaagagggaagcgt

4021atcattaaccctataaactacgtctgccctcattattggagggtgaaatgtgaatacatc

4081ctattcacaatcgaatttacgacacaaccaaattttaatttggctttgcattttatcttt

4141ttttagcgtattaaatgaaatggttttgaacgtctcattacctgatattgcaaatgattt

4201taataaaccacctgcgagtacaaactgggtgaacacagcctttatgttaaccttttccat

4261tggaacagctgtatatggaaagctatctgatcaattaggcatcaaaaggttactcctatt

4321tggaattataataaattgtttcgggtcggtaattgggtttgttggccattctttcttttc

4381cttacttattatggctcgttttattcaaggggctggtgcagctgcatttccagcactcgt

4441aatggttgtagttgcgcgctatattccaaaggaaaataggggtaaagcatttggtcttat

4501tggatcgatagtagctatgggagaaggagtcggtccagcgattggtggaatgatagccca

4561ttatattcattggtcctatcttctactcattcctatgataacaattatcactgttccgtt

4621tcttatgaaattattaaagaaagaagtaaggataaaaggtcattttgatatcaaaggaat

4681tatactaatgtctgtaggcattgtattttttatgttgtttacaacatcatatagcatttc

4741ttttcttatcgttagcgtgctgtcattcctgatatttgtaaaacatatcaggaaagtaac

4801agatccttttgttgatcccggattagggaaaaatataccttttatgattggagttctttg

4861tgggggaattatatttggaacagtagcagggtttgtctctatggttccttatatgatgaa

4921agatgttcaccagctaagtactgccgaaatcggaagtgtaattattttccctggaacaat

4981gagtgtcattattttcggctacattggtgggatacttgttgatagaagaggtcctttata

5041cgtgttaaacatcggagttacatttctttctgttagctttttaactgcttcctttctttt

5101agaaacaacatcatggttcatgacaattataatcgtatttgttttaggtgggctttcgtt

5161caccaaaacagttatatcaacaattgtttcaagtagcttgaaacagcaggaagctggtgc

5221tggaatgagtttgcttaactttaccagctttttatcagagggaacaggtattgcaattgt

5281aggtggtttattatccatacccttacttgatcaaaggttgttacctatggaagttgatca

5341gtcaacttatctgtatagtaatttgttattacttttttcaggaatcattgtcattagttg

5401gctggttaccttgaatgtatataaacattctcaaagggatttctaaatcgttaagggatc

5461aactttgggagagagttcaaaattgatcctttttttataacaggaattcg

seqidno.2啟動子preca片段：

1ggtatcggtttaacgggagttgctggtcctgatgagttggaaggataccctgcaggtaca

61gtttttattgggattgcaacccctgaaggcgtttcttctattaaagtatcgattggagga

121aagagccgctcagatgtccgtcatatcagtactttacatgcttttgacttggtgcgtagg

181gctttattaaagatataatatttgttataattagtagaacgatttctaaatttgaatcaa

241cctagattcatagaaatataaggagaagacattggctaaaaaaacgaaaaaagcagaaga

301aattactaagaaattcggtgatgaacgtcgaaaagccttagatgatgctttgaaaaatat

361tgaaaaagattttggtaagggcgcagtgatgcgcttaggtgagcga

seqidno.3紅色熒光蛋白基因mcherry片段：

1atggtgagcaagggcgaggaggataacatggccatcatcaaggagttcatgcgcttcaag

61gtgcacatggagggctccgtgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggc

121cgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggtggccccctgccc

181ttcgcctgggacatcctgtcccctcagttcatgtacggctccaaggcctacgtgaagcac

241cccgccgacatccccgactacttgaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgc

301gtgatgaacttcgaggacggcggcgtggtgaccgtgacccaggactcctccctgcaggac

361ggcgagttcatctacaaggtgaagctgcgcggcaccaacttcccctccgacggccccgta

421atgcagaagaagaccatgggctgggaggcctcctccgagcggatgtaccccgaggacggc

481gccctgaagggcgagatcaagcagaggctgaagctgaaggacggcggccactacgacgct

541gaggtcaagaccacctacaaggccaagaagcccgtgcagctgcccggcgcctacaacgtc

601aacatcaagttggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgaa

661cgcgccgagggccgccactccaccggcggcatggacgagctgtacaagtag

序列號為seqidno.4preca-mcherrypcr產(chǎn)物：

1ggtatcggtttaacgggagttgctggtcctgatgagttggaaggataccctgcaggtaca

61gtttttattgggattgcaacccctgaaggcgtttcttctattaaagtatcgattggaggg

121aagagccgctcagatgtccgtcatatcagtactttacatgcttttgacctggtgcgtagg

181gctttattaaagatataatatttgttataattagtagaacgatttctaaatttgaatcaa

241cctagattcatagaaatataaggagaagacattggctaaaaaaacgaaaaaagcagaaga

301aattactaagaaattcggtgatgaacgtcgaaaagccttagatgatgctttgaaaaatat

361tgaaaaagattttggtaagggcgcagtgatgcgcttaggtgagcgaatggtgagcaaggg

421cgaggaggataacatggccatcatcaaggagttcatgcgcttcaaggtgcacatggaggg

481ctccgtgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgaggg

541cacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggtggccccctgcccttcgcctgggacat

601cctgtcccctcagttcatgtacggctccaaggcctacgtgaagcaccccgccgacatccc

661cgactacttgaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcga

721ggacggcggcgtggtgaccgtgacccaggactcctccctgcaggacggcgagttcatcta

781caaggtgaagctgcgcggcaccaacttcccctccgacggccccgtaatgcagaagaagac

841catgggctgggaggcctcctccgagcggatgtaccccgaggacggcgccctgaagggcga

901gatcaagcagaggctgaagctgaaggacggcggccactacgacgctgaggtcaagaccac

961ctacaaggccaagaagcccgtgcagctgcccggcgcctacaacgtcaacatcaagttgga

1021catcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgaacgcgccgagggccg

1081ccactccaccggcggcatggacgagctgtacaagtag